CTAB 反膠束體系中脂肪酶催化合成山梨酸乙酯的研究

唐 功

(阿壩師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,四川 阿壩藏族羌族自治州 623002)

山梨酸乙酯是山梨酸系列產(chǎn)品的一種,其對霉菌、細(xì)菌有滅活作用[1],可用于解決山梨酸解決不了的微生物高度污染的環(huán)境消毒及防腐問題。湯健[2]報道了一種制備山梨酸乙酯原液的仿自然衍生法,山梨酸乙酯得率為85%。鄧?yán)^勇等[3]以氯化亞錫水合物為催化劑,催化山梨酸合成了山梨酸乙酯,但山梨酸乙酯的分離步驟較復(fù)雜。上述合成山梨酸乙酯的化學(xué)法,存在反應(yīng)條件較苛刻、副反應(yīng)多和產(chǎn)物分離復(fù)雜等缺點(diǎn)。目前,關(guān)于反膠束體系及脂肪酶促催化反應(yīng)合成日化產(chǎn)品的研究較廣泛[4-5]。脂肪酶具有界面活化現(xiàn)象,在反膠束體系中其催化活性既與酶和底物有關(guān),也受反應(yīng)介質(zhì)影響[6]。曾家豫等[7]在陰離子 AOT 反膠束體系中利用脂肪酶催化合成了乙酸薄荷酯。目前關(guān)于在陽離子十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)反膠束體系中的酶促催化合成反應(yīng)的研究較少。鑒于此,作者在構(gòu)建的CTAB反膠束體系中,用脂肪酶催化山梨酸和乙醇合成山梨酸乙酯,采用單因素實(shí)驗(yàn)對合成條件進(jìn)行優(yōu)化,并通過 GC-MS對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

脂肪酶 (CRL,酶活700 U·mg-1),Sigma 公司;山梨酸(98%)、乙醇(99%)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB),高新區(qū)博鰲興旺實(shí)驗(yàn)器材經(jīng)營。

7980-5977B型GC-MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀,美國安捷倫公司;IS-RDS6 系列疊加式恒溫振蕩器,智祥(廣東)生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CTAB反膠束體系的構(gòu)建

稱取 0.364 4 g CTAB溶于 10 mL 正庚烷中,制成 0.05 mol·L-1的CTAB溶液,加入一定 pH 值的緩沖溶液,振蕩至CTAB全部溶解,溶液呈透明狀,即為CTAB反膠束體系。

1.2.2 山梨酸乙酯的合成

將一定量的脂肪酶加入CTAB反膠束體系中,并按物質(zhì)的量比5∶1加入乙醇和山梨酸,置于恒溫?fù)u床上, 37 ℃、150 r·min-1反應(yīng)36 h,得到反應(yīng)液。

1.2.3 轉(zhuǎn)化率的測定[8]

采用酸堿滴定法分析反應(yīng)液中山梨酸的剩余量。移取2.0 mL反應(yīng)液加入25 mL錐形瓶中,滴加1滴酚酞指示劑,用0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液滴定,測定消耗的氫氧化鈉溶液體積(V1);移取2.0 mL未進(jìn)行酯化反應(yīng)的溶液,同法測定消耗的氫氧化鈉溶液體積(V0)。按下式計算酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率：

1.2.4 山梨酸乙酯的分離純化

將反應(yīng)液抽濾去除酶粉;再向?yàn)V液中加入一定濃度的碳酸氫鈉溶液,用分液漏斗過濾,取上層液,重復(fù)操作,去除未反應(yīng)的山梨酸和乙醇;采用硅油浴加熱蒸餾,使正庚烷(760 mmHg下沸點(diǎn)98.5 ℃)與目標(biāo)產(chǎn)物山梨酸乙酯(760 mmHg下沸點(diǎn)195.5 ℃)分離,得到山梨酸乙酯。

1.2.5 色譜條件

采用7980-5977B型GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀,色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);柱溫升溫程序：起始溫度60 ℃,保持 1 min;以20 ℃·min-1的速率升至220 ℃,保持 1 min;以10 ℃·min-1的速率升至280 ℃,保持3 min。進(jìn)樣口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,電子轟擊源(EI),掃描質(zhì)量范圍30～500 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 反膠束體系中含水量W0的選擇

固定CTAB 反膠束濃度為0.05 mol·L-1、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應(yīng)時間為36 h,考察反膠束體系中含水量W0(反膠束體系中水與表面活性劑CTAB的物質(zhì)的量比)對轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖 1。

由圖1可知,隨著反膠束體系中含水量W0的增加, 酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率先升高后降低;當(dāng)含水量W0為10時,轉(zhuǎn)化率最高,為90%。這是因?yàn)?當(dāng)含水量較少時,體系中自由水含量低,不能使脂肪酶處在活性構(gòu)象狀態(tài),導(dǎo)致酶活性不高,轉(zhuǎn)化率低;隨著含水量的增加,維持酶活性的水得到補(bǔ)充,酶活性升高,轉(zhuǎn)化率相應(yīng)升高;而當(dāng)含水量過多時,油水界面減小,一部分酶難與底物接觸,影響酶活力。因此,選擇反膠束體系中含水量W0為10。

圖1 反膠束體系中含水量W0對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of water content W0 in reverse micelle system on conversion rate

2.2 pH值的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應(yīng)時間為36 h,考察 pH 值對轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖 2。

由圖2可知,隨著pH值的增大,酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率先升高后降低;當(dāng)pH值為7.0時,轉(zhuǎn)化率最高,為89%。這是因?yàn)?酶分子結(jié)構(gòu)中含有許多酸、堿性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán), pH值影響側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài),或者直接影響酶與底物的結(jié)合[9],影響酶活性,從而影響轉(zhuǎn)化率;而中性條件下,側(cè)鏈基團(tuán)不會受到影響。因此,選擇pH值為7.0。

圖2 pH值對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of pH value on conversion rate

圖3 山梨酸濃度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of sorbic acid concentration on conversion rate

圖4 n(乙醇)∶n(山梨酸)對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of n(ethanol)∶n(sorbic acid) on conversion rate

2.3 山梨酸濃度的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應(yīng)時間為36 h,考察山梨酸濃度對轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖 3。

由圖 3 可知,當(dāng)山梨酸濃度為 0.5 mol·L-1時,酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高,為 91%。因此,選擇山梨酸濃度為 0.5 mol·L-1。

2.4 n(乙醇)∶n(山梨酸)的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應(yīng)時間為36 h,考察n(乙醇)∶n(山梨酸)對轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖 4。

由圖 4可知,隨著n(乙醇)∶n(山梨酸)的增大,酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率先升高后降低,當(dāng)n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1時,轉(zhuǎn)化率最高,為 94%。這是因?yàn)?體系中山梨酸過多,可能破壞脂肪酶的構(gòu)象,使脂肪酶失活;體系中乙醇過多,可能對脂肪酶有抑制作用;另外,醇分子可通過其疏水性側(cè)鏈與脂肪酶活性中心周圍的非極性氨基酸相互作用,造成酶構(gòu)象的局部改變,不利于其與酸分子的結(jié)合。因此,選擇n(乙醇)∶n(山梨酸) 為 5∶1。

2.5 酶解溫度的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、反應(yīng)時間為36 h,考察酶解溫度對轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖5。

圖5 酶解溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on conversion rate

由圖 5 可知,隨著酶解溫度的升高,酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率先升高后降低,當(dāng)酶解溫度為37 ℃時,轉(zhuǎn)化率最高,為 93.6%。這是因?yàn)?酶解溫度過低,底物分子的熱能降低,活化分子比例減少,轉(zhuǎn)化率偏低;酶解溫度過高,酶結(jié)構(gòu)被破壞,酶活性降低,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率急劇下降。因此,選擇酶解溫度為37 ℃。

2.6 反應(yīng)時間的選擇

固定CTAB反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃,考察反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響,結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of reaction time on conversion rate

由圖 6可知,隨著反應(yīng)時間的延長,酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸升高,當(dāng)反應(yīng)時間為36 h時,轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.3%;繼續(xù)延長反應(yīng)時間,轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定。主要是由于,反應(yīng)時間過長,一方面酶活性逐漸下降,另一方面產(chǎn)物的抑制作用增強(qiáng)。因此,選擇反應(yīng)時間為36 h。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在上述最佳合成條件下重復(fù)進(jìn)行 3 組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率分別為95.4%、97.3%、96.2%,平均值為 96.3%,實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好。證明最佳合成條件可靠。

2.8 產(chǎn)物的GC-MS分析

對CTAB反膠束體系中脂肪酶催化合成的產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析,得到的GC-MS圖譜(圖7)與鄭建永等[10]采用有機(jī)相脂肪酶催化合成的山梨酸乙酯的GC-MS圖譜基本相符,其中m/z=140.1為山梨酸乙酯的分子離子峰,推測產(chǎn)物為山梨酸乙酯。

圖7 產(chǎn)物的GC-MS圖譜Fig.7 GC-MS spectrum of product

3 結(jié)論

在CTAB反膠束體系中,以山梨酸和乙醇為原料,經(jīng)脂肪酶催化合成了山梨酸乙酯,確定最佳合成條件如下：CTAB 反膠束濃度為0.05 mol·L-1、反膠束體系中含水量W0為10、pH 值為7.0、山梨酸濃度為0.5 mol·L-1、n(乙醇)∶n(山梨酸)為5∶1、脂肪酶加量為5 mg、酶解溫度為37 ℃、反應(yīng)時間為36 h,在此條件下,酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為 96.3%。該研究為山梨酸乙酯的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。