銀杏葉總黃酮綠色提取工藝及抗氧化活性研究

付佳樂,耿 直,郭亞敏,陽京津

(陜西國際商貿學院醫藥學院,陜西 西安 712046)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬植物,含有豐富的黃酮類、萜內酯類、多糖類等活性成分,具有抗菌、消炎等功效,是生產生物農藥的良好原料,可用于食品、醫藥、生物農藥等領域。近年來,醫學研究證明,銀杏中的有效成分達200余種,其中具有藥用價值且可提取成分達160余種[1-3]。

活性成分的提取常采用乙醇提取法,該方法雖操作簡單,但乙醇具有揮發性會危害人體健康,安全性較低,且需多次提取,操作繁瑣。隨著綠色化學的興起和發展,低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DESs)為活性成分的提取提供了新思路。該溶劑是由Abbott等提出并合成[4],具有成本低、操作簡單、可降解、綠色安全等優勢,引起了研究者的廣泛重視[5-9]。

在此,作者采用DESs對銀杏葉總黃酮進行提取,采用單因素實驗和響應面法對其提取工藝進行優化,并對其抗氧化活性進行綜合評價,以期為銀杏葉資源的開發利用提供借鑒,同時為其它植物中黃酮成分的提取提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

銀杏葉(綠色未黃),采自陜西國際商貿學院校園內,洗凈,晾干,烘干,粉碎,過80目篩。

蘆丁對照品(≥98%,批號YO6J8S37439)、氯化膽堿等。

TU-80型紫外可見分光光度計,上海精密科學儀器公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;tdl-40b型離心機,上海安亭科學儀器廠。

1.2 DESs的制備

參照文獻[6-9],選擇氯化膽堿作為氫鍵受體(HBA)、多元醇或酸作為氫鍵供體(HBD),如尿素、葡萄糖、檸檬酸、甘油、乳酸、草酸、丙二醇,按一定的物質的量比將HBA、HBD置于70 ℃磁力攪拌器中,攪拌至液體均相、無色透明,即得DESs。

1.3 銀杏葉總黃酮的提取

精密稱取0.3 g銀杏葉粉末,加入一定體積的DESs,一定溫度下磁力攪拌一定時間后,5 000 r·min-1離心30 min,傾出上清液,加入同種類的DESs定容至一定體積,即得銀杏葉總黃酮提取液。

1.4 銀杏葉總黃酮提取率的測定

制備22.2 mg·mL-1的蘆丁標準溶液,參照文獻[6]方法繪制蘆丁標準曲線,擬合得線性回歸方程：y=8.69369x+0.0238(R2=0.99728)。精密移取一定量銀杏葉總黃酮提取液置于25 mL容量瓶中,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定總黃酮含量,按下式計算總黃酮提取率(%)：

式中：c為樣品中總黃酮含量,mg·mL-1;V為樣品溶液體積,mL;m為銀杏葉粉末質量,g。

1.5 銀杏葉總黃酮提取工藝的優化

參考文獻[6-9]方法,首先篩選DESs種類(氯化膽堿-尿素、氯化膽堿-葡萄糖、氯化膽堿-檸檬酸、氯化膽堿-甘油、氯化膽堿-乳酸、氯化膽堿-草酸、氯化膽堿-丙二醇),在確定DESs種類的基礎上,考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1,mL∶g,下同)、提取溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、n(氯化膽堿)∶n(尿素)(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)、DESs含水量(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)、提取時間(15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min)對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

在單因素實驗的基礎上,選擇對銀杏葉總黃酮提取率影響較顯著的液料比(A)、提取溫度(B)、n(氯化膽堿)∶n(尿素)(C)為考察因素,以總黃酮提取率為評價指標,進行響應面實驗,每組實驗重復3次,進一步優化銀杏葉總黃酮的提取工藝。

1.6 銀杏葉總黃酮的抗氧化活性研究

1.7 統計分析

采用Design Expert 13軟件對響應面實驗結果進行顯著性統計和分析。采用Origin 2021對單因素和抗氧化活性實驗結果進行數據統計分析及制圖。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 DESs種類對銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖1)

圖1 DESs種類對銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of DESs type on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖1可知,以氯化膽堿-尿素為DESs時,銀杏葉總黃酮提取率最高,為1.04%。分析發現,氯化膽堿是一種有序的陰陽離子,與2個中性尿素分子發生氫鍵反應后,氯化膽堿陰陽離子間的相互作用減小、有序結構發生紊亂,從而有利于對總黃酮的提取;此外,氯化膽堿-尿素組成的DESs體系黏度小、流動性好,有利于總黃酮的傳遞和提取。因此,選擇氯化膽堿-尿素為DESs進行后續研究。

2.1.2 液料比對銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖2)

圖2 液料比對銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖2可知,當液料比為30∶1時,銀杏葉總黃酮提取率最高,為1.19%。這是因為,DESs用量增加,增大了溶劑與銀杏葉粉末的接觸面積,加速了溶劑與提取物間傳質過程,細胞內外濃度差增大,有利于總黃酮的溶出;但是當液料比達到30∶1后,提取過程趨于飽和,總黃酮成分幾乎被完全提取,繼續增加DESs用量,提取率不再升高。因此,選擇30∶1作為響應面實驗液料比的中心點。

2.1.3 提取溫度對銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖3)

圖3 提取溫度對銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖3可知,當提取溫度(20 ℃)接近常溫時,銀杏葉總黃酮提取率較低,可能與DESs在常溫下具有較高的黏度有關;隨著提取溫度升高,DESs的黏度降低,流動性顯著增強,擴散速度加快,細胞內外物質交換能力提高,目標成分的溶解度增大亦有利于其滲透溶解在溶劑中,當提取溫度為50 ℃時,總黃酮提取率為0.917%;當提取溫度升至70 ℃時,總黃酮提取率最高,為0.978%;繼續升高提取溫度,總黃酮提取率下降,這是因為,提取溫度過高會導致分子運動速度過快,DESs分子間氫鍵穩定性降低,溶液極性下降,導致總黃酮提取率下降。由于提取溫度為50 ℃、70 ℃時,總黃酮提取率相差不大,總黃酮提取率在50～70 ℃范圍內的變化機制尚不清楚,綜合考慮能耗、成本等因素,選擇60 ℃作為響應面實驗提取溫度的中心點。

2.1.4n(氯化膽堿)∶n(尿素)對銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖4)

圖4 n(氯化膽堿)∶n(尿素)對銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of n(choline chloride)∶n(urea) on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖4可知,當n(氯化膽堿)∶n(尿素)為1∶2時,銀杏葉總黃酮提取率最高,為1.16%。可能是因為,n(氯化膽堿)∶n(尿素)不同,制備的DESs的黏度不同,溶劑所產生的氫鍵數目、位置也有所不同,與銀杏葉總黃酮成分的結合程度不同。因此,選擇1∶2作為響應面實驗n(氯化膽堿)∶n(尿素)的中心點。

2.1.5 DESs含水量對銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖5)

圖5 DESs含水量對銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of water content of DESs on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖5可知,當DESs含水量為40%時,銀杏葉總黃酮提取率最高,為0.8%;繼續增加DESs含水量,總黃酮提取率下降。這是由于,DESs黏度高,傳質過程較慢,隨著含水量增加,DESs黏度降低,溶劑移動速度加快,從而加速了植物細胞內外溶劑的滲透過程;此外,含水量增加會改變溶劑極性,溶劑極性與目標成分總黃酮極性不吻合會影響總黃酮提取率;但含水量過多也可能沖斷DESs體系中HBA與HBD之間形成的氫鍵。因此,選擇DESs含水量為40%。

2.1.6 提取時間對銀杏葉總黃酮提取率的影響(圖6)

圖6 提取時間對銀杏葉總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖6可知,隨著提取時間的延長,銀杏葉總黃酮提取率逐漸升高,當提取時間為60 min時,總黃酮提取率最高,達到1.16%;繼續延長提取時間,總黃酮提取率下降,可能是由于,提取時間過長,黃酮成分發生分解,不利于提取。因此,選擇提取時間為60 min。

2.2 響應面實驗結果

響應面實驗的因素與水平見表1,設計及結果見表2。

表1 響應面實驗的因素與水平

表2 響應面實驗設計及結果

通過Design Expert 13軟件進行多元擬合,得到回歸方程：Y=1.16-0.058A+0.1008B+0.0268C-0.1903AB-0.0443AC+0.0262BC-0.2702A2-0.1187B2-0.1497C2。

對該模型進行方差分析,結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析

2.3 響應面分析

各因素交互作用對銀杏葉總黃酮提取率影響的響應面圖和等高線圖見圖7。

圖7 各因素交互作用對銀杏葉總黃酮提取率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plots and contour plots for effect of interation between variour factors on extraction rate of total flavonoids from Ginkgo biloba leaves

由圖7可知,隨著提取溫度的升高,銀杏葉總黃酮提取率升高;隨著液料比的增大,總黃酮提取率先升高后降低。相較于液料比、n(氯化膽堿)∶n(尿素),提取溫度的響應曲面更為陡峭,等高線具有明顯的密集趨勢,說明提取溫度對總黃酮提取率的影響更為顯著。此外,液料比與提取溫度的交互作用對總黃酮提取率的影響顯著。

2.4 驗證實驗

利用擬合模型對銀杏葉總黃酮的提取工藝進行優化,得到最優提取工藝為：液料比29.355∶1、提取溫度57.399 ℃、n(氯化膽堿)∶n(尿素)為1∶1.603、DESs含水量40%、提取時間60 min,銀杏葉總黃酮提取率的預測值為1.089%。考慮到實際操作,最優提取工藝調整為：液料比30∶1、提取溫度57 ℃、n(氯化膽堿)∶n(尿素)為1∶1.6、DESs含水量40%、提取時間60 min,在此條件下進行3次驗證實驗,得到銀杏葉總黃酮提取率為1.062%,高于李新舟等[15]采用乙醇回流法(0.918%)和微波輔助法(0.910%)得到的銀杏葉總黃酮提取率。

2.5 抗氧化活性實驗結果(表4)

表4 銀杏葉總黃酮的抗氧化活性

3 結論