超聲-酶輔助低共熔溶劑提取桑葉總黃酮的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

吳 均，吳俊葶，楊碧文，王 梅，趙 珮，馬婧秋，黃 越,，黃傳書,

（1.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400700；2.中國(guó)人民解放軍陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401331）

桑葉（Mulberry Leaf）又名神仙葉、鐵扇子，為桑屬桑科類桑的葉子，富含黃酮、多糖、總酚、生物堿、維生素、有機(jī)酸、植物甾醇、揮發(fā)油、微量元素以及氨基酸等成分[1-2]，于2002 年列入藥食同源目錄[3]。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，桑葉具有潤(rùn)肺止渴，疏風(fēng)散熱、清肝明目等藥效[4]。桑葉作為天然藥食兩用的植物資源，少量用于養(yǎng)蠶飼料，大量的桑葉被焚燒處理，造成資源浪費(fèi)。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，研究表明，桑葉具有降血糖、抗菌、抗病毒、抗氧化、保護(hù)心血管、抗癌、抗腫瘤、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)、減肥減脂、恢復(fù)紊亂的腸道菌群等作用[5-11]。黃酮是桑葉的主要成分之一，具有顯著的抗氧化和降血糖作用[12-13]，因此桑葉總黃酮具有較高的利用價(jià)值且極具開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

目前，提取黃酮主要方法有水提法、醇提法，酶提法、微波輔助溶劑提取法以及超聲波輔助溶劑提取法等，這些方法雖然操作簡(jiǎn)單，但均存在耗時(shí)長(zhǎng)、提取量少、能耗高等缺點(diǎn)[14]。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DES），由氫鍵受體與氫鍵供體按一定摩爾比組成，具有制備簡(jiǎn)單、溶解性好、熱穩(wěn)定性高、提取效率高、價(jià)格低廉且無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)[15]。已有一些關(guān)于DES 提取黃酮類[16]的報(bào)道。與傳統(tǒng)溶劑相比，DES 可顯著提高黃酮提取率，且可改善現(xiàn)有技術(shù)存在的耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣或長(zhǎng)時(shí)間熱效應(yīng)導(dǎo)致有效成分分解氧化等弊端。雷永偉等[17]采用6 種DES提取蕎麥殼黃酮，發(fā)現(xiàn)氯化膽堿-尿素的提取率最高，達(dá)到了 4.79%，優(yōu)于傳統(tǒng)的乙醇法，證實(shí)DES 可有效地提升蕎麥殼黃酮的提取率；羅朝丹等[18]采用超聲輔助DES 法提取番石榴葉總黃酮，發(fā)現(xiàn)ChCl+EG組成的DES 為提取溶劑，總黃酮提取率高達(dá)14.95%；謝茜等[19]以龍眼參為對(duì)象，采用超聲波輔助低共熔溶劑法提取的龍眼參黃酮，提取率為（37.98±0.13）mg/g，且龍眼參黃酮顯著延長(zhǎng)小鼠的力竭時(shí)間，提升抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力。目前關(guān)于DES 提取桑葉總黃酮的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究首次將超聲、酶和低共熔溶劑三者聯(lián)合起來(lái)用于提取桑葉總黃酮，以期縮短提取時(shí)間、最大限度提高提取量并降低能量的消耗。通過(guò)對(duì)比不同種類的DES、傳統(tǒng)溶劑和傳統(tǒng)方法提取桑葉總黃酮，篩選最佳DES，通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-酶輔助低共熔溶劑提取桑葉總黃酮的工藝，進(jìn)一步研究其體外抗氧化活性，旨在獲得一種綠色高效桑葉總黃酮的提取方法，為桑葉的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院；無(wú)水乙醇、葡萄糖、乙二醇、尿素 分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯化膽堿、果糖、蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖、纖維素酶（10 萬(wàn)U/g）、甘油、1-4-丁二醇、草酸、乳酸、抗壞血酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）分析純，上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁 對(duì)照品，北京索萊寶科技有限公司。

SOP 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TGL-16M 高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-1800 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 翱藝儀器有限公司；XY-500A 型高速多功能粉碎機(jī)浙江省永康市松青五金廠；HCJ-4D 磁力攪拌水浴鍋常州朗越儀器制造有限公司；HGZF-11 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SB25-12DTD 超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，通過(guò)測(cè)量其在510 nm 的吸光度，建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定桑葉總黃酮的含量。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用50%的熱乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻，制備成0.2 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精密量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，置于25 mL的容量瓶中，加入50%乙醇5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，放置5 min 后加入10%硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min 后加入1 mol/L 的氫氧化鈉溶液10 mL，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min 后于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度，試劑空白為參比液。以蘆丁質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=10.286X-0.0023，R2=0.9993，線性范圍為0～0.048 mg/mL。

1.2.2 桑葉總黃酮提取量的測(cè)定 精密稱取1.0 g 桑葉粉末于250 mL 三角瓶中，按一定的液料比加入一定含水量的低共熔溶劑，置于一定功率和一定溫度的超聲波中，超聲一定時(shí)間，超聲結(jié)束后放冷，移至50 mL 離心管內(nèi)，于10000 r/min 下離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm 的微孔濾膜，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

精密量取桑葉總黃酮提取溶液1 mL 于25 mL容量瓶中，按照上述測(cè)定方法測(cè)定吸光度，根據(jù)所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑葉總黃酮濃度。按照公式計(jì)算總黃酮提取量：

式中：W 為桑葉總黃酮提取量，mg/g；C 為黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為桑葉質(zhì)量，g。

1.2.3 不同提取方法 水提取法：精確稱取1.0 g 桑葉粉于100 mL 錐形瓶中，加入40 mL 純水，室溫浸漬2 h。提取后在10000 r/min，離心10 min，取上清液，測(cè)定桑葉總黃酮提取量。

醇提取法：精確稱取1.0 g 桑葉粉于100 mL 錐形瓶中，加入40 mL 50%乙醇溶液，室溫浸漬2 h。提取后在10000 r/min，離心10 min，取上清液，測(cè)定桑葉總黃酮提取量。

超聲-水提取法：精確稱取1.0 g 桑葉粉于100 mL錐形瓶中，加入40 mL 純水溶液，在超聲清洗器中以超聲功率300 W，提取溫度40 ℃，提取2 h。提取后在10000 r/min，離心10 min，取上清液，測(cè)定桑葉總黃酮提取量。

超聲-醇提取法：精確稱取1.0 g 桑葉粉于100 mL錐形瓶中，加入40 mL 50%乙醇溶液，在超聲清洗器中以超聲功率300 W，提取溫度40 ℃，提取2 h。提取后在10000 r/min，離心20 min，取上清液，測(cè)定桑葉總黃酮提取量。

超聲-酶輔助低共熔溶劑提取法：精確稱取1.0 g 桑葉粉于100 mL 錐形瓶中，加入40 mL 低共熔溶劑，3%纖維素酶，在超聲清洗器中以超聲功率300 W，提取溫度40 ℃，提取1 h。提取后在10000 r/min，離心20 min，取上清液過(guò)0.45 μm 的微孔濾膜，測(cè)定總黃酮的提取量。

1.2.4 低共熔溶劑（DES）的制備及篩選 選擇氯化膽堿（Hydrogen Bond Acceptor，HBA）作為氫鍵受體，分別與不同的氫鍵供體（Hydrogen Bond Donors，HBD）按摩爾比1:1 或者1:1:1，設(shè)計(jì)了17 組DES（見(jiàn)表1），在 80 ℃水浴條件下加熱攪拌至溶液澄清，冷卻至室溫，備用。

精密稱取1.0 g 桑葉粉末于250 mL 三角瓶中，按液料比40 mL/g 加入30%含水量的低共熔溶劑，置于超聲功率300 W，超聲溫度40 ℃，超聲40 min，超聲結(jié)束后放冷，移至50 mL 離心管內(nèi)，于10000 r/min 下離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm 的微孔濾膜，測(cè)定桑葉總黃酮的提取量，篩選出最佳低共熔溶劑。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以最佳DES 溶劑為提取劑，初始固定參數(shù)為：摩爾比1:1:2，含水量30%，液料比40 mL/g，超聲功率300 W，超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間40 min，酶添加量3%。考察不同摩爾比（1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:2:1、1:3:1、1:4:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1）；不同含水量（20%、25%、30%、35%、40%）；液料比（20、30、40、50、60 mL/g）；超聲功率（240、300、360、420、480 W）；超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）；超聲溫度（30、35、40、45、50 ℃）；酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%）對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)桑葉總黃酮提取量影響顯著的含水量（A）、酶添加量（B）和超聲時(shí)間（C）為自變量，以總黃酮提取量（Y）作為響應(yīng)值，采用 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化桑葉總黃酮的提取工藝條件。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.2.7 抗氧化活性的測(cè)定 用無(wú)水乙醇將在最優(yōu)條件下提取得到的桑葉總黃酮提取液配制成1.0 mg/mL的桑葉總黃酮溶液，備用。

1.2.7.1 DPPH 自由基清除率 取2 mL 0.2 mmol/L的DPPH 無(wú)水乙醇溶液分別加2 mL 濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL 的樣品溶液，混勻，避光靜置30 min，在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以相同濃度的Trolox 和VC作陽(yáng)性對(duì)照[20]。

式中：A0為4 mL DPPH 溶液+4 mL 純水；Ai為4 mL DPPH 溶液+4 mL 樣品溶液；Aj為4 mL樣品溶液+4 mL 純水。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率 取6 mL ABTS 工作液分別加0.2 mL 濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL 的樣品溶液，混勻后避光放置30 min，以無(wú)水乙醇為空白，于734 nm 處測(cè)定吸光度，以相同濃度的Trolox 和VC作陽(yáng)性對(duì)照[21]。

式中：A0為6 mL ABTS+·溶液+0.2 mL 無(wú)水乙醇；Ai為6 mL ABTS+·溶液+0.2 mL 樣品溶液；Aj為0.2 mL 樣品溶液+6 mL 無(wú)水乙醇。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 和DesignExpert 8.0.6.1 進(jìn)行作圖和響應(yīng)面分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法比較分析

采用水提取法、醇提取法、超聲-水提取法、超聲-醇提取法和超聲-酶輔助低共熔溶劑提取法提取桑葉總黃酮。

由圖1 可知，超聲-酶輔助低共熔溶劑提取法與其他的4 種方法相比，不僅能夠節(jié)約時(shí)間，也能提高總黃酮的提取量，因?yàn)镈ESs 中含有大量羥基和氨基，容易與黃酮形成氫鍵，可以增加黃酮在DESs 中的溶解度，同時(shí)在超聲-酶的輔助作用下，快速溢出，使總黃酮提取量增加，因此選擇超聲-酶輔助低共熔溶劑法提取桑葉中的總黃酮是快速、高效、環(huán)保的方法。

圖1 不同方法對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.1 Influence of different methods on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.2 低共熔溶劑（DES）的篩選

由圖2 可知，不同低共熔溶劑對(duì)桑葉總黃酮的提取量有一定的影響，DES-13（氯化膽堿/果糖/乙醇）提取的桑葉總黃酮量最高，原因可能是由于該組合的擴(kuò)散力與桑葉總黃酮提取液的極性比較接近，有利于黃酮的溶解和擴(kuò)散。因此，選擇氯化膽堿/果糖/乙醇作為提取桑葉中總黃酮的提取溶劑。

圖2 溶劑類型對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of solvent tpyes on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 DES 摩爾比對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖3 可知，當(dāng)氯化膽堿/果糖/乙醇摩爾比為1:1:3 時(shí)的總黃酮提取量為最大值。總黃酮提取量隨著乙醇占比的增加而先增加后降低；總黃酮提取量隨著氯化膽堿或果糖占比的增加而降低；這可能與所形成的低共熔體系的黏度和表面張力有關(guān)，乙醇占比越大，體系的黏度越小，表面張力下降，桑葉總黃酮溶解與擴(kuò)散的阻力減小，利于總黃酮的溶出，而隨著乙醇占比進(jìn)一步增大，體系極性減小，增大了溶劑與溶質(zhì)的極性差，使得總黃酮的溶解度下降；氯化膽堿或果糖占比不斷增加，體系的黏度增加，表面張力增強(qiáng)，桑葉總黃酮溶解與擴(kuò)散的阻力增大，不利于總黃酮的溶出[22]。因此，選擇低共熔體系為氯化膽堿/果糖/乙醇摩爾比為1:1:3。

圖3 溶劑摩爾比對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of solvent molar ratio on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3.2 DES 含水量對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖4 可知，當(dāng)含水量為30%時(shí)，桑葉總黃酮提取量最大。當(dāng)含水量從20%增加到30% 時(shí)，提取量隨著含水量的增大而增大，低共熔體系的黏度不斷減小，低共熔體系的極性不斷增大，增大接觸表面積，提高傳質(zhì)速率，促進(jìn)桑葉總黃酮的溶出，從而提高了桑葉總黃酮的提取量；但當(dāng)含水量大于30%時(shí)，桑葉總黃酮提取量逐漸下降，這可能是含水量過(guò)多使得體系黏度降低，極性過(guò)大，引起分子之間的氫鍵斷裂，進(jìn)而破壞體系的超分子結(jié)構(gòu)，溶劑和總黃酮的相互作用減弱而導(dǎo)致桑葉總黃酮提取量的降低[20]。因此，選擇低共熔溶劑的含水量為25%、30%、35%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 含水量對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of moisture content on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3.3 DES 液料比對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖5 可知，當(dāng)液料比為40:1 mL/g 時(shí)，桑葉總黃酮提取量最大。當(dāng)液料比從20:1 mL/g 增加到40:1 mL/g時(shí)，提取量隨著液料比的增大而增大，可能是因?yàn)橐毫媳鹊脑黾邮股Ｈ~粉與體系的接觸面積增加，充分浸提，促使桑葉粉中的總黃酮不斷溢出[23]；液料比大于40:1 mL/g 時(shí)，桑葉總黃酮提取量隨液料比的增加呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)，可能是因?yàn)樯Ｈ~粉溶解達(dá)到飽和[24]。因此，選擇低共熔溶劑的液料比為40:1 mL/g。

圖5 液料比對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of liquid to material ratio on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3.4 超聲功率對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖6可知，當(dāng)超聲功率為360 W 時(shí)，桑葉總黃酮提取量最大。當(dāng)超聲功率從240 W 增加到360 W 時(shí)，提取量隨著超聲功率的增大而增大，可能是因?yàn)榭栈?yīng)不斷增大導(dǎo)致，超聲功率不斷增大，體系中分子運(yùn)動(dòng)速度加快，對(duì)桑葉細(xì)胞壁的破碎作用增強(qiáng)，總黃酮物質(zhì)溢出增多[25]；而超聲功率大于360 W 時(shí)，桑葉總黃酮提取量有所下降，可能是因?yàn)檫^(guò)高的超聲功率引起的空化作用加強(qiáng)，產(chǎn)生了過(guò)多的雜質(zhì)且破壞了總黃酮的成分，導(dǎo)致桑葉總黃酮提取量降低[26]。因此，選擇超聲功率為360 W。

圖6 超聲功率對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasound power on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3.5 超聲時(shí)間對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖7可知，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min 時(shí)，桑葉總黃酮提取量最大。當(dāng)超聲時(shí)間從20 min 增加到40 min 時(shí)，提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增大，可能是因?yàn)闀r(shí)間延長(zhǎng)，超聲波能量在溶劑體系中形成的空化效應(yīng)使得桑葉細(xì)胞壁不斷破損[27]，桑葉總黃酮不斷溶出，提取量就越高；而超聲時(shí)間大于40 min 時(shí)，桑葉總黃酮提取量有所下降，可能是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間導(dǎo)致溶劑體系中乙醇揮發(fā)、大量雜質(zhì)溶出而使桑葉總黃酮溶出受限和部分黃酮降解[28]。因此，選擇超聲時(shí)間為30、40、50 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.7 Effect of ultrasound time on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3.6 超聲溫度對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖8可知，當(dāng)超聲溫度為40 ℃時(shí)，桑葉總黃酮提取量最大。當(dāng)超聲溫度從30 ℃增加到40 ℃時(shí)，提取量隨著超聲溫度的增加而增大，可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，體系溶劑的黏度和表面張力降低[29]，黃酮與樣品基質(zhì)之間的相互作用減少[30]，使得桑葉總黃酮不斷溶出；而超聲溫度大于40 ℃時(shí)，桑葉總黃酮提取量有所下降，可能是因?yàn)楦邷厥裹S酮發(fā)生了降解，體系溶劑中乙醇揮發(fā)，體系溶劑的極性和氫鍵穩(wěn)定性下降[31]。因此，選擇超聲溫度為40 ℃。

圖8 超聲溫度對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.8 Effect of ultrasound temperature on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.3.7 酶添加量對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響 由圖9可知，當(dāng)酶添加量為4%時(shí)，桑葉總黃酮提取量最大。總黃酮提取量隨著酶添加量的增加先增大后降低，可能是因?yàn)殡S著酶添加量的增加，破壞了細(xì)胞壁使得桑葉總黃酮不斷溶出，但過(guò)量的酶又會(huì)使黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，桑葉總黃酮提取量隨之下降。因此，選擇酶添加量為3%、4%、5%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖9 酶添加量對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響Fig.9 Effect of enzyme dosage on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇含水量、酶添加量和超聲時(shí)間為考察變量，以桑葉總黃酮提取量為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Design scheme and results Box-Behnken experiment

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression model

根據(jù)軟件預(yù)測(cè)得到二元多次回歸方程：桑葉總黃酮提取量（mg/g）=46.62+0.098A+0.32B+0.38C+0.36AB-0.28AC-0.99BC-2.44A2-2.89B2-3.18C2

由表4 可知，該模型P<0.0001，極顯著，失擬項(xiàng)P=0.5455>0.05，不顯著，說(shuō)明該模型擬合度較好。一次項(xiàng)B、C、二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響均為極顯著（P<0.01），交互項(xiàng)AB 和BC 對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響極顯著（P<0.01），AC 對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響為顯著（P<0.05），R2=0.9977，R2adj=0.9947，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)的桑葉總黃酮提取量與試驗(yàn)的桑葉總黃酮提取量相關(guān)性好，擬合度較好，能很好地反映桑葉總黃酮提取量與它們?nèi)咧g的關(guān)系。根據(jù)F值，影響桑葉總黃酮提取量的各因素大小順序?yàn)槌晻r(shí)間（C）>酶添加量（B）>含水量（A）。

2.4.2 響應(yīng)面交互作用 3D 響應(yīng)面曲線圖彎曲程度越大表明2 個(gè)因素交互作用越顯著，等高線形狀越扁表明因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[32]。由圖10 可以看出AB、AC、BC 曲線有較好的傾斜度，等高線呈橢圓形且等高線較為密集，說(shuō)明含水量、酶添加量和超聲時(shí)間，兩兩之間的交互作用對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響顯著。

圖10 各因素交互作用對(duì)桑葉總黃酮提取量影響的響應(yīng)面分析Fig.10 Response surface analysis of the influence of interaction of various factors on the extraction amount of total flavonoids from mulberry leaves

經(jīng)模型分析預(yù)測(cè)得到桑葉總黃酮最佳提取工藝條件為含水量30.10%、酶添加量4.05%、超聲時(shí)間40.51 min，桑葉總黃酮提取量預(yù)測(cè)值為46.64 mg/g；為了方便操作，將提取條件調(diào)整為含水量30%、酶添加量4%、超聲時(shí)間40 min，在此條件下進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定桑葉總黃酮提取量為46.58 mg/g，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值相符度高，說(shuō)明該工藝可行。

2.5 桑葉總黃酮抗氧化能力測(cè)定

2.5.1 DPPH 自由基清除率 如圖11 所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，桑葉總黃酮、抗壞血酸和Trolox 的DPPH 自由基清除率先增加后趨于平穩(wěn)。質(zhì)量濃度小于0.05 mg/mL 時(shí)，同一質(zhì)量濃度下，桑葉總黃酮清除能力明顯低于抗壞血酸和Trolox，質(zhì)量濃度大于0.05 mg/mL 時(shí)，同一質(zhì)量濃度下，桑葉總黃酮清除能力與抗壞血酸和Trolox 幾乎一致。當(dāng)質(zhì)量濃度從0.01 mg/mL 增加到0.08 mg/mL 時(shí)，桑葉總黃酮、抗壞血酸和Trolox 的清除率分別從25.25%、47.77%、83.18%增加到98.36%、98.57%、98.87%。結(jié)果表明桑葉總黃酮具有一定的清除DPPH 自由基的能力。

圖11 不同樣品清除 DPPH 自由基能力Fig.11 DPPH free radical scavenging ability of different samples

2.5.2 ABTS+自由基清除率 如圖12 所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，桑葉總黃酮的ABTS+自由基清除能力不斷增加，抗壞血酸和Trolox 的ABTS+自由基清除能力先增加后趨于平穩(wěn)，桑葉總黃酮ABTS+自由基清除能力明顯低于抗壞血酸和Trolox。當(dāng)質(zhì)量濃度從0.02 mg/mL 增加到0.20 mg/mL 時(shí)，桑葉總黃酮、抗壞血酸和Trolox 的清除率分別從8.33%、16.53%、23.07%增加到72.12%、99.48%、99.67%。結(jié)果表明桑葉總黃酮具有一定的清除ABTS+自由基的能力。

圖12 不同樣品清除ABTS+自由基能力Fig.12 ABTS+ free radical scavenging ability of different samples

3 結(jié)論

本文建立了一種綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效、低廉的超聲-酶輔助低共熔溶劑提取桑葉總黃酮新型方法。通過(guò)比對(duì)水提取法、醇提取法、超聲水提取法、超聲醇提取法和超聲低共熔溶劑提取法，確定了超聲-酶輔助低共熔溶劑提取法效果最佳；篩選17 種二元或三元DES 溶劑對(duì)桑葉總黃酮提取量的影響，以DES-13 氯化膽堿/果糖/乙醇摩爾比為1:1:3 為最佳提取溶劑。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得到桑葉總黃酮的最佳提取工藝條件：含水量為30%、液料比為40 mL/g、超聲功率為360 W、超聲溫度為40 ℃、超聲時(shí)間為40 min、酶添加量4%條件下，桑葉總黃酮提取量為46.58 mg/g；當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL 時(shí)，桑葉提取物的DPPH 自由基清除率為98.36%，當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)，桑葉提取物的ABTS+自由基清除率為72.12%。這為后續(xù)桑葉總黃酮提取物的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。