黃精對麥曲微生物群落結構及其功能基因的影響

張國泰，賀思橋，蒙倩倩，蘆潤青，唐菁雯，向 琴，耿敬章，田洪磊

（陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西省資源生物重點實驗室，陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心，秦巴生物資源與生態環境重點實驗室，陜西漢中 723000）

黃酒是世界公認三大古酒之一，因其高營養、低酒精含量且多樣化的保健功效等優勢，而廣受消費者歡迎，其主要由谷物經發酵劑通過糖化和發酵制成[1]。而麥曲是常用的發酵劑之一，其由小麥經熟化、成型等加工步驟，在開放環境下，達到一定培養時間后干燥制得。其對成品酒的感官及品質特性均有重要影響[2-3]，在釀造過程中提供液化、糖化、蛋白水解和酯化酶，有效促進了酒體發酵和風味化合物的生成[4]。因而，以曲釀酒具有高度的不可替代性，品質優異的酒曲是釀造高品質黃酒的前提。

改良和優化制曲工藝是提高麥曲品質的重要方法，其中以藥制曲為常用的手段之一，北魏《齊民要術》之神曲、元代之六神曲皆為藥曲[5]。中藥能夠對酒曲中的有害菌起到較強的抑制作用，而對功能菌無害，還可促進某些酶代謝[6]。研究證明，添加紅景天制作的藥曲所釀紫薯酒比普通酒曲所釀紫薯酒具有更豐富的風味物質，其對香氣物質的形成具有一定的促進作用[7]，且紅景天藥曲所釀紫薯酒抗氧化能力高于普通米曲紫薯酒[8]。此外，制曲入藥還能通過提升部分功能菌的胞外酶產量，而起到提升酒曲糖化、發酵能力作用[9]。如PENG 等[10]添加中藥制曲后，上調了其Monascus ruber的mokA、mokB、mokF、mokH、mokI 和mpla 的轉錄水平，使其產酶量提升41.18%。但中藥通常根據經驗添加，并未形成統一的共識，其含有皂苷和生物堿等具有抑菌活性的物質，過量地添加，可能會抑制酒曲中微生物的生長繁殖[11]。黃精是我國四大中草藥之一，為百合科植物，其主要活性成分黃精多糖可作為益生元，改善小鼠腸道菌群結構，使物種多樣性得到提升[12]，并提升有益菌豐度[13]，為微生物提供必要的養分，因此可在一定范圍內添加黃精制曲，以改善酒曲品質。黃酒的品質與微生物組成及功能基因有關[14]，HONG 等[15]研究了黃酒品質與微生物的相關性，發現酒曲中的微生物與黃酒的最終品質有關，其影響著發酵過程中的生物素合成、蘋果酸及乳酸代謝，且黃酒的酸敗主要與高豐度的乳酸桿菌有關。因此，探究黃精制曲對其微生物結構及功能基因的影響十分重要。

然而，目前以黃精為原料作曲的研究尚未見報道，且黃精將對麥曲中的微生物群落結構及功能基因產生何種影響仍不明確。宏基因組測序技術能夠在種水平上解釋物種組成[16]，是研究麥曲物種組成的有效手段。如XIE 等[17]以宏基因組學技術為手段，分析了紹興黃酒在釀造過程中的微生物組成的動態變化。發現發酵前期的優勢微生物為Actinobacteria（放線菌門），豐度占比高達87%，后期則下降至40.7%，而Firmicutes 則從6.2%增長至32.5%。

因此，本研究以未添加黃精粉的普通麥曲（PTMQ）、添加質量分數為2.5%及5%（黃精添加量為100 g 及200 g）[6]的黃精粉末制作的黃精麥曲（HJ100、HJ200）為研究對象，利用宏基因組測序技術闡述三者間微生物群落結構及功能基因的差異，從而判斷黃精對麥曲微生物群落結構及功能基因的影響，以分析其對后續釀造過程及風味物質形成可能造成的影響，為后續黃精麥曲制備及黃精黃酒釀造提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒曲：PTMQ、HJ100、HJ200 均于陜西長生酒業有限公司制作；樣品 制作好的酒曲，粉碎后置于樣品袋于-80 ℃冰箱保存；漢中香米 購于漢中桃心島超市；無菌水 實驗室自制；PBS 緩沖溶液 北京萬家；DNA 提取試劑 Omega，M5635-2，美國；Hieff NGS? MaxUp 擴增試劑（12200ES96）、Hieff NGS? DNA Selection Beads DNA 純化試劑（12601 ES56）豎圣生物科技有限公司；苯酚、3.5-二硝基水楊酸、葡萄糖、亞硫酸鈉 分析純，天津市大茂化學試劑廠；重鉻酸鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸分析純，天津市天力化學試劑有限公司；甲醛溶液分析純，成都市科隆化學品有限公司；酒石酸鉀鈉分析純，盛奧化學試劑有限公司。

SW-CJ-1FD 超凈工作臺 蘇潔凈化；P-III 通風櫥 北京成威；WH-3 微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；0.5～2.5 μL、1～10 μL、20～200 μL可調式微量移液器 Eppendorf；Thermo Scientific Sorvall Legend Micro21R 式高速低溫離心機 Thermo；DYY-11 電泳儀 北京市六一儀器廠；FR-980A 生物電泳圖像分析系統 復日科技；Qubit?熒光計核酸定量儀 Life Technologies；752N 紫外分光光度計 上海儀電；FW177 萬能粉碎機 北京市勇光明醫療儀器廠；Covaris220 超聲波破碎儀 上海土深視覺科技有限公司；多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒曲制作 選取當年產優質小麥，小麥籽粒飽滿，顆粒均勻，外皮薄；將小麥與黃精裝入拌曲機中，加入19%～22%的水，攪拌均勻。拌曲時間不宜過長，否則吸水過多不易成型。成型后，將曲塊于曲房依次排開，每塊間隔5～8 cm 距離，關閉門窗，保溫培養，前1～2 d 控制曲溫在30～40 ℃，使真菌大量繁殖，后2～3 d 控制曲溫在40～50 ℃，之后進入排潮生香期，水分蒸發，曲溫逐漸下降。經過30～40 d 左右時間曲房培養得到成品酒曲。

1.2.2 樣品預處理 稱取200 mg 的樣品，放入滅菌的2 mL 離心管中，加入1 mL 70%乙醇，振蕩混勻，10000 r/min 室溫離心3 min，棄置上層液體。加入1×PBS 溶液，振蕩混勻，10000 r/min 室溫離心3 min，棄置上層液體。倒置2 mL 離心管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管放入55 ℃烘箱10 min[18-19]。

1.2.3 DNA 提取 預處理完畢的樣品，根據Omega說明書所述方法進行提取。

1.2.4 文庫構建 使用Covaris220 超聲波破碎儀將DNA 分解成約500 bp 的片段，并使用Hieff NGS?DNA Selection Beads DNA 試劑對其進行純化，并采用Hieff NGS? MaxUp 對DNA 進行擴增[18-19]。

1.2.5 質量控制 通過Fastp（0.36 版）對DNA 質量進行評估：1.按順序拆除適配器；2.去除3'到5'端的低質量堿基（Q<20），使用滑動窗口法去除DNA reads 尾部小于20 的堿基值（窗口大小為4 bp）；3.找出DNA reads 重疊的部分，并適當糾正區間內不一致的堿基；4.去除長度小于35 nt 的DNA reads[18-19]。

1.2.6 組裝和分箱 首先，使用Megahit（1.2.9 版）進行多樣本混合拼接，獲得初步拼接序列；然后用bowite2（2.1.0 版）來清除DNA reads 對照拼接后的結果，提取未拼接的DNA reads，然后用SPAdes（3.13 版）再次拼接，得到低豐度的等位基因組；并使用MetaWRAP（版本 1.3.2）依次對DNA reads 進行Bin 分類、Bin 純化、Bin 定量、Bin 重組和Bin 識別等操作[18-19]。

1.2.7 基因預測和非冗余基因組構建 使用Prodigal（2.60 版）預測拼接結果的ORF，選擇長度大于或等于100 bp 的基因，并將其翻譯成核酸序列；對于每個樣本的基因預測結果，采用CD-HIT（2.60 版）進行去重復，得到一個非冗余的基因集；使用Salmon（version1.5.0）構建非冗余基因組的具體指數，采用雙相算法和構建偏倚模型的方法，準確量化每個樣本中的基因豐度，并根據基因長度信息計算基因豐度[18-19]。

1.2.8 Illumina HiSeq 2000 平臺測序 通過質量控制的DNA 進行上機測序（由生工生物工程（上海）有限公司Illumina HiSeq 2000 測序平臺完成）。物種和功能注釋：使用DIAMOND（版本0.8.20）將基因集與KEGG、CAZy 及SEED 數據庫進行比較，以獲得物種注釋信息和基因的功能注釋信息，篩選條件：E 值<10-5，分數>60。

1.2.9 黃酒釀造 3 個不同的酒曲均按照漢中香米100 g，酒曲添加量6%（以漢中香米質量為基準），1.4 倍的水及發酵7 d 為條件進行釀造。工藝流程為：洗米→泡米→蒸米→攤涼→拌曲→入壇→加水→發酵→壓榨、過濾→滅菌→成品。

1.2.10 理化指標測定 分別對PTMQ、HJ100 及HJ200 所釀出的黃酒進行理化指標測定。總酸和氨基酸態氮及pH 的測定依GB/T 13662-2018 進行；總糖的測定參照郭雷等[20]的方法進行，建立葡萄糖標準曲線，樣品于490 nm 處測定吸光度，并根據標準曲線計算樣品總糖含量；酒精度的測定參照何川等[21]的方法進行，建立乙醇標準曲線，樣品于600 nm 處測定吸光度，并根據標準曲線計算樣品乙醇含量，最后根據乙醇的密度換算出其百分含量。

1.3 數據處理

宏基因和理化分析中每個樣品設置3 個平行并重復測定3 次，以主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、堆疊柱狀圖/柱狀圖及熱圖，對所注釋的微生物及功能基因進行可視化分析，PCA 分析于邁維代謝公司開發的公共生信分析平臺（https://cloud.metware.cn/#/user/login）進行；屬水平聚類熱圖使用Oringin 2021 進行繪制，堆疊柱狀圖及柱形圖使用Excel 2016 進行繪制，理化指標的顯著性分析使用IPM SPSS 27 進行單因素方差顯著性檢驗及LSD 多重比較，以P<0.05 視為具有顯著性差異，P<0.01 視為具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 數據質量控制

如表1 所示，PTMQ、HJ100 和HJ200 經測序后，獲得大量原始reads，經質量控制去掉宿主、環境等污染源后，原始數據中reads 和DNA 堿基數量均稍有下降，而純凈reads 的占比均大于99%，表明此次測序數據具有極高的合理性，可用于后續分析。

表1 不同麥曲的原始數據與質控數據Table 1 Raw and quality control data of different wheat Qu samples

2.2 物種Alpha 指數分析

Alpha 指數能夠反映出樣品中微生物物種的豐富度和均勻度[22]，Chao1、ACE 指數越大，其物種豐度越高，Shannon、InvSimpson 指數越大，其物種均勻度越好。如表2 所示，Chao1、ACE、Shannon 及InvSimpson 指數均為HJ100>HJ200>PTMQ，表明物種豐富度及均勻度均為HJ100>HJ200>PTMQ。周恒剛[6]指出，添加中藥制曲，對有害菌有較強的抑制作用，而對功能菌無害，還可促進某些功能菌生長與酶代謝。吳瓊燕[9]以桑葉及辣蓼制曲，發現其能夠促進根霉菌的生長，同時提升酒曲的糖化能力。黃精系藥食同源物品，研究表明中藥益生元能夠促進腸道微生態平衡[23]。結合前人的研究分析，HJ100 的物種豐富度與均勻度更高，應是與黃精的引入抑制雜菌，同時促進了麥曲中多種功能微生物生長有關。

表2 不同麥曲樣品的Alpha 指數表Table 2 Alpha index table of different wheat Qu samples

2.3 物種差異及組成分析

2.3.1 物種差異分析 主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）通過保留對樣品特征貢獻最大的成分而形成降維效果，可以直觀地展示樣品間的差異[24]。以不同酒曲排名前十的屬水平優勢物種的相對豐度做PCA 分析如圖1：第一和第二主坐標分別能夠貢獻樣品信息量的82.1%及11.17%，能夠有效地反映出樣品間的差異。HJ100、PTMQ 及HJ200在PCA 分析中完全分離，其中HJ200 與PTMQ 相距較近，而HJ100 與PTMQ 及HJ200 分屬于不同象限內，相距較遠表明三個酒曲的優勢微生物組成具有差異性，但HJ200 與PTMQ 差異較小。為了可視化PTMQ、HJ100 及HJ200 中屬水平優勢物種的豐度差異，作屬水平聚類熱圖如圖2 所示。每個方塊代表一個優勢屬，顏色從橙色至藍色豐度占比依次增大。整體的顏色分布表明，不同酒曲中的優勢屬的豐度占比具有較大的差異性，PTMQ 與HJ200 顏色分布趨于一致，表明二者物種豐度占比相似性較高，僅在Aspergillus間有一定差異性。而與PTMQ 和HJ200相比，HJ100 在Rhizopus、Puccinia、Pantoea、Klebsiella、Aspergillus、Limosilactobacillus、Rasamsonia、Paecilomyces中均有較大差異。因此將PTMQ 與HJ200 聚為一類，HJ100 單獨聚為一類，與上述PCA分析結果一致。

圖1 不同麥曲的PCA 分析圖Fig.1 PCA analysis of different wheat Qu

圖2 屬水平聚類熱圖Fig.2 Clustering heat map at genus level

2.3.2 物種組成分析 如圖3 所示，種水平微生物物種注釋中，PTMQ 共注釋出961 種，HJ100 注釋出1506 種，HJ200 注釋出1110 種，進一步表明HJ100物種多樣性最高。其中PTMQ、HJ100 及HJ200 共有種為695 個，分別占其注釋物種總數的72.32%、46.15%及62.61%。從相似物種占比來看，HJ100 的物種組成依然與PTMQ 及HJ200 具有較大差異，而PTMQ 與HJ200 則具有較高相似程度的物種組成。

圖3 種水平維恩圖Fig.3 Venn diagram at species level

不同酒曲的屬水平物種組成見圖4。從整體上看HJ100 相較于PTMQ 與HJ200，各物種豐度占比較為均勻，具有更高的均勻度。其中，曲霉屬（Aspergillus）、裂殖酵母屬（Paecilomyces）、拉桑索尼亞菌屬（Rasamsonia）均為PTMQ 與HJ200 占比前三的物種，青霉屬（Penicillium）、塔拉菌屬（Talaromyces）、檸檬酸乳桿菌屬（Limosilactobacillus）次之，盤狀菌屬（Pantoea）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）豐度占比最低。而HJ100 因物種均勻度高緣故，Aspergillus、Paecilomyces、Rasamsonia、Limosilactobacillus、Rhizopus、Klebsiella、Pantoea及Puccinia的占比均較高，僅Penicillium和Talaromyces占比最低。

圖4 屬水平堆疊柱狀圖Fig.4 Stacked column at genus level

不同酒曲的種水平堆疊柱狀圖見圖5。變形酵母菌（Paecilomyces varioti）和桿狀拉桑索尼亞菌（Rasamsonia emersonii）在PTMQ 與HJ200 中占比最高，黑曲霉菌（Aspergillus hancockii）次之，龐氏檸檬乳桿菌（Limosilactobacillus pontis）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）及聚合盤狀菌（Pantoeaagglomerans）等占比較低。而Paecilomyces varioti、Rasamsonia emersonii、Limosilactobacillus pontis、Pantoea agglomerans、產孢根霉菌（Rhizopus microsporus）及紋狀芽孢桿菌（Puccinia striiformis）在HJ100 中占比均較高，僅肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）等豐度占比較低。

圖5 種水平堆疊柱狀圖Fig.5 Stacked column at species level

值得注意的是，相較于PTMQ 與HJ200，HJ100具有更高豐度的Rhizopus及Rhizopus microsporus，達到了極顯著差異的水平（P<0.01，見圖6）。同時HJ100 還具有較高豐度的Aspergillus hancockii及Aspergillus novofumigatus，二者均屬曲霉屬。此前的部分研究在進行酒曲物種分析中也鑒定出了Pantoea、Aspergillus及Rhizopus等優勢屬[1,25]，同時LIU 等[26]在紅曲中也鑒定出了Rhizopus microsporus，屬于根霉屬，與本研究所鑒定出的物種有部分相同。據報道[27]Aspergillus（曲霉屬）可產生各種胞外酶（淀粉酶、蛋白酶及果膠酶等），在發酵前期，其代謝的胞外酶將釀造原料中的淀粉及蛋白等大分子物質分解為可供微生物利用的小分子糖類和氨基酸，同時使酵母可利用分解生成的糖類物質生產酒精，保障了微生物的養分生長需求。Rhizopus（根霉屬）也可產出類似的胞外酶，同時產出有機酸和酯類芳香物質，對黃酒的風味品質具有重要貢獻[27]，因此Rhizopus及Aspergillus屬微生物是酒曲中極為重要的功能菌。從這一點來看，HJ100 可能將因物種均勻度高和具有高豐度的產胞外酶物種，而具有更為優秀的分解原料中淀粉及蛋白質等物質的能力。

圖6 不同麥曲根霉物種差異分析Fig.6 Analysis of the differences in the rhizoctonia species of the different wheat Qu

產生此種差異的原因可能是添加2.5%質量分數的黃精促進了根霉類微生物的生長，使其在酒曲中復雜的微生物群落組成中具有生長優勢，進而能夠競爭更多資源用于自身生長繁殖成為優勢菌。但添加5%質量分數的黃精卻使其豐度降低，可能是5%質量分數的黃精中含有更多的生物堿及酚類等物質，抑制了其生長，使其在酒曲成型后期未能生長為優勢菌，而造成豐度降低。綜上，以中藥為原料制曲時，要在一定范圍內添加才能起到促進酒曲中根霉類微生物的生長，進而提升酒曲中糖化酶等胞外酶的含量，達到提升酒曲品質的目的。

2.4 功能注釋

2.4.1 KEGG 功能注釋分析 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是一個有關生物系統較完善的數據庫，整合了基因組、化學物質和系統功能信息。其包括：生物體系統（Organismal Systems）、代謝（Metabolism）、人類疾病（Human Diseases）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環境信息處理（Environmental Information Processing）及細胞過程（Cellular Processes）6 個模塊。如圖7 所示，HJ100 與人類疾病相關的基因豐度占比最低，其次為HJ200，PTMQ 占比最高，此類基因豐度過高，可能會影響成品酒的安全性。三者均以代謝模塊為絕對優勢功能（豐度占比均>50%），表明酒曲內部微生物代謝活動較為旺盛，為黃酒風味的形成提供了基礎。但HJ100 基因豐度在代謝功能模塊占比稍低，而PTMQ 與HJ200 的相對豐度則基本一致，代謝功能是微生物生命活動的基礎，包括脂質代謝和蛋白質代謝等，能夠將原料中的營養物質分解消耗供自身生長繁殖，同時生產新的次級代謝產物，對成品黃酒的整體品質具有重要影響[28]。然而過度的代謝活動會進一步消耗釀造過程中的營養物質，使成品酒中的總糖、氨基酸及功能性多糖等物質含量降低，也因風味前體物質的減少而使風味化合物的多樣性及豐富性降低，從而降低成品酒的整體品質[29]。因此，從這一點看，HJ100 中有關“代謝”的基因比PTMQ 及HJ200稍低，應該擁有平衡微生物生長和酒體品質的潛力。在生物體系統、遺傳信息處理、環境信息處理和細胞過程基因模塊中，HJ100 的相對含量相較于HJ200和PTMQ 具有更高的均勻度，有利于多菌種在發酵過程中形成穩定的微生物發酵體系，不易造成因某一物種豐度過高而搶占其他有益菌的生存空間及資源，從而造成一家獨大，發酵不完全的局面[30]。

圖7 KEGG 一級功能基因豐度圖Fig.7 Abundance of functional genes about KEGG at level first

KEGG 二級功能包括碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）及運輸和分解代謝（Transport and catabolism）等多種模塊。如圖8 所示，PTMQ、HJ100 和HJ200 菌在“總覽和全局（Global and overview maps）”基因模塊中具有較高的豐度占比，此模塊與淀粉及蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝及酸類代謝等有關，是發酵過程中重要的代謝途徑。此外，在碳水化合物代謝、翻譯及信號傳導等基因模塊中，HJ100 具有更高的均勻度。既能夠保證碳水化合物代謝相關基因數量，又不會因缺少其他相關基因而造成酒體某一性質過強，導致酒體品質不協調的問題。唐鰻秋等[30]在8 種傳統酒曲中也鑒定出了高豐度的碳水化合物代謝及氨基酸代謝優勢功能，與本研究具有相似之處。可能是酒曲中的優勢微生物通常為酵母、霉菌類，該類微生物在酒曲中進行活躍的生命代謝活動，產出釀造所需的淀粉酶、蛋白酶等與碳水化合物代謝及氨基酸代謝相關的胞外酶，因而酒曲中鑒定出的優勢功能通常與代謝有關。

圖8 KEGG 二級功能基因豐度圖Fig.8 Abundance of functional genes about KEGG at level second

2.4.2 CAZy 功能注釋分析 CAZy（Carbohydrate-Active enZYmes Database）是碳水化合物活性酶相關的專業數據庫，內容包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關酶系家族。其包含五個主要分類：糖苷水解酶（GlycosideHydrolases，GHs）、糖基轉移酶（GlycosylTransferases，GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases，PLs）和糖類酯解酶（Carbohydrate Esterases，CEs）、氧化還原酶（Auxiliary Activities，AAs）[31]。

如圖9 所示，PTMQ、HJ100 和HJ200 在CAZy庫中均注釋出相當數量的與GHs、GTs、CEs 及AAs 相關的基因。基因數量較高的有GTs 和CEs，更高的為GHs，而最高的為AAs。

圖9 CAZy 注釋基因數量圖Fig.9 Abundance of genes about CAZy noting

AAs 包括氧化酶和還原酶，能夠催化物質間的氧化還原作用[32]。HJ100 在AAs 基因模塊中數量最低，說明其氧化酶和還原酶的含量較低，從而推斷其內好氧菌數量較少，在封閉的發酵體系內具有優勢。

而GTs[33]能夠催化糖類物質連接至不同的受體（蛋白、核酸等）上，糖基化后的產物具有一定的生物活性功能，如由糖基轉移酶催化生產的糖苷類抗生素，被廣泛用于抗菌和抗腫瘤[34]。HJ100 中GTs 的基因數量最高，其次為HJ200，PTMQ 數量最低，因而HJ100 中應該具有更高含量的糖基轉移酶，保證了糖基化活性產物的生成，可能將促使成品黃酒中生成含量更為豐富且多樣性的活性物質。

GHs 能夠水解糖苷健，以內切或外切的方式水解糖類化合物[35-36]，是微生物將淀粉等大分子糖類物質降解供自身生長繁殖的基礎，同時通過此類酶的作用，將部分原料水解成具有生物活性的小分子糖等物質，是保證成品酒活性功能的重要物質。HJ100 的GHs 基因數量，遠大于PTMQ 與HJ200，說明HJ100酒曲中應該具有更高含量的GHs，因而可能具有更強的分解淀粉及大分子糖類物質的能力。王國崢等[37]在三個不同輪次的大曲中，均鑒定出了高豐度的GHs，本研究中3 個麥曲的GHs 豐度為第二高，說明不同的類型的酒曲中優勢功能基因是存在差異的，但主要優勢功能還是與GHs 有關。可能是不同類型酒曲的生產均以高淀粉及蛋白含量原料為主，導致能夠產GHs 利用淀粉供自身生長繁殖的微生物最終成為酒曲中的主要優勢菌，因而不同類型的酒曲中與GHs 有關的功能基因基本處于絕對優勢地位。

根霉屬類微生物是酒曲中糖化酶的主要生產者之一，因此GHs 的數量與根霉、曲霉及可產出糖化酶的微生物高度相關。物種組成分析中HJ100 注釋出了最高豐度的根霉屬類微生物，其次為PTMQ，后為HJ200。因此，在HJ100 中GHs 的數量最高，PTMQ 次之，HJ200 最低。可能與2.5%質量分數的黃精促進了根霉屬類微生物的生長繁殖，使其成為酒曲中的主要優勢菌，而5%質量分數的黃精因含有過多的生物堿等抑菌成分而抑制了其生長，致其后期未能成為優勢菌有關。

2.4.3 SEED 功能注釋分析 SEED Subsystem 是國際上知名的功能分類數據庫，為RAST（Rapid Annotation using Subsystem Technology）的默認數據庫。如圖10 所示，在SEED 一級功能中，分別為蛋白質代謝（Protein Metabolism）、碳水化合物（Carbohydrates）、氨基酸及其衍生物（Amino Acids and Derivatives）及細胞壁和細胞膜（Cell Wall and Capsule）等10 大模塊。

圖10 SEED 一級功能基因豐度圖Fig.10 Abundance of functional genes about SEED at level first

總體而言，HJ100 在10 個基因模塊中，相對豐度占比之和最高，超過20%，遠大于HJ200 與PTMQ之和，HJ200 次之，為PTMQ 的兩倍。其中與蛋白質代謝、碳水化合物、氨基酸和衍生物有關的基因，在HJ100 中的數量最高，其與成品酒的品質直接相關，蛋白質和氨基酸代謝關乎成品酒的滋味、口感，碳水化合物代謝與酒精和小分子糖的生成有關。此外，HJ100 中還具有較高數量的與輔劑、維生素、修復組、色素，細胞壁和細胞膜等相關的功能基因，在微生物生長繁殖中發揮著重要作用，保障著發酵進程的順利進行，而PTMQ 和HJ200 相關基因相對豐度占比較小，遠低于HJ100。

可能是添加2.5%質量分數的黃精（HJ100）促進了與蛋白質代謝、碳水化合物、氨基酸和衍生物功能有關微生物的生長，使此類微生物快速生長為酒曲中的優勢菌，因而相關基因數量相較于PTMQ 與HJ200 具有更大的優勢。

2.5 釀造驗證實驗分析

如表3 所示，HJ100 所釀造的黃酒，在總糖、多糖及氨基酸態氮含量這3 個指標上均明顯高于PTMQ 與HJ200 所釀的黃酒，此前的物種注釋中，在HJ100 鑒定出最高豐度的Rhizopus（根霉屬）及較高豐度的Aspergillus（曲霉屬），此類微生物可產出大量對淀粉、蛋白質具有分解作用的淀粉酶及蛋白酶等胞外酶，因此HJ100 中可能存在更高含量的相應酶類物質，使得在釀造過程中原料中的淀粉及蛋白質等物質被分解得更為徹底，除了用于發酵外，則會剩余更多的多糖及氨基酸，這可能是HJ100 成品黃酒的總糖、多糖及氨基酸態氮含量均優于PTMQ 及HJ200 的主要原因。

表3 不同麥曲所釀造成品酒的指標Table 3 Indicators of the finished wine made from different wheat Qu

此外，功能注釋中HJ100 展現出與蛋白質代謝、碳水化合物代謝、氨基酸及其衍生物代謝相關的最高豐度功能基因，可能其物種組成中有較多的優勢微生物與淀粉及蛋白質分解代謝相關，進一步解釋了上述結果。但在酒精含量上，三者并無顯著差異（P>0.05），表明3 個麥曲的發酵能力相當，可能與黃精的添加對酵母類微生物無抑制作用有關，說明在5%質量分數范圍內以黃精為原料制作麥曲，并未影響發酵進程，且能夠促進麥曲中Rhizopus及Aspergillus功能菌的生長，提升其在麥曲中的豐度。

3 結論

本研究以質量分數分別為2.5%（HJ100）和5%（HJ200）的黃精為原料制作麥曲，與未添加黃精的麥曲相比，不同黃精添加量均能提升麥曲的物種豐富度和均勻度，但添加2.5%的效果更好。此外，添加2.5%質量分數的黃精促進了麥曲中曲霉屬和根霉屬類真菌的生長，使得麥曲中與碳水化合物代謝、蛋白質與氨基酸衍生物代謝有關的功能基因豐度得到提升，釀造實驗中不同麥曲理化指標的差異性驗證了此論點。綜上，添加2.5%質量分數的黃精制曲可以提升麥曲的品質。

本研究為藥食同源物質在酒曲中的使用量提供了理論支持，同時為黃精的開發提供了新的途徑。但未對3 個不同麥曲釀造的黃酒進行風味分析，未來可通過風味代謝組學技術分析其風味組成，探究其對黃酒風味的影響。