硒化天麻多糖的制備、結(jié)構(gòu)表征及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

溫啟華，陸逸昊，楊露芳，陳江旭，程永友，劉 瑩，許 粟，馬風(fēng)偉

（貴陽(yáng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550005）

天麻（Gastrodia elataBlume）為蘭科真菌營(yíng)養(yǎng)型多年生草本植物天麻的干燥塊莖，是我國(guó)一種傳統(tǒng)珍貴的中藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]。天麻主產(chǎn)于我國(guó)貴州、云南、湖北、陜西等地，在我國(guó)已有2000 多年的應(yīng)用歷史，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)等功效，主要用于治療頭痛、小兒驚風(fēng)、肢體麻木、癲癇等病癥[3]，同時(shí)還具有健腦、抗衰老等作用[4]。除了有藥用價(jià)值外，天麻還被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)列為藥食兩用資源植物[5]，因此天麻及其多糖在藥品、食品、保健品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。天麻多糖為天麻的活性成分之一，研究表明天麻多糖具有抗氧化[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、抗腫瘤[8]、神經(jīng)保護(hù)[9]、抑菌[10]等作用。

硒（Selenium，Se）是人體內(nèi)必需的微量元素，在抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等方面都發(fā)揮著重要的作用[11-13]。缺硒會(huì)導(dǎo)致人體生殖功能下降，免疫力低下，還會(huì)引起糖尿病、高血壓、心腦血管病等多種疾病，嚴(yán)重缺硒還可引起克山病和大骨節(jié)病[14]。我國(guó)是一個(gè)缺硒大國(guó)，約占國(guó)土面積的2/3 地區(qū)為缺硒地區(qū)，其中30%地區(qū)為嚴(yán)重缺硒地區(qū)，約7 億人生活在低硒地區(qū)[15]。有報(bào)道指出，我國(guó)居民硒平均攝入量只有44.4 μg/d[16]，遠(yuǎn)低于《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量第3 部分：微量元素（WT/T 578.3-2017）》中成人推薦硒的攝入量60 μg/d[17]。硒在人體內(nèi)無(wú)法合成，只能通過(guò)外源攝取，因此補(bǔ)硒劑越來(lái)越受到人們的關(guān)注。補(bǔ)硒劑主要有兩類(lèi)：一是無(wú)機(jī)硒，如亞硒酸鈉、硒酸鈉，但其毒性大，人體吸收利用率低[18]；二是有機(jī)硒，包括有機(jī)硒制劑、富硒地區(qū)出產(chǎn)的天然產(chǎn)品以及人工生物轉(zhuǎn)化的各種動(dòng)、植物和微生物產(chǎn)品。與無(wú)機(jī)硒相比，有機(jī)硒通常以硒蛋白或硒多糖等形式存在，具有生物活性高、毒性低、易被吸收等特點(diǎn)[19-20]。

目前除少數(shù)富硒區(qū)出產(chǎn)的個(gè)別產(chǎn)品中硒多糖含量較高外，大部分地區(qū)產(chǎn)品中硒多糖含量較低[21]，無(wú)法滿足人們補(bǔ)硒的需求。人工干預(yù)方法是提高硒多糖產(chǎn)量的便捷途徑之一，已經(jīng)成為了補(bǔ)硒制劑研究的熱點(diǎn)[22]。目前，人工合成硒多糖的方法有：植物轉(zhuǎn)化法、化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法[23]等，硒多糖的化學(xué)合成法主要是利用多糖鏈上的羥基等活性基團(tuán)與硒化試劑中的硒結(jié)合，從而使硒共價(jià)結(jié)合到多糖分子上，形成硒多糖[24-25]。其中硝酸－亞硒酸鈉法具有反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)、環(huán)境污染小、安全性高、產(chǎn)物回收方便的優(yōu)點(diǎn)，在硒多糖的制備合成中廣泛應(yīng)用[26]。許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用硝酸-亞硒酸鈉法合成出硒化多糖，如硒化冬蟲(chóng)夏草多糖[27]、硒化梅花馬尾藻多糖[28]、硒化食用灰樹(shù)花多糖[29]、硒化紫花苜蓿根多糖[30]、硒化黃大棗多糖[31]等。

目前關(guān)于硒化天麻多糖的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，研究天麻多糖的硒化修飾工藝和抗氧化活性，可為天麻資源的綜合利用和補(bǔ)硒產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。本研究采用硝酸-亞硒酸鈉法合成硒化天麻多糖SeGEP，采用響應(yīng)面法優(yōu)化天麻多糖的硒化修飾制備工藝，并研究硒化修飾前后天麻多糖的結(jié)構(gòu)變化以及GEP、SeGEP 的抗氧化活性，為開(kāi)發(fā)研制硒化天麻多糖相關(guān)的補(bǔ)硒制劑、功能食品開(kāi)發(fā)等提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天麻 購(gòu)自貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司，并經(jīng)貴州師范大學(xué)陳華國(guó)教授鑒定為蘭科植物天麻（Gastrodia elataBlume）的塊莖，樣本保存在貴陽(yáng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，編號(hào)2021 060263；石油醚、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、甲苯 分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；活性炭 分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硝酸、高氯酸 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸、三氯化鐵分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；亞硒酸鈉 分析純，山東西亞化學(xué)股份有限公司；碳酸氫鈉 分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（Vitamin C，VC）、剛果紅、碘、碘化鉀、三氯乙酸 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二胺、過(guò)硫酸鉀分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，DETA-2Na）分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠；重水（D2O）分析純，上海泰坦科技股份有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）分析純，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；鐵氰化鉀 分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；MD44（8000～14000 D）透析袋 北京索萊寶科技有限公司。

XMTD-204 恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；DF-101S 恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FA124 電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TDZ25-WS 離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司；LC-12N-50A 真空冷凍干燥機(jī) 上海力辰邦西儀器科技有限公司；Cary 60 UV-Vis 紫外光譜儀 安捷倫科技有限公司；PerkinElmer Spectrum Two 傅里葉變換衰減全放射紅外光譜儀 珀金埃爾默企管理（上海）有限公司；NS-90Z 納米粒度及電位分析儀珠海歐美克儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天麻多糖的提取 參考文獻(xiàn)[32]，稍作改動(dòng)。稱(chēng)取干燥至恒重的天麻粉末10.0 g，依次經(jīng)石油醚、無(wú)水乙醇50 mL 回流脫脂60 min，用活性炭進(jìn)行脫色素處理。濾渣加水300 mL 在80 ℃下提取2 h 后過(guò)濾，重復(fù)多次提取。濾液收集后，減壓濃縮至20 mL，重復(fù)多次加入Sevag 試劑（氯仿:正丁醇=4:1）10 mL以除去游離蛋白質(zhì)直至無(wú)白色沉淀。取上清液加入4 倍無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜，離心（4000 r/min）5 min 過(guò)濾。用乙醇、丙酮洗滌沉淀，然后加蒸餾水溶解，冷凍干燥，得到天麻多糖提取物（GEP）。

1.2.2 硒化天麻多糖的制備 參考胡潤(rùn)峰等[33]和王峙力等[34]的方法，稍作改動(dòng)。稱(chēng)取0.5 g 天麻多糖放入錐形瓶中，加入一定濃度的硝酸溶液50 mL，加熱攪拌溶解多糖，得到10 mg/mL 的天麻多糖溶液。加入一定量的亞硒酸鈉，在一定的溫度、時(shí)間條件下攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用碳酸氫鈉調(diào)pH 至5～6。反應(yīng)液離心（4000 r/min）5 min、抽濾，濾液用純凈水透析72 h。取少量的透析液加入抗壞血酸進(jìn)行顯色檢測(cè)，若無(wú)紅色時(shí)則停止透析。透析液減壓濃縮至20 mL、冷凍干燥得到硒化天麻多糖（SeGEP）。稱(chēng)重，計(jì)算硒含量和硒化多糖得率。

1.2.3 硒化天麻多糖中硒含量的測(cè)定

1.2.3.1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考李麗彩等[35]的方法，采用鄰苯二胺法檢測(cè)SeGEP 的硒含量。用Na2SeO3配制0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.3 μg/mL 不同濃度系列的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液25 mL，分別加入10 g/L EDTA-2Na 溶液2 mL，用1 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH2，加入10 g/L 鄰苯二胺2.5 mL，暗處反應(yīng)40 min，加入10 mL 甲苯，振蕩萃取5 min 取上層甲苯層，在波長(zhǎng)334 nm 處測(cè)定吸光值。以硒的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以吸光值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)Y 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 硒含量測(cè)定與計(jì)算 取20 mg 硒化天麻多糖置于錐形瓶中加入10 mL 濃硝酸、4 mL 高氯酸，常溫放置18 h 以上，在電熱爐上加熱消化，等溶液變無(wú)色或微黃色時(shí)，加入4 mol/L 鹽酸10 mL，加熱至溶液為10 mL 左右，冷卻定容至25 mL，后續(xù)操作按照硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，得到吸光值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硒含量，硒含量計(jì)算公式如式（1）：

式中：c 表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的硒質(zhì)量濃度，μg/mL；V 表示消化液定容體積，mL；m 表示硒化天麻多糖的質(zhì)量，g。

1.2.4 硒化天麻多糖中得率的計(jì)算 得率計(jì)算公式如式（2）：

式中：m1表示天麻多糖的質(zhì)量，g；m2表示硒化修飾天麻多糖的質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，硝酸濃度0.05%、反應(yīng)時(shí)間8 h、亞硒酸鈉用量（亞硒酸鈉:天麻多糖）為1:1，改變反應(yīng)溫度分別為50、60、70、80、90 ℃測(cè)定硒化多糖硒含量及其得率，考察反應(yīng)溫度對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.5.2 硝酸濃度對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，在反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間8 h 亞硒酸鈉用量為1:1 條件下，改變硝酸濃度分別為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%制備硒化天麻多糖，測(cè)定硒化多糖硒含量及其得率，探究硝酸濃度對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.5.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，固定反應(yīng)溫度70 ℃、硝酸濃度0.05%、亞硒酸鈉用量為1:1，改變反應(yīng)時(shí)間分別為4、6、8、10、12 h，制備硒化天麻多糖，測(cè)定硒化多糖硒含量及其得率，探究反應(yīng)時(shí)間對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.5.4 亞硒酸鈉的用量對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 按照1.2.2 的方法，在反應(yīng)溫度70 ℃、硝酸濃度0.05%，反應(yīng)時(shí)間8 h，改變亞硒酸鈉的用量分別為0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1，制備硒化天麻多糖，測(cè)定硒化多糖硒含量及其得率，探究亞硒酸鈉的用量對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的硒含量和顯著水平的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken（BBD）法進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。選擇反應(yīng)溫度（℃）、硝酸濃度（%）、反應(yīng)時(shí)間（h），以硒化天麻多糖的硒含量作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面法工藝優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.7 硒化天麻多糖的表征

1.2.7.1 紫外光譜分析 配制0.1 mg/mL 的Na2SeO3、GEP、SeGEP 溶液，以蒸餾水作空白，于200～400 nm范圍掃描測(cè)定。

1.2.7.2 紅外光譜分析 稱(chēng)取干燥恒重的Na2SeO3、GEP、SeGEP 100 mg 研磨壓片，于紅外光譜儀中，4000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描測(cè)定。

1.2.7.3 核磁共振分析 稱(chēng)取20 mg 的SeGEP，溶解于0.5 mL 重水（D2O）中，冷凍干燥，再用0.5 mL的D2O 復(fù)溶，加入到核磁管中，測(cè)定其1H-NMR、13CNMR。

1.2.7.4 粒徑及Zeta 電位分析 取適量GEP 和SeGEP溶于去離子水中，配制成濃度為2 mg/mL 的多糖溶液，在25 ℃的條件下，使用納米粒度及電位移儀測(cè)量多糖樣品的粒徑分布和Zeta 電位，每個(gè)樣品測(cè)3 次。

1.2.7.5 剛果紅實(shí)驗(yàn) 通過(guò)剛果紅（Congo red）實(shí)驗(yàn)測(cè)定GEP 和SeGEP 是否具有三股螺旋[36]。分別用蒸餾水配制2.5 mg/mL 的GEP、SeGEP 溶液，移取2 mL 多糖溶液與2 mL 80 μmol/L 的剛果紅溶液混合，逐漸加入NaOH 溶液，使溶液中NaOH 的濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 避光反應(yīng)5 min，在190～600 nm 波長(zhǎng)范圍掃描，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)，繪制最大吸收波長(zhǎng)與NaOH 濃度變化曲線。

1.2.7.6 碘-碘化鉀試驗(yàn) 稱(chēng)取0.2 g KI，定容到100 mL，加入0.02 g I2，充分溶解后，稱(chēng)取GEP 與SeGEP 各2 mg，分別溶解在1.2 mL 配制好的溶液中，稀釋至一定濃度，在300～700 nm 范圍進(jìn)行紫外光譜掃描[37]。

1.2.7.7 掃描電鏡（SEM）分析 分別取干燥的GEP和SeGEP 均勻分散在鋁板上，在真空環(huán)境下鍍金。噴金后將樣品置于掃描電鏡下室溫掃描，觀察硒化前后多糖的表面形狀。

1.2.8 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[38]中的方法，分別配制成每組2、4、6、8、10 mg/mL 的VC、GEP 和SeGEP 溶液、取1 mL 樣品溶液加入0.01% DPPH-乙醇溶液2 mL，搖勻，在暗處反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定517 nm 處的吸光值。DPPH 自由基清除率計(jì)算方法如式（3）：

式中：A1，多糖與DPPH 溶液混合的吸光值；A2，多糖與無(wú)水乙醇混合后的吸光值；A0，DPPH 溶液與無(wú)水乙醇混合后的吸光值。

1.2.8.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[33,39]的方法，適量修改后，制備ABTS 自由基溶液，將7 mmol/L ABTS 母液與2.45 mmol/L 過(guò)硫酸鉀混合，在室溫下暗反應(yīng)16 h，用10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.6）稀釋?zhuān)敝猎?34 nm 處的吸光度為0.70±0.02 Abs，得到ABTS 工作液。配制VC、GEP、SeGEP 溶液（0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）置于試管中1 mL，每組加入2 mL ABTS 工作液，室溫暗反應(yīng)反應(yīng)6 min，用紫外分光光度儀在734 nm 處測(cè)定吸光度。ABTS+自由基清除率計(jì)算方法如式（4）：

式中：Aa，樣品與ABTS 工作液混合的吸光值；Ac，樣品與水混合后的吸光值；Ab，ABTS 工作液與水混合后的吸光值。

1.2.8.3 鐵還原能力 參考文獻(xiàn)[40]中的方法，適量修改后，將待測(cè)樣品（VC、GEP、SeGEP）配制為2、4、6、8、10 mg/mL 的溶液，分別取1 mL 于試管中，加入0.2 mol/L pH6.6 磷酸鹽緩沖液2.5 mL，1%鐵氰化鉀1 mL，于50 ℃下反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸5 mL，4000 r/min 條件下離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水，0.1%三氯化鐵0.5 mL，靜置10 min。于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)定吸光度。鐵還原力計(jì)算如式（5）：

式中：A1，樣品與反應(yīng)溶液體系混合的吸光值；A2，樣品與用去離子水代替0.1%三氯化鐵的反應(yīng)溶液體系混合的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05 表示差異顯著，采用OMNIC 軟件處理紅外數(shù)據(jù)和繪圖，采用MestReNova 軟件處理核磁共振數(shù)據(jù)和繪圖，其他數(shù)據(jù)采用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以硒的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以吸光值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)Y 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程：Y=0.3417X+0.0225（R2=0.9960）（圖1）。

圖1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of selenium content

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 結(jié)果如圖2a 所示，當(dāng)反應(yīng)溫度在50～70℃范圍內(nèi)，硒含量，得率顯著增加（P<0.05）；在60 ℃時(shí)，得率達(dá)到最大值53.72%±0.96%；在70 ℃時(shí)，硒含量達(dá)到最大值為3521.65±79.81 μg/g，此時(shí)得率為53.04%±0.89%；當(dāng)反應(yīng)溫度大于70 ℃，硒含量、得率下降。這可能由于硒多糖在高溫度條件下易分解[41]，硒與多糖解離速度大于結(jié)合速度。因此，選擇60、70、80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖2 天麻多糖的硒化修飾單因素實(shí)驗(yàn)Fig.2 Effect of influence factors on selenylation modification of Gastrodia elata polysaccharides

2.2.2 硝酸濃度對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 結(jié)果如圖2b 所示，當(dāng)SeGEP 在硝酸濃度0.01%～0.05%范圍內(nèi)時(shí)，SeGEP 的硒含量、得率隨著硝酸濃度的增加而顯著增加（P<0.05）；在濃度為0.03%時(shí)，得率達(dá)到最大值51.84%±1.18%；在濃度為0.05%時(shí)，硒含量達(dá)到最大值3511.645±128.95 μg/g，此時(shí)得率為48.46%±2.04%；當(dāng)硝酸濃度大于0.05%時(shí)，硒化天麻多糖的硒含量、得率下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的硝酸濃度會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)結(jié)合在多糖上的硒氧鍵C-O-Se斷裂而發(fā)生解離作用，進(jìn)而導(dǎo)致硒含量下降[42]。因此，選擇0.03%、0.05%、0.07%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響 結(jié)果如圖2c 所示，當(dāng)硒化天麻多糖的反應(yīng)時(shí)間小于8 h，硒含量、得率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸顯著增大（P<0.05）；在反應(yīng)時(shí)間為8 h 時(shí)，硒含量達(dá)到最大值為3894.72±164.28 μg/g，此時(shí)得率為55.46%±1.00%；在反應(yīng)時(shí)間為10 h 時(shí)，有最大的得率57.8%±0.9%；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于8 h 和10 h，硒含量、得率分別隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而緩慢減小，當(dāng)硒化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，GEP 在高溫和酸性條件下發(fā)生降解，影響硒化反應(yīng)進(jìn)行。因此，選擇6、8、10 h 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2.4 亞硒酸鈉的用量對(duì)天麻多糖硒化修飾的影響

結(jié)果如圖2d 所示，當(dāng)GEP 與Na2SeO3質(zhì)量比低于1:1 時(shí)，隨著Na2SeO3用量的增加，SeGEP 中硒含量、得率呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（P<0.05）；當(dāng)用量比為1:1 時(shí)，硒含量達(dá)到最大為3289.79±21.26 μg/g，得率為54.22%±2.02%；當(dāng)Na2SeO3用量大于1:1和1.2:1 時(shí)，隨著Na2SeO3用量的增加，硒含量、得率分別呈下降趨勢(shì)，這可能硒與多糖的鍵合達(dá)到飽和狀態(tài)，Na2SeO3的用量比的增大可能導(dǎo)致其平衡狀態(tài)被破壞，從而導(dǎo)致硒含量下降[43]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 回歸方程的建立與方差分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。以硒含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 11 軟件分析擬合得到硒化天麻多糖的硒含量的二次多元回歸方程：Y=3736.73+308.25A-241.56B+634.45C-83.37AB+196.70AC-12.22BC-531.47A2-359.40B2-1649.24C2，并對(duì)此設(shè)計(jì)的模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and result of response surface method test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

如表3 所示，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，該回歸模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），模型決定系數(shù)R2=0.9909，校正后決定系數(shù)R2adj=0.9792，說(shuō)明模型擬合度較高，能預(yù)測(cè)97.92%的響應(yīng)值，可以利用此模型對(duì)硒化天麻多糖的制備工藝的優(yōu)化。由回歸模型的顯著性可知，一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著（P<0.01），交互項(xiàng)AC 的影響顯著（P<0.05），交互項(xiàng)AB、BC 的影響不顯著（P>0.05）。由F值可知，各因素對(duì)硒化天麻多糖的硒含量的影響順序：C>A>B。

2.3.2 響應(yīng)面曲面結(jié)果分析 根據(jù)分析軟件擬合得到的三維圖來(lái)反映出反應(yīng)溫度、硝酸濃度、反應(yīng)時(shí)間三個(gè)因素兩兩交互作用對(duì)天麻多糖的硒化修飾影響。由圖3 看出，AB 響應(yīng)面不陡峭，等高線接近圓形，說(shuō)明AB 交互作用相對(duì)不顯著；AC、BC 響應(yīng)面陡峭，等高線呈橢圓形，說(shuō)明AC、BC 交互作用顯著，這與方差結(jié)果分析較為一致。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)分析軟件模型的建立，當(dāng)反應(yīng)溫度為73.91 ℃、硝酸濃度為0.041%、反應(yīng)時(shí)間為8.42 h 時(shí)，預(yù)測(cè)硒化天麻多糖的硒含量為3904.07 μg/g。考慮實(shí)際操作，將最佳硒化天麻多制備工藝改為反應(yīng)溫度74 ℃、硝酸濃度0.041%、反應(yīng)時(shí)間8.4 h，重復(fù)3 次。在此條件下得到的硒含量為3891.05±10.86 μg/g，得率為49.63%±1.49%，與預(yù)測(cè)值硒含量對(duì)比僅相差0.33%，表明模型準(zhǔn)確可靠。

2.4 紫外光譜結(jié)果分析

如圖4 所示，Na2SeO3在208 nm 處有較強(qiáng)的吸收峰，這與張春嶺等[44]的研究相符合。GEP 和SeGEP 在260、280 nm 沒(méi)有明顯的核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，說(shuō)明多糖中大部分蛋白質(zhì)和核酸已經(jīng)除去[45]。

圖4 Na2SeO3、GEP、SeGEP 的紫外光譜圖Fig.4 UV spectrogram of Na2SeO3,GEP and SeGEP

2.5 紅外光譜結(jié)果分析

亞硒酸鈉、天麻多糖硒化前后的紅外光譜如圖5 所示。在717、445 cm-1處有吸收峰為Na2SeO3的特征吸收峰[46]。其中3292 cm-1（GEP）、3307 cm-1（SeGEP）處的特征峰為-OH 的伸縮振動(dòng)特征吸收峰（3600～3200 cm-1），2902 cm-1（GEP、SeGEP）處的吸收峰為C-H 的伸縮振動(dòng)（2900 cm-1），1591 cm-1（GEP）、1645 cm-1（SeGEP）處的吸收峰為C=O 的伸縮振動(dòng)（2200～1350 cm-1），1406 cm-1（GEP、SeGEP）處的吸收峰為C-H 的變形振動(dòng)（1450～1360 cm-1），1230 cm-1（GEP）、1246 cm-1（SeGEP）處的吸收峰為C-O-C 的伸縮振動(dòng)[47]，1149 cm-1（GEP）、1148 cm-1（SeGEP）處的吸收峰為β-型糖苷鍵的特征吸收峰[34]，760 cm-1（GEP）、759 cm-1（SeGEP）為吡喃環(huán)骨架的特征吸收峰[48]，以上特征吸收峰說(shuō)明了天麻多糖和硒化天麻多糖都具有含β-型糖苷鍵連接以吡喃環(huán)為骨架的多糖結(jié)構(gòu)。而硒化天麻多糖在1016、896、605 cm-1處產(chǎn)生新的弱吸收峰，其中1016 cm-1處的吸收峰為O-Se-O 的特征吸收峰[49]（1040～1010 cm-1），896 cm-1處的吸收峰為Se=O 特征吸收峰[50]（900～850 cm-1），605 cm-1處的吸收峰為C-O-Se 特征吸收峰[51]（700～600 cm-1），這說(shuō)明硒以亞硒酸酯的形式與天麻多糖上的羥基結(jié)合生成硒化天麻多糖。

圖5 Na2SeO3、GEP 和SeGEP 的紅外光譜分析Fig.5 Infrared spectrum analysis of Na2SeO3,GEP and SeGEP

2.6 核磁共振結(jié)果分析

如圖6 所示，SeGEP 的1H-NMR 譜圖的化學(xué)位移有3.28、3.50、3.70、3.83、5.27 ppm，這些信號(hào)可以指征為多糖的特征峰[28]，其中3.28、3.50、3.70、3.83 ppm 來(lái)源于單糖上的H-2～H-6[52]。在一般情況下，異頭氫H-1 在5.50～4.90 ppm 范圍內(nèi)屬于α-構(gòu)型，在4.90～4.0 ppm 范圍內(nèi)屬于β-構(gòu)型，SeGEP 在這兩個(gè)范圍內(nèi)只有信號(hào)5.27 ppm，通過(guò)1H-NMR 譜說(shuō)明硒化天麻多糖的糖苷鍵主要為α構(gòu)型。

圖6 SeGEP 的1H-NMR（a）和13C-NMR（b）圖譜Fig.6 1H-NMR (a) and 13C-NMR (b) spectra of SeGEP

SeGEP 的13C-NMR 譜圖的化學(xué)位移有60.39、69.23、71.09、71.46、73.28、76.75、99.67 ppm。其中60.39 ppm 處為C-6 信號(hào)，69.23 ppm 處為C-5 信號(hào)，71.09、71.46 ppm 處為C-2 信號(hào)，出現(xiàn)裂峰，73.28 ppm 處為C-3 信號(hào)，76.75 ppm 處為C-4 信號(hào)，99.67 ppm 處為異頭碳C-1 信號(hào)，異頭碳信低于100 ppm 也驗(yàn)證了SeGEP 的構(gòu)型為α構(gòu)型[53]。

2.7 粒徑及Zeta 電位結(jié)果分析

多糖的流體力學(xué)性質(zhì)如粒徑分布和電勢(shì)電位可以在一定程度上反映其穩(wěn)定性，一般來(lái)說(shuō)，多糖分子的粒徑越小、Zeta 電位的絕對(duì)值越大，說(shuō)明多糖分子在體系中越容易分散或溶解，反之則多糖分子越容易聚集[54]。如圖7a 所示，在2 mg/mL 的濃度下，GEP的平均粒徑為647.33±43.11 nm，SeGEP 的平均粒徑為486±60 nm，SeGEP 的粒徑比GEP 減少了24.92%。該結(jié)果顯示天麻多糖在硒化反應(yīng)過(guò)程中，因亞硒酸酯基團(tuán)的引入使天麻多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，更易緊密聚合成粒徑更小的形態(tài)；圖7b 中GEP 的平均Zeta電位為-12.92±2.42 mV，SeGEP 的平均Zeta 電位-15.83±0.53 mV，SeGEP 的Zeta 電位絕對(duì)值比GEP大22.52%。結(jié)果顯示硒化多糖形成后，因SeGEP 表面的亞硒酸酯基團(tuán)的羥基比GEP 表面的羥基基團(tuán)電離程度強(qiáng)，使SeGEP 表面帶的負(fù)電荷增加，表現(xiàn)出SeGEP 的Zeta 電位絕對(duì)值比GEP 大。這與Ru 等[55]研究結(jié)果一致，表明硒化修飾能提高天麻多糖在溶液體系的穩(wěn)定性、分散性。

圖7 GEP 和SeGEP 的粒徑分析（a）和Zeta電位（b）Fig.7 Particle size (a) and Zeta potential (b) of GEP and SeGEP

2.8 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

剛果紅是一種酸性染料，其可與具有三股螺旋鏈構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物在一定的堿性溶液中保持穩(wěn)定，但當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度大于某一數(shù)值后，由于堿性過(guò)高使多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)開(kāi)始破壞導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)急劇下降，由此可對(duì)多糖中是否含有三股螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷[56]，并推斷硒化修飾是否對(duì)多糖的三股螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。由圖8a 可知，隨著NaOH 濃度的增大，剛果紅的最大吸收波長(zhǎng)在下降，發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。GEP 和SeGEP 的最大吸收波長(zhǎng)相比于剛果紅的最大吸收波長(zhǎng)有發(fā)生紅移現(xiàn)象，但變化程度較少，最大吸收波長(zhǎng)整體處于藍(lán)移趨勢(shì)。綜上所述，天麻多糖和硒化天麻多糖可能具備三股螺旋結(jié)構(gòu)[57]，且硒化修飾過(guò)程不會(huì)對(duì)天麻多糖的螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

圖8 GEP、SeGEP 與剛果紅復(fù)合物隨NaOH 濃度變化趨勢(shì)（a）及GEP、SeGEP 和碘-碘化鉀反應(yīng)后的紫外掃描（b）Fig.8 Trend diagram of GEP,SeGEP and Gongo red complex with NaOH concentration (a) and UV spectrogram of GEP,SeGEP and I2-KI (b)

2.9 碘-碘化鉀試驗(yàn)結(jié)果分析

當(dāng)多糖與碘試劑混勻后，碘與分支較少或側(cè)鏈較短的多糖的結(jié)合位點(diǎn)少，無(wú)法絡(luò)合，通過(guò)紫外掃描只有碘在565 nm 處的最大吸收峰，碘與分支較多或側(cè)鏈較長(zhǎng)的多糖的結(jié)合位點(diǎn)多，能使碘與多糖形成絡(luò)合物，紫外掃描發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象[58]，通過(guò)碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)推斷硒化修飾是否對(duì)天麻多糖的分支結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。如圖8b 所示，在330～380 nm 范圍內(nèi)，天麻多糖和硒化天麻多糖都有一個(gè)明顯的吸收峰，說(shuō)明天麻多糖和硒化天麻多糖都具有分支結(jié)構(gòu)，但565 nm 處無(wú)最大吸收峰，說(shuō)明天麻多糖和硒化天麻多糖均存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和支鏈，這與于闖[59]和蔡佳欣[60]研究結(jié)果相似。

2.10 掃描電鏡（SEM）結(jié)果分析

掃描電子顯微鏡主要是利用二次電子信號(hào)成像來(lái)觀察樣品的表面形態(tài)，即用極狹窄的電子束去掃描樣品，通過(guò)電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種效應(yīng)，其中主要是樣品的二次電子發(fā)射。二次電子能夠產(chǎn)生樣品表面放大的形貌像，從而獲得形貌、結(jié)構(gòu)、成分和結(jié)晶學(xué)信息等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)SEM 分析推斷硒化修飾是否對(duì)天麻多糖的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。圖9a、b分別為GEP 和SeGEP 掃描電鏡圖。由圖9a 可知，GEP 的表面比較光滑、規(guī)則，具有棱角的團(tuán)狀晶體結(jié)構(gòu)；由圖9b 可知，SeGEP 的表面粗糙，有大小不一，產(chǎn)生更小的粒徑、致密的球狀物聚集存在，這與粒徑分析的結(jié)果一致。這種變化可能是硒化修飾對(duì)天麻多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響，改變了天麻多糖的微觀表觀形態(tài)。

圖9 GEP（a）和SeGEP（b）的掃描電鏡圖（10000×）Fig.9 Scanning electron microscope pictures of GEP (a) and SeGEP (b) (10000×)

2.11 清除DPPH 自由基能力結(jié)果分析

DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，分子內(nèi)部存在有非共有電子的氮原子中心（N·），當(dāng)抗氧化劑向DPPH自由基轉(zhuǎn)移一個(gè)氫原子或一個(gè)電子，氮原子中心會(huì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)（N-H），這樣使DPPH 自由基性質(zhì)不再存在[61]。通過(guò)DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)，推斷硒化修飾是否對(duì)天麻多糖清除DPPH 自由基的影響。如圖10a 所示，GEP 和SeGEP 對(duì)DPPH 自由基的清除率均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著多糖濃度的增加，DPPH 自由基清除率越高。在濃度>3 mg/mL 時(shí)，相同的濃度下，SeGEP 的DPPH 自由基清除率顯著大于GEP（P<0.05）。在濃度10 mg/mL 時(shí)，SeGEP 有最大的DPPH 自由基清除率為98%±1.52%，這與陽(yáng)性對(duì)照的VC清除率為100%接近。SeGEP 上的亞硒酸酯基團(tuán)比GEP 表面的羥基基團(tuán)更活潑，更有利于與DPPH 的氮原子中心孤對(duì)電子配對(duì)，使DPPH自由基性質(zhì)不再存在。綜上所述，說(shuō)明硒化修飾可以增加天多糖對(duì)DPPH 自由基的清除效果。

圖10 VC、GEP 和SeGEP 對(duì)DPPH 自由基（a）、ABTS+自由基（b）的清除能力及還原力測(cè)試（c）Fig.10 Scavenging ability of VC,GEP and SeGEP to DPPH radical (a),ABTS+ radical (b) and iron reduction ability test (c)

2.12 清除ABTS+自由基能力結(jié)果分析

ABTS 作為一種過(guò)氧化氫酶底物，能與氧化物反應(yīng)生成穩(wěn)定的綠色ABTS+自由基，并在734 nm 處有最大紫外吸收。其與抗氧化劑反應(yīng)時(shí)，ABTS+自由基與一個(gè)游離電子配對(duì)變成非自由基形式，溶液由綠色變?yōu)闊o(wú)色[62]。通過(guò)此試驗(yàn)，考察硒化修飾對(duì)天麻多糖清除ABTS+自由基的影響。如圖10b 所示，GEP、SeGEP 都具有對(duì)ABTS+自由基清除作用。濃度在1 mg/mL 時(shí)SeGEP 的清除作用顯著比GEP 強(qiáng)（P<0.05），在硒化天麻多糖濃度為1 mg/mL 時(shí)SeGEP的清除率為97.49%±1.16%，這與陽(yáng)性對(duì)照的VC清除率為100%接近。天麻多糖的中羥基基團(tuán)比較活潑，其易向ABTS+自由基提供氫原子，使天麻多糖具有抗氧化活性，且活性的強(qiáng)弱直接和供氫能力相關(guān)，硒化修飾后硒基團(tuán)的存在可以進(jìn)一步激活天麻多糖中的氫原子，從而增強(qiáng)其清除自由基的能力。綜上所述，表明硒化修飾后的天麻多糖在一定的濃度范圍內(nèi)提高抗氧化能力。

2.13 鐵還原能力結(jié)果分析

抗氧化試劑可以使鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）的三價(jià)鐵變?yōu)槎r(jià)鐵，K3Fe（CN）6中二價(jià)鐵和三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在700 nm 處有特定的吸收值[63]。如圖10c 所示，GEP 和SeGEP 的鐵還原能力均表現(xiàn)出劑量依賴(lài)關(guān)系，隨著多糖濃度的增加，還原能力越高，但上升的趨勢(shì)緩慢。相同的濃度下，SeGEP 的還原能力顯著強(qiáng)于GEP（P<0.05）。在濃度10 mg/mL時(shí)，GEP 有最大的還原力為0.73±0.17，而SeGEP 還原力為0.99±0.24。SeGEP 中的硒基團(tuán)的存在可提供電子的能力更強(qiáng)，還原鐵氰化鉀中三價(jià)鐵生成二價(jià)鐵的能力也更強(qiáng)，表現(xiàn)為SeGEP 的鐵還原力比GEP 強(qiáng)，這說(shuō)明硒化修飾可以增強(qiáng)天麻多糖的鐵還原能力。

3 結(jié)論

本研究以硒含量為指標(biāo)，采用HNO3-Na2SeO3法制備硒化天麻多糖，并通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，得出最佳的硒化天麻多糖的制備工藝條件為反應(yīng)溫度74 ℃、硝酸濃度0.041%、反應(yīng)時(shí)間8.4 h，在此條件下的硒含量為3891.05±10.86 μg/g；紅外光譜顯示，天麻多糖和硒化天麻多糖均有吡喃環(huán)的多糖，在硒化修飾后在1016、896、605 cm-1處產(chǎn)生新的吸收峰，分別為O-Se-O、Se=O、C-O-Se 特征吸收峰。核磁共振顯示，SeGEP 主要為有α構(gòu)型、吡喃環(huán)的硒化天麻多糖；硒化修飾使粒徑變小、Zeta 電位的絕對(duì)值變大、改變了天麻多糖的微觀形態(tài)，并提高了天麻多糖在溶液體系中的穩(wěn)定性；剛果紅試驗(yàn)和碘-碘化鉀試驗(yàn)表明，天麻多糖和硒化天麻多糖可能具備三股螺旋結(jié)構(gòu)并含有較長(zhǎng)的側(cè)鏈和支鏈結(jié)構(gòu)，且硒化修飾過(guò)程不會(huì)對(duì)天麻多糖的螺旋結(jié)構(gòu)、側(cè)鏈、支鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。抗氧化結(jié)果顯示，硒化天麻多糖對(duì)DPPH 自由基最大清除率為98%±1.52%、對(duì)ABTS+自由基最大清除率為97.49%±1.16%，均與VC相當(dāng)，最大鐵還原能力為0.99±0.24。以上三種抗氧化測(cè)試發(fā)現(xiàn)硒化天麻多糖的自由基清除率、鐵還原力比天麻多糖高，表明硒化修飾提高了天麻多糖的抗氧化能力。