正交實驗優化草果果膠的提取工藝

謝 欣,李麗媛,李 童,陳小妮,黃鎖義

(1.右江民族醫學院基礎醫學院,廣西 百色 533000;2.右江民族醫學院藥學院,廣西 百色 533000;3.右江民族醫學院 廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室,廣西 百色 533000)

草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)為姜科、豆蔻屬多年生草本植物,主要分布于我國西南部等地區。草果是藥食兩用中藥材大宗品種之一,草果全株可提取芳香油,用作調味香料;草果果實入藥,具有燥濕除寒、祛痰截瘧、健脾開胃、利水消腫等功能,還能解酒毒,清新口氣[1-2]。研究發現,草果含有糖類、蛋白質、氨基酸、酚類、鞣質、有機酸等多種化學成分,其主要有效成分是揮發油,揮發油中含有α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉油素、香葉醇、對-聚傘花素等成分。其中α-蒎烯、β-蒎烯具有鎮咳祛痰作用,β-蒎烯還有較強的抗炎、抗真菌作用;1,8-桉油素有解熱鎮痛、平喘等作用;大鼠口服香葉醇能調節胃腸運動,小量口服有輕度利尿作用[3-5]。草果果膠是一種天然高分子化合物,在食品方面,果膠可以作為增稠劑、膠凝劑、穩定劑、懸浮劑、乳化劑等;在醫藥保健品方面,果膠可以降低血糖、血脂及膽固醇,疏通血管;果膠也可以用于化妝品,對保護皮膚、防止紫外線輻射都有一定的作用[6]。

目前,果膠的提取方法主要有酸水解乙醇沉淀法、酸水解酶法、亞臨界水萃取法、離子樹脂交換法、超聲波提取法、微生物法等[7-9]。其中酸水解乙醇沉淀法技術成熟,提取過程簡單易控制,安全性高,成本低,適用范圍廣。在此,作者采用傳統的酸水解乙醇沉淀法提取草果果膠,以草果果膠得率為評價指標,在單因素實驗的基礎上,通過L9(34)正交實驗優化草果果膠的提取工藝,為草果藥用資源的進一步合理開發和綜合利用提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

草果購自廣西玉林市,經右江民族醫學院民族醫藥教研室覃道光副教授鑒定為姜科、豆蔻屬多年生草本植物草果(AmomumtsaokoCrevost et Lemarie)的干燥果實。

D-半乳糖醛酸(≥97%)、咔唑(分析純),上海麥克林生物制藥有限公司;檸檬酸、鹽酸、硫酸,分析純,西隴化工股份有限公司。

FA1204B型電子天平,上海天美天平儀器有限公司;N4S型紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;DNA Speed Vacs型真空濃縮儀,北京恒智泉科技有限公司;XL-60C型中藥材粉碎機,廣州旭朗機械設備有限公司。

1.2 D-半乳糖醛酸標準曲線的繪制

精密稱取6.00 mg D-半乳糖醛酸標準品置于100 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解并定容至刻度,制成0.06 mg·mL-1D-半乳糖醛酸標準溶液;分別精密量取D-半乳糖醛酸標準溶液0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL于試管中,于冰水中沿管壁緩慢加入3 μL濃硫酸,搖勻,于沸水浴中加熱25 min后,于冰水中迅速冷卻至室溫;再分別加入100 μL 0.15%咔唑乙醇溶液,搖勻,用蒸餾水稀釋至500 μL,靜置1 h,即得濃度(μg·mL-1)分別為0、6、12、18、24、30的D-半乳糖醛酸標準溶液。采用紫外可見分光光度法測定530 nm處吸光度,以D-半乳糖醛酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線(圖1)。

圖1 D-半乳糖醛酸的標準曲線Fig.1 Standard curve of D-galacturonic acid

1.3 草果果膠的提取

草果用蒸餾水浸泡2 h,置于沸水浴中滅酶10 min,用蒸餾水漂洗至漂洗液無色,濾干,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重,于粉碎機中粉碎,過60目篩,即得草果粉末,密封保存,備用。

稱取干燥草果粉末30.00 g置于燒杯中,加入一定量的蒸餾水,攪拌,用酸調節溶液的pH值,超聲(功率200 W、頻率50 kHz)處理30 min,采用熱回流法提取;提取液趁熱用干燥的紗布折疊過濾,收集濾液,冷卻至室溫后,濾液中加入活性炭(提取液質量的1%),80 ℃水浴脫色并不斷攪拌20 min;抽濾,濾液蒸發濃縮至原體積的一半,靜置冷卻至室溫;加入1.5倍體積的無水乙醇并不斷攪拌,室溫下靜置1 h,抽濾,沉淀用95%乙醇洗滌后,冷凍干燥至恒重,即得草果果膠。

1.4 草果果膠得率的計算

精密稱取干燥草果果膠5.00 mg置于燒杯中,加適量蒸餾水溶解后,轉移至100 mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,混勻;取一定量的草果果膠樣品溶液適當稀釋后,按1.2方法測定530 nm處吸光度。按下式計算草果果膠得率：

式中：c為依據標準曲線方程得到的果膠濃度,μg·mL-1;V為待測溶液體積,mL;n為稀釋倍數;m為草果粉末質量,g。

1.5 草果果膠提取工藝的優化

采用單因素實驗分別考察提取溶劑、pH值、提取溫度、提取時間、料液比對草果果膠得率的影響;在單因素實驗的基礎上,篩選出pH值(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、料液比(D)為考察因素,通過L9(34)正交實驗進一步優化草果果膠的提取工藝。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果(圖2)

圖2 提取溶劑(a)、料液比(b)、pH值(c)、提取溫度(d)及提取時間(e)對草果果膠得率的影響

由圖2a可知,以鹽酸為提取溶劑時,草果果膠得率最高,為5.46%。因此,選擇鹽酸作為提取溶劑進行后續實驗。

由圖2b可知,料液比對草果果膠得率的影響較大,隨著料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,果膠得率先升高后降低,當料液比為1∶30(g∶mL,下同)時,果膠得率最高。因此,料液比以1∶30為宜。

由圖2c可知,隨著pH值的增大,草果果膠得率先升高后降低,當pH值為3.0時,果膠得率最高。因此,pH值以3.0為宜。

由圖2d可知,隨著提取溫度的升高,草果果膠得率逐漸升高,當提取溫度超過90 ℃后,果膠得率升幅趨緩;當提取溫度為90 ℃、100 ℃時,果膠得率相差不明顯,考慮到節能、成本等因素,提取溫度以90 ℃為宜。

由圖2e可知,隨著提取時間的延長,草果果膠得率先升高后降低,當提取時間為120 min時,果膠得率最高。因此,提取時間以120 min為宜。

2.2 正交實驗結果

正交實驗的因素與水平見表1,正交實驗結果見表2。

表1 正交實驗的因素與水平

表2 正交實驗結果

由極差R可知,各因素對草果果膠得率影響的大小順序為：pH值(A)>料液比(D)>提取時間(C)>提取溫度(B),最佳提取方案為A2B2C3D2,即pH值3.0、提取溫度90 ℃、提取時間150 min、料液比1∶30。

2.3 工藝驗證

在上述最佳提取工藝條件下進行6次平行驗證實驗,測得草果果膠得率分別為7.56%、7.62%、7.46%、7.52%、7.43%、7.64%,平均果膠得率為7.54%,RSD值為1.127%。表明優化的提取工藝重復性良好,具有一定的可行性。

3 結論

采用傳統的酸水解乙醇沉淀法提取草果果膠,以草果果膠得率為評價指標,在單因素實驗的基礎上,采用L9(34)正交實驗優化了草果果膠的提取工藝。結果表明,以鹽酸為提取溶劑時草果果膠得率最高,控制提取液的pH值是提高草果果膠質量的關鍵因素;各因素對草果果膠得率影響的大小順序為：pH值>料液比>提取時間>提取溫度;最佳提取工藝為：pH值3.0、提取溫度90 ℃、提取時間150 min、料液比1∶30(g∶mL),在此條件下,果膠得率為7.54%。為進一步深入開發草果資源提供了科學依據。