茶皂素及槐糖脂對紫草素脂質納米粒子形成和穩定性的影響

何 潔，彭盛峰，張軍兵 ，劉 偉

（1.南昌大學食品學院，江西南昌 330047；2.江西丹霞生物科技股份有限公司，江西鷹潭 335000）

紫草素（Shikonin）是從紫草根中提取出來的天然紫紅色疏水性色素，同時也是紫草這種傳統中草藥中的主要活性成分[1]，具有多種生理和藥理活性，包括傷口愈合、抗炎、抗菌、抗癌、抗病毒[2-4]等。此外，紫草素還常用在食品[5]、化妝品[6]和紡織品[7]中。在食品工業中作為天然著色劑使用，最大添加量為0.1 g/kg。由于其對pH 具有較好的靈敏性，在酸性條件下呈紅色，在堿性條件下呈藍色，近年來，已成為pH 響應型食品包裝顯色指示劑[8-10]。然而，由于紫草素自身不穩定，限制了其應用場景與范圍。從結構上來看，紫草素的分子結構式為5,8-二羥基-2-（（1R）-1-羥基-4-甲基-3-戊烯基）-1,4-萘醌[11]，易發生化學反應，對光、熱和堿敏感，這是造成紫草素不穩定的主要原因。另一個問題是紫草素是疏水性的，水溶性很低。這兩個問題是目前阻礙紫草素這類多酚應用的主要因素[12]。

食品膠體遞送系統包括脂質體[13-14]、乳液[15]、納米粒子[16-18]、膠束[19]和納米復合物[20-22]等，是解決親脂活性物質水溶度低和穩定性差最有效的方法之一，且已用于多種生物活性化合物的包封和保護。納米脂質體由于粒徑達到納米級別，因此具有納米粒子的效應，也被稱為脂質納米粒子，具有生物利用度高、穩定性高等優點[23]，但由于磷脂穩定性差，脂質體膜易受外界影響而被破壞[24]。表面活性劑能夠促進膠體粒子的形成，并對膠體粒子的穩定性具有一定作用，這是因為表面活性劑會包裹在粒子周圍，在粒子之間產生強烈的靜電和空間斥力[25]。根據之前的研究，發現使用茶皂素和槐糖脂包埋姜黃素[26-27]和紫草素[28]，提高了其穩定性和生物利用率。在現代食品加工中，人們往往更傾向于使用天然原料。因此，本文選取兩種天然表面活性劑茶皂素和槐糖脂，考察對其紫草素脂質納米粒子的形成、穩定性的影響。近年來，由pH 驅動法制備的多酚納米顆粒（主要是姜黃素），因其負載能力高、穩定性好和生物利用度高[29]而備受關注。同時，pH 驅動法操作簡單、快速、不使用有機試劑，是一種有潛力的食品包埋技術。當pH 大于多酚酚羥基基團電解離常數時，酚羥基去質子化，多酚分子帶電量上升，使得其溶于堿液。當多酚堿液與脂質體溶液共混并中和后，酚羥基質子化失去電荷而重新變為疏水，在疏水作用力驅動下，多酚分子進入脂質體囊泡中，實現多酚脂質體的負載[13]。紫草素是一種多酚類物質，與姜黃素相似帶有兩個酚羥基，紫草素在疏水作用下進入脂質體的疏水膜層中，因此可以采用此技術實現主動包埋[28]。

綜上所述，本研究的主要目標是通過pH 驅動法制備負載紫草素的脂質納米粒子，探討茶皂素和槐糖脂對紫草素脂質納米粒子形成和穩定性的影響，提高紫草素水溶解度、穩定性和生物利用率，為紫草素在食品等領域的應用拓展提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫草素粉末 95%，陜西文迪生物科技有限公司；卵磷脂 S75，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；茶皂素 皂素20%～35%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；槐糖脂 西安博聯特化工有限公司；乙醇、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等 任何其他化學試劑均為分析純。

M-110P 高壓微射流 美國Microfluidics 公司；U-T1810 紫外可見分光光度計 上海屹譜儀器制造有限公司；Zetasizer Nano ZSP 動態光散射電泳儀英國馬爾文公司；FD-1-50 凍干機 北京博醫康實驗儀器有限公司；NANOSURF/C300 原子力電鏡 美國BD 公司；D8 AdvanceX 射線衍射儀 德國布魯克公司；Nicolet IS10 傅立葉紅外光譜儀 美國賽默飛公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫草素脂質納米粒子的制備

1.2.1.1 制備方法 紫草素脂質納米粒子是由卵磷脂添加天然表面活性劑高壓均質混合后，采用pH 驅動法包埋紫草素而制成。參考之前的方法并加以改進[13,26-27]，首先將卵磷脂與不同質量天然表面活性劑（茶皂素或槐糖脂）混合攪拌均勻分散于磷酸鹽緩沖液（pH6.5,5 mmol/L）中，使溶液中卵磷脂質量分數為1%，茶皂素（或槐糖脂）質量分數分別為0%、0.1%、0.2%、0.5%和1%。待分散完全形成均一體系后，將溶液通過微射流運行三次，運行壓力為120 MPa，得到天然表面活性劑修飾的空白脂質納米粒子。然后將紫草素粉末完全溶解于0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，按照所需比例添加到空白脂質納米粒子溶液中，將混合溶液pH 迅速調至6.5，最終混合液中紫草素濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，置于室溫下攪拌平衡0.5 h 后，于8000 r/min 離心30 min 去除未包埋的紫草素顆粒，得到不添加天然表面活性劑的紫草素脂質納米粒子（Shikonin lipid nanoparticles，SLNP）；茶皂素修飾的紫草素脂質納米粒子（Saponin modified shikonin lipid nanoparticles，Sap-SLNP）；槐糖脂修飾的紫草素脂質納米粒子（Sophorolipid modified shikonin lipid nanoparticles，Sop-SLNP）。將相同質量紫草素粉末直接溶于磷酸鹽緩沖液的游離紫草素懸浮液設置為對照組。

1.2.1.2 包封率與負載率測定 使用紫外可見分光光度計在516 nm 處測量紫草素吸光度A，繪制紫草素標準曲線為A=0.0223C-0.001（R2=0.9999），C 為紫草素質量濃度，表明紫草素樣品在5～40 μg/mL 濃度范圍內具有良好的線性關系。將制備好的樣品通過8000 r/min 離心10 min 去除未包埋的紫草素晶體，取上清液用乙醇稀釋5～40 倍測量紫草素吸光度，對應包埋的紫草素質量濃度。計算包封率與負載率公式如下：

式中：C1表示離心后上清液紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；C0表示制備樣品添加的紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；M1表示離心后上清液中紫草素的質量，mg；M0表示制備時添加紫草素的質量，mg；M 表示卵磷脂與天然表面活性劑總質量，mg。

1.2.2 紫草素脂質納米粒子的結構表征

1.2.2.1 粒徑與電位測定 用磷酸鹽緩沖液（pH6.5，5 mmol/L）將樣品稀釋10 倍后使用動態光散射電泳儀在25 ℃下測定紫草素脂質納米粒子的平均粒徑、粒徑分布和Zeta 電位。最終結果以三個樣本的平均值和標準差表示，每個樣本測量三次。

1.2.2.2 原子力電子顯微鏡（AFM）分析 用超純水將樣品稀釋800 倍后取10 μL 滴在新剝開的硅片表面，自然風干。設置硅懸臂在攻絲模式的力常數為0.58 N·m-1，拍攝樣品的微觀結構[30]。

1.2.2.3 X 射線衍射（XRD）分析 測量前將樣品在10 Pa，-60 ℃條件下冷凍干燥48 h 后研磨成粉末狀，設置發散狹縫為1°，入射光束的接收狹縫為0.1 mm。在5°～90°的2θ角范圍內進行掃描，掃描速度為2°/min[31]。

1.2.2.4 傅立葉變換紅外光譜（FTIR）分析 將樣品在10 Pa，-60 ℃條件下冷凍干燥48 h 后按質量比1:100 加入KBr 粉末研磨并擠壓成片，設置光譜掃描波數范圍為4000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1[32]。

1.2.3 紫草素脂質納米粒子的穩定性研究

1.2.3.1 熱和光穩定性 將樣品分裝于EP 管中，將一批樣品置于80 ℃水浴鍋中分別加熱0、10、20、30、40、50、60 min 后置于冰水中迅速冷卻至室溫，另一批樣品置于紫外燈光下連續照射0、0.5、1、2、3、6 h 后取出，分別取適量溶液用乙醇稀釋20 倍測量紫草素吸光度，通過計算紫草素的保留率，考察加熱不同時間以及紫外光照射不同時間對紫草素脂質納米粒子的影響。計算紫草素保留率公式如下：

式中：CH（L）表示樣品加熱（或紫外光照射）后紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；C0表示初始樣品紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL。

1.2.3.2 pH 和離子穩定性 制備一系列不同pH 的磷酸緩沖溶液，將樣品添加至不同pH 緩沖溶液中，使最終溶液pH 分別為2、3、4、5、6、7，在室溫下平衡2 h，通過測量樣品粒徑大小，考察pH 對紫草素脂質納米粒子的影響。制備一系列不同離子濃度的氯化鈉溶液，將樣品添加至不同離子濃度氯化鈉溶液中，使最終離子濃度分別為0、100、200、500、800、1000 mmol/L，在室溫下平衡2 h，通過測量樣品粒徑大小，考察離子濃度對紫草素脂質納米粒子的影響。

1.2.3.3 凍融穩定性 將樣品置于-20 ℃冰箱中冷凍4 h 取出常溫下溶解后繼續放入冰箱冷凍，連續重復三次，冷凍總時長為12 h。通過測量解凍后樣品粒徑大小和包封率來考察反復凍融對紫草素脂質納米粒子的影響。取解凍后樣品于8000 r/min 離心10 min 測量紫草素吸光度。計算紫草素包封率公式如下：

式中：CF表示凍融樣品離心后紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；C0表示初始樣品紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL。

1.2.3.4 貯藏穩定性 將樣品置于室溫中貯藏4 周，通過測量樣品粒徑大小和保留率來考察貯藏時間對紫草素脂質納米粒子的影響。每周定時取適量溶液測量樣品粒徑大小以及8000 r/min 離心10 min 測量紫草素吸光度。計算紫草素包封率公式如下：

式中：CS表示貯藏樣品離心后紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；C0表示初始樣品紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL。

1.2.4 體外消化 靜態模擬胃腸道消化實驗可以考察紫草素經過消化被人體吸收利用情況。具體過程參考了之前對INFOGEST 方法進行的改進[27,33]。模擬口腔消化：將含有3 mg/mL 黏膜蛋白的口腔模擬液預熱至37 ℃，然后與紫草素脂質納米粒子按1:1體積比混合（7.5 mL+7.5 mL）。然后將混合物調至pH6.8，并在37 ℃下以100 r/min 的轉速在振蕩培養箱中放置10 min。模擬胃消化：將含有3.2 mg/mL胃蛋白酶的模擬胃液提前45 min 放入37 ℃水浴鍋中活化。與通過口腔階段的樣品按1:1 體積比混合（15 mL+15 mL），將混合物調至pH 2.5，并在37 ℃下以100 r/min 的轉速在振蕩培養箱中放置2 h。模擬小腸消化：將模擬腸液與脂肪酶（24 mg/mL）、胰酶（24 mg/mL）、膽鹽（54 mg/mL）溶于提前配好的5 mmol/L PBS（pH7.0）中，提前1 h 放入37 ℃水浴鍋中活化。將通過胃階段的樣品調pH 至7.0 后加入1.5 mL 腸液，3.5 mL 膽鹽，2.5 mL 胰酶和2.5 mL脂肪酶。將混合物pH 再一次調至7.0，在37 ℃下以100 r/min 的轉速在振蕩培養箱中放置2 h，期間要將pH 保持在7.0。體外消化實驗模擬了樣品依次經過口腔、胃、腸三個消化階段后變成食糜，在此過程中經過酸、堿和酶的作用會損失一部分紫草素，食糜在4 ℃下經過15000 r/min 離心30 min 后得到的上清液被認為是包含了人體可吸收的紫草素的混合膠束部分。分別測量初始樣品、食糜中和膠束中紫草素吸光度。計算紫草素保留率和生物可接受率公式如下：

式中：CC表示食糜中紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；C0表示初始樣品紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL；CM表示膠束中紫草素吸光度對應的濃度，mg/mL。

1.3 數據處理

所有實驗至少重復3 次，最終結果以平均值±標準差的形式呈現，采用統計學分析軟件SPSS Statistics 20 對數據進行分析，通過單因素方差和t檢驗分析數據間是否存在顯著性差異，不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 紫草素脂質納米粒子的構建

如圖1 所示，當不添加天然表面活性劑時，紫草素濃度從0.1 mg/mL 升至0.6 mg/mL 時，SLNP 的包封率由98.86%突降至47.20%。據報道[25]，表面活性劑具有穩定納米粒子的作用，推測在磷脂中添加表面活性劑能提高紫草素脂質納米粒子的包封率和負載量，因此選取了兩種天然表面活性劑茶皂素和槐糖脂。當紫草素濃度升至0.8 mg/mL 時，Sap-SLNP和Sop-SLNP 的包封率仍保持在95%左右。三種紫草素脂質納米粒子都在0.4 mg/mL 處具有一個拐點，室溫放置3 d 后包封率仍在0.4 mg/mL 處明顯下降，此時納米粒子中紫草素濃度為穩定狀態的最高值。因此確定紫草素濃度為0.4 mg/mL。

圖1 紫草素濃度對紫草素脂質納米粒子包封率的影響Fig.1 Effect of concentration of shikonin on encapsulation rate of shikonin lipid nanoparticles

如圖2 所示，天然表面活性劑質量分數達到0.5%及以上時，脂質納米粒子包封率由47%可提高到98%以上，并且室溫放置3 d 后依然具有較高水平；在負載率方面，天然表面活性劑添加量為0.5%時具有最高值，由2.8%提高到5%以上。隨著天然表面活性劑濃度增加至1%，負載率反而下降，說明此時幾乎全部紫草素都已被包埋進脂質納米粒子中，增加天然表面活性劑含量降低了紫草素在納米粒子中的比例，使負載率減小。因此選擇添加0.5%天然表面活性劑作為構建紫草素脂質納米粒子的原料。

圖2 添加表面活性劑對紫草素脂質納米粒子包封率和負載率的影響Fig.2 Effects of surfactant addition on the encapsulation rate and loading rate of shikonin lipid nanoparticles

綜合可得，紫草素脂質納米粒子最終配方為卵磷脂（1%，w/v）和天然表面活性劑（茶皂素或槐糖脂）（0.5%，w/v），紫草素（0.4 mg/mL），此時Sap-SLNP最大包封率為99.01%±0.75%，最高負載率為5.06%±0.18%，Sop-SLNP 最大包封率為98.36%±0.30%，最高負載率為5.16%±0.19%。茶皂素（或槐糖脂）的加入大大提高了紫草素脂質納米粒子的包封和負載能力，一方面是茶皂素（或槐糖脂）具有雙親性，其本身具有較好的吸附疏水性物質的能力[26-27]，另一方面可能是茶皂素（或槐糖脂）與卵磷脂結合參與脂質體膜的形成，使磷脂分子排列更緊密，能容納下更多紫草素而不會泄漏出去。有研究表明，皂苷有類似膽固醇的性質，替代脂質體中的膽固醇后，仍保持脂質體的包封率和穩定性[34]。Singh 等[35]的實驗也表明槐糖脂能與脂質體膜結合。

2.2 紫草素脂質納米粒子的結構表征

2.2.1 粒徑與電位 通過動態光散射電泳儀測定了新制備的紫草素脂質納米粒子的平均粒徑、粒徑分布和Zeta 電位，具體結果見表1。三種納米粒子平均粒徑為65 nm 左右，粒徑分布集中，因此溶液呈現出澄清狀態有較高的透光率。添加天然表面活性劑的粒子粒徑沒有明顯增大，可能是因為包埋材料均通過了微射流處理達到了相同的納米級別。電位為負值表示紫草素脂質納米粒子帶有負電荷，一般情況下，電位絕對值越大，帶有相同電荷粒子之間的靜電斥力越大，納米粒子越不容易發生聚集沉淀，有利于維持體系的穩定[21]。Sap-SLNP 和Sop-SLNP 的電位絕對值均高于SLNP，這是因為添加天然表面活性劑增加了粒子所帶負電荷，也側面反映出Sap-SLNP和Sop-SLNP 具有更好的穩定性。

表1 紫草素脂質納米粒子平均粒徑、粒徑分布指數和Zeta 電位Table 1 Mean particle size,particle size distribution and Zeta potential of shikonin lipid nanoparticles

2.2.2 原子力電子顯微鏡觀察形態 通過原子力電子顯微鏡（AFM）觀測了紫草素脂質納米粒子的微觀形貌。如圖3 所示，三種紫草素脂質納米粒子尺寸大小約為50～100 nm，與動態光散射儀測量結果一致，均呈現出表面光滑，分布均勻的球狀結構，與脂質體的形態相似。其中，SLNP 呈現出更為圓滑的形狀，而Sap-SLNP 和Sop-SLNP 更為尖細，這可能是茶皂素（或槐糖脂）與卵磷脂結合產生的相互作用力使磷脂圓球狀結構發生了變化，納米粒子整體變得更加緊密[36]。

圖3 紫草素脂質納米粒子的AFM 圖像Fig.3 AFM images of shikonin lipid nanoparticles

2.2.3 X 射線衍射（XRD）通過X 射線衍射法獲得了紫草素脂質納米粒子在2θ值（5°～90°）下的晶體衍射圖。如圖4 所示，紫草素在2θ衍射角5°～30°范圍內結晶度高，衍射峰尖銳，而單獨的卵磷脂以及卵磷脂與茶皂素，卵磷脂與槐糖脂在20°的衍射角上只有一個平坦的峰，說明這些原料主要以無定形狀態存在。此外，單獨的卵磷脂在2θ衍射角5°～10°范圍內有尖銳的衍射峰，說明卵磷脂中有晶粒存在，可能是在凍干樣品過程中，由于溫度低于卵磷脂相變溫度導致卵磷脂向結晶狀態轉變，而卵磷脂與茶皂素，卵磷脂與槐糖脂，在此范圍的衍射峰相對強度降低，說明添加茶皂素（或槐糖脂）能抑制卵磷脂晶粒的形成。將紫草素包埋到納米粒子中后，紫草素的特征結晶峰消失了，說明將紫草素包埋在納米粒子疏水區抑制了紫草素的結晶，使紫草素以非晶態形式存在。有研究報道非晶態口服的生物利用度高于晶態口服生物利用度[37]，為開發功能性食品提供了有利條件。此外，在衍射角30°～85°范圍內有規則的結晶峰，這些峰是在制備樣品過程中調pH 時由NaOH 和HCl 中和產生的NaCl 晶體的特征峰。

圖4 紫草素、卵磷脂和天然表面活性劑以及紫草素脂質納米粒子的XRD 圖Fig.4 XRD patterns of shikonin,lecithin and natural surfactant and shikonin lipid nanoparticles

2.2.4 傅立葉變換紅外光譜（FTIR）通過紅外光譜分析紫草素與卵磷脂和天然表面活性劑之間的分子相互作用。如圖5 所示，紫草素的特征峰出現在3252、2920、1610、1447、1342、1204、1066、779 cm-1，分別為O-H 氫鍵、烷基C-H、C=O、芳環和C-O 的拉伸振動[8]。在卵磷脂、卵磷脂與茶皂素（或槐糖脂）的FTIR 光譜中，在3400～3200 cm-1，均有一個寬峰，是O-H 氫鍵拉伸振動的表現；2926 和2857 cm-1兩處峰是烷基CH2對稱與不對稱拉伸，1737 cm-1處的尖峰是卵磷脂-C=O 拉伸振動產生的；1247 cm-1附近的峰值對應了磷脂中PO4磷酸基團。與單獨卵磷脂相比，添加了茶皂素（或槐糖脂）的FTIR 光譜中，在1608 和1064 cm-1附近出現了兩個糖類的特征峰，這與茶皂素（或槐糖脂）結構中帶有糖基有關；同時，1247 cm-1處的峰發生紅移，OH 基團峰的強度和范圍也發生了改變，說明茶皂素（或槐糖脂）與卵磷脂中的磷酸基團發生了相互作用[24]，可能是糖羥基與磷酸基團產生了分子間氫鍵[23]。加入紫草素形成納米粒子后紫草素脂質納米粒子光譜變化不大，說明紫草素與卵磷脂和天然表面活性劑之間沒有形成共價鍵，只有O-H 氫鍵波段部分有移動，說明紫草素與卵磷脂和天然表面活性劑之間形成了氫鍵[9]。而紫草素在1610～779 cm-1處特征峰消失了說明包埋進納米粒子后紫草素的振動拉伸和彎曲受到了限制[22]。

圖5 紫草素、卵磷脂和天然表面活性劑以及紫草素脂質納米粒子的FTIR 光譜圖Fig.5 FTIR spectras of shikonin,lecithin and natural surfactant and shikonin lipid nanoparticles

2.3 紫草素脂質納米粒子的穩定性

2.3.1 熱和光穩定性 紫草素易受熱和光分解，如圖6（A、B）所示，分別經過加熱和光照處理，游離紫草素保留率僅40.92%±6.53% 和53.44%±7.95%，SLNP 的保留率為69.33%±3.04%和77.53%±4.24%，說明脂質納米粒子包埋紫草素起到了一定的保護作用，而Sap-SLNP 和Sop-SLNP 的保留率均在此基礎上進一步提高，熱保留率分別為77.25%±2.29%、80.08%±2.60%，約是游離紫草素的2 倍，光保留率為83.39%±3.75%、82.31%±4.44%，約是游離紫草素的1.6 倍。這說明，添加茶皂素（或槐糖脂）能進一步提高紫草素脂質納米粒子的熱和光穩定性，根據AFM 圖像可能是因為茶皂素（或槐糖脂）的加入使磷脂分子排列更加緊密，粒子整體結構更加緊密[36]，減少了磷脂分子因受熱和光氧化而發生斷裂。

圖6 加熱（A）和紫外光照（B）時間對紫草素脂質納米粒子保留率的影響Fig.6 Effects of heating (A) and ultraviolet illumination (B)on the retention rate of shikonin lipid nanoparticles

2.3.2 pH 和離子穩定性 pH 和離子穩定性考察脂質納米粒子在不同環境及加工條件下的穩定性。如圖7（A）所示，在溶液pH2～7 環境下，SLNP 粒徑在pH 5 及以下逐漸變大，這可能是由于溶液中H+增加使粒子間靜電力減小，從而使納米粒子更易聚集，而Sap-SLNP 和Sop-SLNP 粒徑大小并未發生明顯變化，表明Sap-SLNP 和Sop-SLNP 具有良好的pH 穩定性。如圖7（B）所示，在氯化鈉離子濃度0～1000 mmol/L溶液中，SLNP、Sap-SLNP 和Sop-SLNP 粒徑大小均并未發生明顯變化。結果表明紫草素脂質納米粒子具有良好的pH 和離子穩定性，有利于在不同加工條件下生產。

圖7 pH（A）和離子濃度（B）對紫草素脂質納米粒子粒徑大小的影響Fig.7 Effects of pH (A) and ion concentration (B) on the particle size of shikonin lipid nanoparticles

2.3.3 凍融穩定性 在反復凍融過程中，脂質體中的水分子會結成冰晶，對脂質體膜造成損傷，破壞脂質納米粒子的結構導致內容物泄漏[38]，因此凍融穩定性從包封率與粒徑大小變化兩個方面表征。經過12 h連續三次反復凍融后，SLNP 包封率僅為46.23%±1.42%，這是由于水分子結晶導致磷脂膜破損，紫草素泄漏出來從而降低了包封率，而Sap-SLNP 和Sop-SLNP 包封率分別為87.28%±4.13%、80.95%±7.55%，將近SLNP 的2 倍，說明反復凍融對Sap-SLNP 和Sop-SLNP 結構的破壞損傷小，可能是因為茶皂素（或槐糖脂）含有糖殘基，抑制了水分子的結晶[39]。SLNP 粒徑由（59.35±4.41）nm 增大至（543.38±90.21）nm，而Sap-SLNP 和Sop-SLNP 粒徑分別增大至（101.60±12.60）nm、（148.06±37.07）nm，由圖8可見，經過凍融后，SLNP 明顯變渾濁，而Sap-SLNP和Sop-SLNP 較為清澈，Sap-SLNP 效果更好，與粒徑大小結果一致。這可能是因為茶皂素（或槐糖脂）在凍融過程中起到了保護脂質納米粒子結構的作用[40]，使納米粒子在這個過程中不易被破壞和聚集。

圖8 凍融對紫草素脂質納米粒子包封率和粒徑大小的影響Fig.8 Effect of freezing-thawing on the encapsulation efficiency and particle size of shikonin lipid nanoparticles

2.3.4 貯藏穩定性 脂質體在貯藏過程中易降解、聚集和融合導致包埋物質的泄漏[24]。因此通過檢測紫草素脂質納米粒子在貯藏過程中包封率和粒徑大小來評估其貯藏穩定性。如圖9（A），貯藏4 周后，SLNP 包封率僅為48.38%±1.76%，Sap-SLNP 和Sop-SLNP 的包封率分別降至80.25%±0.78%、74.03%±3.55%，約是SLNP 的1.7 倍，第3 周至第4 周，包封率趨于平穩。由圖9（B）可知，SLNP 粒徑隨著時間增長而變大，這是因為在貯藏過程中磷脂發生聚集導致粒徑變大；而Sap-SLNP 和Sop-SLNP 在貯藏過程中一直保持穩定的粒徑大小，這可能與Sap-SLNP和Sop-SLNP 粒子本身之間產生的較大的靜電斥力有關[21]。結果表明，Sap-SLNP 和Sop-SLNP 表現出良好的貯藏穩定性，茶皂素（或槐糖脂）的加入能使紫草素脂質納米粒子狀態更加穩定，延長貯藏時間。

圖9 貯藏時間對紫草素脂質納米粒子包封率和粒徑大小的影響Fig.9 Effect of storage time on encapsulation efficiency and particle size of shikonin lipid nanoparticles

2.4 紫草素脂質納米粒子的體外消化

紫草素是一種疏水性多酚，因此具有很低的水溶解性，從而導致其生物利用率低。通過保留率和生物可接受率來評估活性物質的體外消化結果。保留率指生物活性物質經過模擬消化后體系中剩余的量[27,41]。紫草素的降解主要是由暴露在中性或堿性水環境引起的，因此通過防止紫草素與周圍的水相接觸來減少降解[28]。由于游離紫草素以晶體形式存在，而納米粒子的尺寸小得多，暴露在水相中的紫草素的表面積要比自由晶體大得多，因此納米粒子中的紫草素可能比較大，晶體中的紫草素更容易降解。如圖10所示，游離紫草素的保留率為86.89%±2.03%，高于紫草素脂質納米粒子，紫草素脂質納米粒子之間保留率相差不大，分別為58.96%±1.72%，55.15%±1.27%和55.67%±1.51%，這可能與納米粒子粒徑尺寸相同有關。生物可接受率指生物活性物質經過模擬消化后溶解在膠束中可用于吸收的比例[27,42]。游離紫草素的生物可接受率僅15.94%±0.85%，通過包埋技術，SLNP 的生物可接受率大幅度提高至42.56%±0.92 %，Sap-SLNP 和Sop-SLNP 的生物可接受率在此基礎上進一步提高至49.15%±1.41%和48.29%±0.66%，將紫草素生物可接受率分別提高到3.08 倍和3.03 倍。一方面是由于經過納米粒子包埋，表面積增加導致紫草素比較大的晶體更易溶解；另一方面，納米粒子中的紫草素是無定形狀態的，比結晶形式更容易溶解。因此利用包埋技術能有效提高紫草素在消化過程中的溶解度，從而達到更易吸收的效果。添加茶皂素（或槐糖脂）后，能進一步提高紫草素的生物可接受率，可能是因為紫草素在單純磷脂中是比較集中存在于磷脂雙分子層的疏水區，而加入的茶皂素（或槐糖脂）可以通過與磷脂結合或者吸附于納米粒子表面增大了紫草素分布范圍，使紫草素無定形形態更加松散，從而更易溶解于水中[27,41]。

圖10 紫草素脂質納米粒子經過體外消化后的保留率與生物可利用率Fig.10 Retention rate and bioaccessibility of shikonin lipid nanoparticles after in vitro digestion

3 結論

本課題采用卵磷脂添加茶皂素或槐糖脂構建紫草素脂質納米粒子，成功制備出了兩種天然表面活性劑修飾的紫草素脂質納米粒子。結果表明，與單純卵磷脂包埋的紫草素脂質納米粒子相比，將卵磷脂和天然表面活性劑（茶皂素和槐糖脂）質量比為2:1 混合制備的紫草素脂質納米粒子能顯著提高脂質納米粒子的包封率（98%以上）和負載率（5%以上），且進一步提高了紫草素脂質納米粒子的環境穩定性。兩種天然表面活性劑修飾的紫草素脂質納米粒子環境穩定性相近，熱穩定性和光穩定性分別約是游離紫草素的2 倍和1.6 倍，在pH2～7 以及離子濃度1000 mmol/L內依然保持較好的穩定性，經過三次反復凍融后粒徑變化不大，包封率仍有85%左右，將近是單純脂質納米粒子的2 倍，并且經過4 周儲藏后粒徑基本不變，包封率仍有80%左右，約為單純脂質納米粒子的1.7 倍，并且顯著提高了紫草素的生物利用率，約是游離紫草素的3 倍。這些研究結果為紫草素的進一步開發利用提供了良好的思路和理論指導，對提高紫草素在功能性食品、膳食補充劑或藥物制劑中的穩定性和生物利用度具有重要意義，并可能促進天然膠體遞送系統的發展。