物理協同酶法處理對青稞淀粉結構的影響

白 婷，李 琳，朱明霞，靳玉龍，王姍姍，張玉紅,

（1.西藏自治區農牧科學院農產品開發與食品科學研究所，西藏拉薩 850000；2.西藏農牧學院，西藏林芝 860000）

食用淀粉可分為快速消化淀粉（Rapidly Digestible Starch，RSD，20 min 內消化）、慢消化淀粉（Slowly Digestible Starch，SDS，20～120min 內消化）和抗性淀粉（Resistant Starch，RS，≥120 min 仍未被消化）[1]。SDS 可緩釋葡萄糖從而體內產生平緩的血糖應答[2]；RS 和SDS 具有良好的抗消化特性和功能特性，RS 在人體內無法被消化，但在結腸中可以被微生物菌群發酵利用[3]，在增加飽腹感的同時血糖應答水平較低，其相關制品具有較低的血糖生成指數，對糖尿病有一定的預防作用。

影響淀粉消化速率的因素很多，例如淀粉來源、直/支鏈淀粉含量比、淀粉顆粒形態、淀粉結構等[4]。多數淀粉中主要含RSD，能快速提高人體血糖水平，為改善這一缺陷并擴大淀粉的應用范圍，可通過高壓濕熱、熱擠壓、超聲、酶解、酸解等方法[5]對其進行改性從而獲得較高含量的SDS 與RS。不同改性方法都有缺陷，傳統高壓濕熱處理操作簡單但制取率低、酶解法制取率高但制作成本高，所以考慮成本和制取率，聯合多種處理方法是抗性淀粉制作的主要方向[6]。

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.）作為我國青藏高原地區最主要的作物[7]。青稞中主要成分是淀粉，含量一般在45%～75%之間[8-10]，青稞中直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例在20:80～34:66 之間[11]，因此研究和開展青稞淀粉深加工，有利于提升青稞附加值，利于青稞產業發展。青稞淀粉的研究集中在加工方式對青稞淀粉消化率的影響[12-14]，對影響淀粉結構因素的研究多限于不同物理聯合或酶聯合多級物理法等處理方式對青稞淀粉分子結構和物理特性的影響[15-16]。本研究主要以青稞淀粉為原料，通過酶法聯合物理處理對青稞淀粉進行處理，研究不同處理對青稞淀粉結構特性的影響，通過分析淀粉結構性質，明確不同改性處理方式對青稞淀粉結構的影響，從而為改性青稞淀粉制備及加工提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青稞藏青2000 西藏圣科種業提供；普魯蘭酶（食品級1000 U/mL）北京索萊寶科技有限公司；總淀粉檢測試劑盒、直/支鏈淀粉檢測試劑盒、抗性淀粉檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme 公司；MOPS（鈉鹽）SigMa；所有試劑均為分析純。

XZ-10DTD 超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；Nicolet 6700 傅立葉紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司；SU 8010 電子顯微鏡日立公司；Axio Scope A1 偏光顯微鏡 德國蔡司公司；Mastersizer 3000 激光粒度儀 英國馬爾文公司；D8 ADVANCE X-射線衍射儀 布魯克公司；SAXSpoint 2.0 小角X 射線散射儀 Anton Paar。

1.2 實驗方法

1.2.1 青稞淀粉制備方法 水提法制備青稞淀粉。將青稞籽粒清洗干凈，去除石子、燕麥等雜質，曬干備用。用去皮機粉碎去皮后加水浸泡1～2 h，磨漿機制漿過100 目篩，漿液4000 r/min 離心5 min，去除上清液，刮去沉淀上層灰黑色物質，進行3 次水洗，加水攪拌均勻，過篩、離心、去液、刮層，再用無水乙醇進行一次醇洗后40 ℃烘干，粉碎過篩備用，得青稞淀粉（Highland Barley Starch，HS）。

1.2.2 改性青稞淀粉的制備

1.2.2.1 普魯蘭酶法制備青稞改性淀粉 采用本實驗室優化后的方法，即稱取10.00 g 青稞淀粉，按料/水比為1:14 的量加入蒸餾水，制備成青稞淀粉懸濁液，混勻后調pH5.5，于100 ℃水浴中預糊化45 min，取出冷卻至室溫，加入22 U/mL 普魯蘭酶，在60 ℃溫度條件下酶解16 h；100 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫，4000 r/min 離心10 min，將沉淀在4 ℃條件下老化24 h，后40 ℃烘箱中烘干，粉碎并過100 目篩備用，即得P-HRS（Pullulanase-highland barley resistant starch）。

1.2.2.2 普魯蘭酶＋超聲制備青稞改性淀粉 稱取10.00 g 按照1.2.2.1 方法制備的樣品，按料/水比為1:11 的量加入蒸餾水，制備成懸濁液，充分混勻后置于100 ℃水浴中預糊化45 min，取出冷卻至室溫；設置超聲功率為300 W，超聲溫度為70 ℃，超聲時間為55 min，進行超聲處理，超聲結束后冷卻，4000 r/min 離心10 min，將沉淀在4 ℃條件下老化24 h，最后40 ℃烘箱中烘干，粉碎并過100 目篩，即得PU-HRS（Pullulanase+Ultrasonic-highland barley resistant starch）。

1.2.2.3 普魯蘭酶＋壓熱法制備青稞改性淀粉 稱取10.00 g 按照1.2.2.1 方法制的的樣品，按料/水比為1:17 的量加入蒸餾水，制備成懸濁液，充分混勻后，調節pH 為6，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，設置壓熱溫度為110 ℃，時間為90 min，進行壓熱處理，壓熱結束后，取出冷卻，4000 r/min 離心10 min，將沉淀在4 ℃條件下老化24 h，最后40 ℃烘箱中烘干，粉碎并過100 目篩備用，即得PP-HRS（Pullulanase+Autoclave-highland barley resistant starch）。

1.2.2.4 普魯蘭酶＋超聲與壓熱制備青稞改性淀粉

按上述方法依次對青稞淀粉進行普魯蘭酶酶解、超聲、壓熱處理，得到的樣品40 ℃烘箱中烘干，粉碎并過100 目篩備用，即得PUP-HRS（Pullulanase+Ultrasonic+Autoclave-highland barley resistant starch）。

1.2.3 總淀粉及其組分含量測定 總淀粉含量：采用Megazyme 總淀粉試劑盒法測定；直/支鏈淀粉含量：采用Megazyme 直/支鏈淀粉試劑盒法測定；RS 含量采用Megazyme 抗性淀粉試劑盒法測定。

1.2.4 樣品的表觀結構測定

1.2.4.1 掃描電鏡（SEM）使用掃描電鏡分析樣品的顆粒形貌。將樣品用導電雙面膠固定在金屬樣品臺上，噴金鍍膜，然后用掃描電鏡在1000×和2000×下進行掃描觀察。

1.2.4.2 偏光顯微鏡 用甘油和水按1:1 混合后加入樣品配成5%的淀粉乳，吸取一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于載物臺上，用偏光顯微鏡進行觀察和拍攝樣品的偏光十字。

1.2.4.3 激光粒度分析儀 使用馬爾文激光粒度分析儀測定淀粉的粒徑（μm）分布。準確稱取0.30 g 樣品，加入50 mL 蒸餾水搖勻，超聲3 min，使顆粒充分分散。設定儀器參數為：蒸餾水的折射率為1.33，樣品的折射率為1.52，散射模型為Mie，顆粒吸收率為0.100，分析模型為通用模式（模擬MS2000/MS2000E）。

1.2.4.4 X-射線衍射掃描 采用粉末衍射法對青稞淀粉及抗性淀粉進行X-射線衍射掃描分析。測試條件：Cu-ka 靶，測量角度2θ=5°～60°，步寬0.02°，掃描速度2°/min。利用JADE 9.0 對數據進行分析，計算樣品相對結晶度，判讀晶型。

1.2.4.5 傅里葉紅外光譜 采用溴化鉀壓片法對淀粉進行傅里葉紅外掃描分析。稱取一定量的樣品和干燥的溴化鉀粉末放入瑪瑙研缽中進行研磨，充分混合均勻后壓片，置于傅里葉紅外光譜儀中選用溴化鉀片作空白參比，進行全波段掃描（400～4000 cm-1）得到樣品的紅外光譜圖。利用OMNIC 8.2 對數據進行去卷積處理，計算有序度（DO）值和雙螺旋度（DD）值。

1.3 數據處理

本文中所有數據統計均采用SPSS 26.0、OMNIC 8.2 和JADE 9.0 軟件分析，曲線圖采用Origin 2021和OMNIC 8.2 軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 青稞淀粉與改性青稞淀粉的組分含量

由表1 可知，水提法制備的青稞淀粉中總淀粉含量為94.48%，其中抗性淀粉含量為3.19%，經過四種改性處理能夠顯著（P<0.05）提高青稞抗性淀粉的含量，改性處理后青稞抗性淀粉含量達14.38%～15.53%，其中PUP 改性處理抗性淀粉含量最高。與普魯蘭酶改性處理相比，PU、PP 處理后青稞抗性淀粉含量與酶處理后差異不顯著（P>0.05），而直/支鏈淀粉差異明顯。青稞淀粉經過物理協同酶處理后，與原淀粉相比，四種種改性處理能顯著降低支鏈淀粉的含量（P<0.05）；直鏈淀粉比例升高，其中直鏈淀粉含量P-HRS>PUP-HRS>PP-HRS>PU-HRS>HS，P-HRS的直鏈淀粉含量最高為86.81%。高含量直鏈淀粉有助于降低淀粉消化速率，直鏈淀粉的中、短鏈相互作用有助于在回生淀粉中形成較小的凝膠網絡晶胞，從而減緩淀粉的消化[4]。

表1 青稞淀粉與改性青稞淀粉的組分含量Table 1 Composition content of highland barley starch and modified highland barley starch

2.2 青稞淀粉與改性青稞淀粉顆粒形態分析

由圖1 可知，青稞原淀粉顆粒飽滿完整，呈圓餅形、扁球狀[17-20]，分為大小兩種，整體均勻、規則，表面光滑、有輕微凹陷，邊緣整齊圓潤，無褶皺、裂紋和孔洞。經改性處理后的青稞淀粉顆粒都遭到了嚴重破壞，原始形狀消失，粘連成團，呈現出團狀結構，表面粗糙、凹凸不平，布滿褶皺、裂紋和孔洞。四種青稞抗性淀粉（HRS）都經過了普魯蘭酶酶解處理，淀粉脫支，部分短鏈小分子溶出，所以表面都有微孔結構[21]。

青稞原淀粉有清晰的偏光十字，主要呈“正十字”形態，也有“斜十字”和“X”型，偏光十字的交叉點位于淀粉顆粒臍點位置，具有典型的雙折射現象，說明青稞原淀粉具有高度有序的晶體結構。經過不同的改性處理后的樣品，偏光十字和雙折射現象都明顯消失。青稞原淀粉是從臍點開始生長，普魯蘭酶或者超聲、壓熱會破壞淀粉顆粒的臍點，淀粉分子會降解成短鏈小分子，雙螺旋結構和結晶層受到破壞，回生又使小分子重新組合排列形成新的結晶，使處理后的青稞淀粉顆粒的聚集程度提高。

2.3 青稞淀粉與改性青稞淀粉粒度分布

淀粉顆粒直徑范圍為10～30 μm 的為A 大淀粉顆粒（透鏡型），直徑范圍<10 μm 的為B 小淀粉顆粒（球型），相同處理條件下，可以觀察到青稞原淀粉呈現雙峰的粒度分布（圖2），說明青稞淀粉存在大小兩種顆粒分布，以A 大淀粉顆粒為主，B 小淀粉顆粒較少，這和張玉玉[22]的研究結果相一致。

圖2 青稞淀粉與改性青稞淀粉的分布曲線Fig.2 Grain size distribution curves of highland barley starch and modified highland barley starch

青稞原淀粉和4 種青稞改性淀粉的粒徑分布差異較大（見圖2、表2），經過改性處理使得4 種青稞抗性淀粉的比表面積平均粒徑（D[3,2]）顯著提高（P<0.05），最大的是PU-HRS，為39.70%，最小的是PUP-HRS（31.83%），可能是因為經過超聲處理使淀粉顆粒內部發生空洞化，體積變大。與青稞原淀粉相比，只經過普魯蘭酶處理的形成的青稞抗性淀粉（PHRS）的體積平均粒徑（D[4,3]）差異不顯著（P>0.05），而PU-HRS、PP-HRS、PUP-HRS 的體積平均粒徑（D[4,3]）顯著變小（P<0.05）。Dv（10）、Dv（50）、Dv（90）值的不斷增大，代表樣品中大顆粒數目增加，這可能是因為改性處理使青稞淀粉顆粒中的淀粉分子分解成更小的鏈條，經過老化處理，小分子又重新結晶，形成的青稞抗性淀粉具有更加致密的大淀粉晶體[23-24]；其次，淀粉顆粒表面被破壞，表明活性增加，發生團聚行為，從而導致粒徑尺寸增大[25]。

2.4 青稞淀粉與改性青稞淀粉的結晶結構

青稞淀粉顆粒是由微晶、亞微晶和非晶三種不同結構經過無規律耦合從而形成多晶體系，可分為結晶區和非晶區（即無定形區）。在結晶區中，多晶體系具有晶形完整、晶粒線度大、長程有序以及在衍射曲線上尖峰衍射特征明顯的特點；在非晶區，多晶體系具有短程有序、長程無序以及在衍射曲線上彌散衍射特征明顯的特征[26]。

由圖3 可知，青稞淀粉的X-射線衍射譜圖的衍射峰主要分布在為15.15°、16.95°、18.04°、23.05°，為典型的A 型晶體結構，這和曹承嘉等[24]對青稞淀粉的晶型結構判斷相同。與青稞原淀粉相比，不同改性處理使青稞淀粉晶體峰的峰型和位置發生了明顯的改變。P-HRS 在17.02°、22.11°、23.82°處有強衍射峰，為典型的B 型晶體類型[27]，這可能是因為普魯蘭酶作用使青稞支鏈淀粉被酶解成更短的小分子，這些分支在4 ℃老化回生過程中重新結晶，增加了青稞原淀粉多晶體系中的直鏈淀粉分子含量，使不穩定的A 型晶體結構逐漸向結構更為穩定的B 型轉變，相對結晶度增加。經過超聲波處理的PU-HRS 的衍射角2θ為15.37°、17.09°、19.68°、22.25°、23.99°，相對結晶度為35.68%，表明在普魯蘭酶-超聲波的作用下A 型晶體開始向B 型晶體轉變。PP-HRS 在經過普魯蘭酶酶解及壓熱處理后，普魯蘭酶專一性地切斷α-1,6 糖苷鍵，打破原有的晶體結構，提高了支、直鏈淀粉分子的比例，促進淀粉小分子重新結晶形成雙螺旋結構，其衍射角2θ為15.30°、17.00°、19.61°、22.22°、23.85°相對結晶度為38.56%。普魯蘭酶+超聲+壓熱處理的PUP-HRS 的衍射峰角2θ為5.73°、12.87°、15.18°、17.02°、19.47°、22.11°、23.88°，相對結晶度為38.87%，主要是轉變為B 型晶體。

圖3 青稞淀粉與改性青稞淀粉的XRD 曲線Fig.3 XRD patterns of highland barley starch and modified highland barley starch

2.5 青稞淀粉與改性青稞抗性淀粉的紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜儀可對淀粉顆粒的短程有序結構進行相關分析研究，特別是鏈構象和雙螺旋結構之間的差異化問題[28]。從圖4、圖5 和表3 可以看出不同處理青稞淀粉的紅外分子結構情況，明確不同改性處理方式對青稞淀粉分子結構的影響。從圖4中可以看出，5 種青稞淀粉樣品的紅外光譜圖走勢大致相同，表明其鏈構象和雙螺旋結構的差異不大。

圖4 青稞淀粉與改性青稞淀粉的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of highland barley starch and modified highland barley starch

圖5 青稞淀粉與改性青稞淀粉的DO 與DD 值Fig.5 DO and DD values of highland barley starch and modified highland barley starch

表3 青稞淀粉與改性青稞淀粉官能團的特征吸收峰Table 3 Characteristic absorption peaks of functional groups of highland barley starch and modified highland barley starch

由表3 分析可知，HS、P-HRS、PU-HRS、PPHRS、PUP-HRS 均在3370、2930、1652、930、765 cm-1附近出現特征吸收峰，分別對應O-H 伸縮振動峰、亞甲基－CH2的伸縮振動峰、淀粉中吸附水中無定型區域的吸收峰，以及指紋區的C 吡喃糖分子C=O 振動峰、葡萄糖吡喃糖環骨架模式振動區域。說明改性沒有使青稞原淀粉的化學結構發生變化，沒有產生新的化學基團和化學鍵，只是改變了青稞淀粉內部結構的重新排列。

995、1022、1047 cm-1是表征淀粉構象的特性譜帶，1022 cm-1是無定型區的特征譜帶，995 和1047 cm-1則分別表示雙螺旋和有序結構的振動吸收，可用DO（A1047/A1022）和DD（A995/A1022）表示有序結構和雙螺旋結構程度，DO 值增大，表明分子有序性增高[33]。由圖5 可知，與原淀粉相比，處理后的青稞淀粉DO 值增大，表明改性處理使青稞淀粉的分子有序性提高；青稞淀粉樣品的DD 值均大于DO 值，雙螺旋度高于雙螺旋有序度，說明并非所有的雙螺旋必然是晶體的一部分，這和殷秀秀[34]以及Zhang 等[35]的結論相一致。

3 結論

通過對青稞淀粉及改性青稞淀粉的淀粉組分研究表明，物理協同酶改性處理能夠顯著提高青稞直鏈淀粉的含量，降低支鏈淀粉含量。青稞淀粉中抗性淀粉含量為3.19%，改性青稞淀粉中抗性淀粉含量達14.38%～15.53%。通過對青稞淀粉與改性青稞淀粉結構研究發現，物理協同酶改性能夠破壞青稞淀粉原有淀粉結構，使原始形態消失，粘連成團，呈現類似土塊、碎石形狀；改性青稞淀粉偏光十字消失，物理協同酶改性處理使淀粉雙螺旋結構和結晶結構受到破壞，從而導致偏光消失。改性處理增加了青稞抗性淀粉（HRS）的結晶度，A 型晶體向B 型轉變。物理協同酶改性處理只是促使青稞淀粉的分子有序性提高，沒有使青稞原淀粉的化學結構發生變化。

物理協同酶改性處理能夠使青稞淀粉組分及分子結晶特性發生明顯變化，這能顯著改變青稞淀粉的加工特性；而本研究只進行了物理協同酶改性對青稞淀粉結構的影響，今后將對改性青稞淀粉加工特性進行研究，為青稞淀粉的類產品加工性質提供數據支撐。此外發現，青稞中抗性淀粉含量的提高可能是由普魯蘭酶酶解起主要作用，物理處理的貢獻比較小，這為青稞抗性淀粉的制備提供一定的參考依據。