不同提取方法對井岡蜜柚皮精油組成與性質(zhì)的影響

李 欣，華建新，羅杰洪，王國慶，陳 贛，周愛梅,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性重點實驗室，廣東廣州 510642；2.吉安井岡農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，江西吉安 343016）

柚子（Citrus maxima）為亞熱帶常綠喬木果樹，蕓香科柑橘原生柑橘亞科柚類[1-2]。柚皮是果蔬加工的副產(chǎn)物，而精油是柑橘皮中主要的脂溶性功能成分之一，存在于柑橘果皮的細小分泌腺中，其含量占果皮鮮重的0.5%～2%[3]，研究表明，柚皮精油具有抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤、化痰止咳等功能[4]，在保健品開發(fā)、天然抑菌劑研制、新型藥物制備等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。江西省柑橘品種資源豐富，井岡蜜柚是江西省吉安市當(dāng)?shù)鼐哂械乩泶硇缘蔫制贩N，品質(zhì)極佳，種植規(guī)模不斷擴大，具有良好的市場前景。但隨著柚子加工工業(yè)的快速發(fā)展，形成了大量的柚皮副產(chǎn)物，而存在于井岡蜜柚皮中的精油（Jinggang pomelo peel essential oil，JPPEO）已被報道富含萜烯類、醛類等活性物質(zhì)，利用價值頗高。

目前柚皮精油的提取方法有多種，主要有冷榨法[5]、有機溶劑萃取法[6]、超臨界二氧化碳萃取法[7]和水蒸氣蒸餾法[8]，這些方法各有優(yōu)缺點[9]，其中水蒸氣蒸餾法是最傳統(tǒng)的方法，具有工藝簡單、產(chǎn)量穩(wěn)定、活性成分含量較高、成本低、無污染等優(yōu)點，但是水蒸氣蒸餾法由于提取溫度較高、時間較長，會造成一系列問題，例如破壞熱敏性成分、低沸點成分流失、不易蒸出高沸點成分、香氣完整性受影響等等[10]。本課題組自主研發(fā)的先進技術(shù)——低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)具有操作方便、安全、環(huán)保、提取率較高、提取時間短、可使用食品級安全萃取溶劑且無溶劑殘留等優(yōu)勢，是一種綠色高效的萃取技術(shù)[11]，目前已應(yīng)用于沙姜油[12]、梔子油[13]、佛手精油[14]的萃取，但在柚皮精油提取方面的研究鮮見報道。

精油分析檢測是研究精油功能活性，并對精油進行合理開發(fā)利用的重要工具和手段。精油的理化特性可以作為衡量其品質(zhì)的重要參考，其中包括相對密度、折光指數(shù)、酸值、酯值、碘值等。而植物精油組成成分的分析方法主要包括中紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）[15]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[17]、頂空氣相色譜-離子遷移譜（Headspace-gas chromatography-ion migration chromatography，HS-GC-IMS）[18]幾種方法。其中，GC-MS 是目前應(yīng)用最為普遍的方法[19-20]，該技術(shù)具有靈敏度高、分離程度好、分析速度快等優(yōu)點，但此技術(shù)無法分析鑒定出一些含量少而對風(fēng)味至關(guān)重要的物質(zhì)[21]。GC-IMS 是近年來新興的一種分析方法，該技術(shù)具有樣品無需前處理、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)檢測等多個領(lǐng)域[22]。鮮見兩種方法相結(jié)合應(yīng)用于植物精油成分分析，因此本課題采用此兩種方法進行井岡蜜柚皮精油成分分析，以期為井岡蜜柚皮精油的功能成分鑒定和品質(zhì)鑒別提供新依據(jù)。

基于上述分析，本研究以井岡蜜柚子皮為原料，采用水蒸氣蒸餾法、低溫連續(xù)相變法兩種不同方法制備JPPEO，并以精油得率為主要指標(biāo)，通過單因素和正交試驗確定低溫連續(xù)相變法最佳提取工藝條件，并對兩種提取工藝條件得到的JPPEO 的折光率、相對密度、酸值、酯值這些理化性質(zhì)進行分析，進一步采用FT-IR、結(jié)合GC-MS 和HS-GC-IMS 分析JPPEO的組成，并運用PCA 統(tǒng)計分析方法對其進行組分差異分析，為更好地綜合評價井岡蜜柚的質(zhì)量，合理開發(fā)利用JPPEO 提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

井岡蜜柚干皮 吉安井岡農(nóng)業(yè)生物科技有限公司提供，采集于11 月份；無水硫酸鈉 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；環(huán)己烷 天津富宇有限公司；環(huán)己酮（色譜純）麥克林生物科技有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴混標(biāo) 美國O2Si 公司；正己烷（色譜純）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

水蒸氣蒸餾簡易裝置 河南豫華儀器有限公司；低溫連續(xù)相變萃取裝置 珠海共同機械有限公司；Trace 1300 串聯(lián)TSQ 8000 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有Xcalibur 軟件）美國Thermo 公司；Flavour-Spec?Laboratory Analytical Viewer GC-IMS 聯(lián)用儀（配有分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和三款插件以及GC X IMS Library Search）

德國G.A.S 公司；AL 104 萬分之一電子天平 梅特勒一托利多儀器有限公司；Vertex 70 型傅里葉變換紅外光譜儀、ATR 附件（ZnSe 晶面）德國布魯克有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取井岡蜜柚皮精油 參考湯釀等[23]方法并加以改進。選取井岡蜜柚干皮 80 g，粉碎后與蒸餾水以料液比 1:12（g/mL）的比例混合，裝入1 L 圓底燒瓶中，在160 ℃下加熱至沸騰，從沸騰起計時提取5 h（直到無精油流出）后用正己烷萃取精油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，再用氮吹儀除去殘余正己烷，過0.22 μm 有機膜，得到柚皮精油，封裝后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 低溫連續(xù)相變提取井岡蜜柚皮精油的單因素實驗 以井岡蜜柚精油得率為考察指標(biāo)，對原料顆粒度、萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、解析溫度指標(biāo)進行工藝優(yōu)化。萃取溶劑為正丁烷，將按照原料堆密度0.3 kg/L 填入萃取釜。

1.2.2.1 原料顆粒度對井岡蜜柚精油得率的影響將井岡蜜柚干皮粉碎至20、30、40、50、60 目，在萃取溫度50 ℃，萃取壓力0.8 MPa，解析溫度70 ℃，萃取時間70 min 條件下進行萃取，計算精油得率。

1.2.2.2 萃取壓力對井岡蜜柚皮精油得率的影響將井岡蜜柚干皮粉碎至30 目，萃取壓力分別設(shè)定為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 MPa，在萃取溫度為50 ℃，解析溫度70 ℃，萃取時間70 min 條件下進行萃取，計算精油得率。

1.2.2.3 萃取溫度對井岡蜜柚皮精油得率的影響將井岡蜜柚干皮粉碎至30 目，設(shè)定萃取溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，在萃取壓力0.7 MPa，解析溫度70 ℃，萃取時間70 min 條件下進行萃取，計算精油得率。

1.2.2.4 萃取時間對井岡蜜柚皮精油得率的影響將井岡蜜柚干皮粉碎至30 目，設(shè)定萃取時間分別50、60、70、80、90 min，在萃取溫度50 ℃，萃取壓力0.7 MPa，解析溫度70 ℃條件下進行萃取，計算精油得率。

1.2.2.5 解析溫度對井岡蜜柚皮精油得率的影響將井岡蜜柚干皮粉碎至30 目，設(shè)定解析溫度分別為60、65、70、75、80 ℃，在萃取溫度50 ℃，萃取壓力0.7 MPa，萃取時間60 min 條件下進行萃取，計算精油得率。

1.2.3 低溫連續(xù)相變提取井岡蜜柚皮精油的正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取原料顆粒度為30 目，進一步對萃取溫度、萃取時間、萃取壓力及解析溫度對井岡蜜柚皮精油得率的影響進行正交試驗，試驗設(shè)計因素水平表見表1。

表1 正交設(shè)計試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment design

精油得率按照下式進行計算，實驗重復(fù)3 次。

式中：M1為精油的凈質(zhì)量，g；M2為柚皮的干重，g。

1.2.4 井岡蜜柚皮精油理化指標(biāo)分析 在上述最佳的萃取工藝條件下，利用低溫連續(xù)相變萃取設(shè)備獲取井岡蜜柚皮精油，對其部分理化性質(zhì)進行分析，并與水蒸氣蒸餾提取所得精油進行對比。折光指數(shù)測定參考GB/T5527-2010《動植物油脂 折光指數(shù)的測定》；相對密度的測定參考GB/T 11540-2008《香料相對密度的測定》；酸值測定參考GB/T 14455.5-2008《香料 酸值或含酸量的測定》；酯值的測定參考GB/T 14455.6-2008《香料 酯值或含酯量的測定》。

1.2.5 FTIR 分析 將水蒸氣蒸餾法提取的精油過0.22 μm 濾膜，連續(xù)相變法提取的精油不做處理。

1.2.5.1 儀器參數(shù) 分束器Beamsplitter Setting：KBr，檢測器Detector Setting：RT-DLaTGS，波數(shù)范圍3900～600 cm-1，掃描次數(shù)64，分辨率4 cm-1。

1.2.5.2 采樣方法 設(shè)置采集條件，采集樣品前采集背景，以空氣為背景，采集紅外光譜圖。將精油均勻覆蓋ATR 的晶體凹槽，每個樣品用ATR 附件采集3 張譜圖，經(jīng)自動基線校正后，取平均光譜圖作為樣品紅外光譜圖，保存。

1.2.5.3 譜圖分析 使用Omnic 9.0 軟件（美國塞默爾世爾科技公司）進行紅外光譜采集，存儲，使用TQ Analyst 9.0 軟件進行譜圖處理及建模。

1.2.6 GC-MS 分析 參考湯釀等[23]方法，將20 μL 5 mg/mL 環(huán)己酮、200 μL 2mg/mL 井岡蜜柚皮精油溶于178 μL 色譜級正己烷中，過0.22 μm 有機膜，用于GC-MS 進樣分析。

1.2.6.1 GC 條件 色譜柱：TG-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50 ℃保持2 min，然后10 ℃/min 升溫至110 ℃，3 ℃/min 升至200 ℃，10 ℃/min 升至230 ℃保持5 min。載氣（He）流速1.0 mL/min，進樣量1.0 μL；分流比10:1。

1.2.6.2 MS 條件 質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；四極桿150 ℃；母離子：50～550 m/z；溶劑延遲11.9 min。

1.2.6.3 揮發(fā)性物質(zhì)定性和定量 應(yīng)用軟件內(nèi)置的NISTMS Search 2.0 譜庫對GC-MS 檢測到的揮發(fā)性成分進行鑒定；取相似指數(shù)大于750 為有效數(shù)據(jù)，當(dāng)相似指數(shù)大于750 則認(rèn)定該組分存在于樣品中；用環(huán)己酮作為內(nèi)標(biāo)物確定各種成分的含量；數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示；將井岡蜜柚皮精油與正構(gòu)烷烴（C7～C40）標(biāo)準(zhǔn)品進行GC-MS 分析。結(jié)合基峰、特征離子峰與文獻報道的保留指數(shù)對比進行定性，保留指數(shù)計算公式為：

式中：RIx為待測組分的保留指數(shù)；Tx為化合物X 的保留時間，min，Z 和Z+1 分別為化合物X 出峰前后相鄰正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的碳原子數(shù)，Tz與Tz+1分別為Z 和Z+1 位碳原子對應(yīng)正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

式中：Wi：揮發(fā)性物質(zhì)含量（μg/mL），Ms：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量（mg），Ai：揮發(fā)性物質(zhì)峰面積，As：內(nèi)標(biāo)物的峰面積，M0：井岡蜜柚皮精油質(zhì)量（mg）。

1.2.7 GC-IMS 分析條件

1.2.7.1 頂空進樣條件 頂空孵化溫度80 ℃；孵化時間10 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進樣體積100 μL；進樣針溫度：85 ℃。

1.2.7.2 GC 條件 色譜柱：MXT-5 金屬色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；色譜柱溫60 ℃；載氣為高純N2（純度≥99.999%）；載氣流速程序：初始2 mL/min 保持2 min，在2～10 min 線性增至10 mL/min，在10～20 min 線性增至100 mL/min，在20～30 min 線性增至 150 mL/min 后保持10 min。

1.2.7.3 IMS 條件 離子源為氚源（6.5 keV）；正離子模式；漂移管長度9.8 cm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移氣流速150 mL/min（高純氮氣，純度≥99.999%）；漂移管溫度45 ℃[24]。

1.2.7.4 揮發(fā)性物質(zhì)定性和定量 利用 GC-IMS 設(shè)備自帶儀器分析軟件（Laboratory Analytical Viewer（LAV）和插件（Reporter、Gallery Plot），以及 GC-IMS Library Search 定性分析軟件）對精油的揮發(fā)性成分進行采集和分析。用峰面積歸一化法確定各種成分的相對含量；同一精油樣品的揮發(fā)性成分含量以三次結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean values±SD）表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示測定的理化參數(shù)值；選用 SPSS 25.0（美國IBM 公司）進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用t檢驗進行三組間差異顯著性分析，P<0.05，差異顯著；采用獨立樣本t檢驗進行兩組間差異顯著性分析，在滿足方差齊性的條件下，Sig.（雙尾）<0.05，具有顯著性；Dynamic PCA 插件進行動態(tài)PCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫連續(xù)相變提取井岡蜜柚皮精油的單因素實驗

2.1.1 原料顆粒度對井岡蜜柚皮精油得率的影響從圖1 可知，井岡蜜柚皮原料顆粒度在20～30 目時，精油得率呈增大趨勢（P<0.05）。當(dāng)原料顆粒度達到30 目時，JPPEO 得率達到最大，為9.38‰。而隨著目數(shù)不斷增大，JPPEO 得率反而呈下降趨勢（P<0.05）。這主要是因為原料顆粒越小，使得萃取溶劑與原料的接觸面積越大，但目數(shù)過大時易堵塞濾網(wǎng)而影響JPPEO 的有效萃取，這與楊慧等[10]提取佛手精油的原料粒度一致。因此，最佳原料粒度為30 目。

圖1 原料顆粒度對井岡蜜柚皮精油得率的影響Fig.1 Effect of particle size of raw materials on extraction rate of essential oil from JPPEO

2.1.2 萃取壓力對井岡蜜柚皮精油得率的影響 萃取壓力是改變低溫連續(xù)相變?nèi)軇τ椭芙饽芰Φ闹匾獏?shù)[25]。從圖2 可知，在萃取壓力從 0.4 MPa升至 0.7 MPa 時，JPPEO 得率出現(xiàn)顯著增大的趨勢（P<0.05），在萃取壓力為0.7 MPa 時，JPPEO 得率達到最大，達到9.9‰，隨著壓力升至0.8 MPa，JPPEO得率反而下降（P<0.05）。通過加大壓力可以增大溶劑對油脂的溶解能力。但壓力過大時，原料堆密度過大，導(dǎo)致萃取溶劑流速減小。因此，最佳萃取壓力為0.7 MPa。

圖2 萃取壓力對井岡蜜柚皮精油提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on extraction rate of JPPEO

2.1.3 萃取溫度對井岡蜜柚皮精油得率的影響 由圖3 可知，當(dāng)萃取溫度從40 ℃升至50 ℃時，JPPEO得率出現(xiàn)顯著增加趨勢（P<0.05）。萃取溫度為 50 ℃時，JPPEO 得率最高，達到10.15‰。而當(dāng)萃取溫度升至60 ℃時，得率開始下降（P<0.05）。溫度升高，萃取溶劑擴散速率增加，更快地穿透JPPEO，但溫度過高時，萃取溶劑正丁烷易汽化，其溶解量降低[26]，使JPPEO 得率降低。黃煒超[27]研究發(fā)現(xiàn)萃取溫度在40～55 ℃之間，佛手精油的有效成分的相對百分含量呈上升趨勢，溫度過高導(dǎo)致易揮發(fā)成分損失。萃取溫度為50 ℃時，井岡蜜柚皮精油的有效成分也避免被破壞。因此，最佳萃取溫度為50 ℃。

圖3 萃取溫度對井岡蜜柚皮精油提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of JPPEO

2.1.4 萃取時間對井岡蜜柚皮精油得率的影響 從圖4 可以知，隨著萃取時間延長，井岡蜜柚精油得率不斷上升（P<0.05），萃取時間為60 min 時，JPPEO得率達到9.05‰。隨后隨著萃取時間的延長，萃取精油得率反而顯著下降（P<0.05）。精油在低溫連續(xù)相變?nèi)芤后w系中達到溶解平衡需要一定的時間，但體系一旦到達平衡后精油得率就不再上升，時間過長反而使精油的解析時間過長，致使低沸點成分部分流失[28]。所以，考慮到萃取時間過長會增加能耗和生產(chǎn)成本，JPPEO 低溫連續(xù)相變的最佳萃取時間選取60 min。類似地，在黃煒超[27]佛手精油的研究中，在萃取時間為60 min 時有效成分相對百分含量達到最大值。此外，低溫連續(xù)相變法提取JPPEO 最佳萃取時間僅為水蒸氣蒸餾法（5 h）的五分之一，效率高。

圖4 萃取時間對井岡蜜柚皮精油提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of JPPEO

2.1.5 解析溫度對井岡蜜柚皮精油得率的影響 解析溫度影響油脂和溶劑分離的速度。由圖5 可知，解析溫度從60 ℃升高至70 ℃時，JPPEO 得率不斷顯著升高（P<0.05），在解析溫度為70 ℃時，JPPEO得率達到9.75‰，但當(dāng)解析溫度由70 ℃升至80 ℃，JPPEO 得率反而出現(xiàn)顯著下降的趨勢（P<0.05）。綜上所述，低溫連續(xù)相變法提取JPPEO 的最佳解析溫度選取70 ℃。有研究表明解析溫度較高會影響油脂品質(zhì)且增加能耗，在解析速度得到保證和油脂得率影響不大的基礎(chǔ)上，應(yīng)選擇較低的解析溫度[26]。

圖5 解析溫度對井岡蜜柚皮精油提取率的影響Fig.5 Effect of analytical temperature on extraction rate of essential oil from JPPEO

2.2 低溫連續(xù)相變提取井岡蜜柚皮精油的正交試驗結(jié)果

2.2.1 低溫連續(xù)相變提取JPPEO 的正交試驗條件及結(jié)果 由表2 可得，各因素對JPPEO 提取率影響大小為：D>C>A>B，表明解析溫度對低溫連續(xù)相變萃取的JPPEO 得率影響最大，其次為萃取壓力，萃取溫度和萃取時間影響較小。由極差分析結(jié)果，各因素的最優(yōu)水平組合為 A3B1C2D2，經(jīng)過對這一組合進行3 次重復(fù)驗證試驗，精油提取率達到10.99‰，高于正交試驗的最高組合A3B1C3D2（10.98‰）。所以各因素的最優(yōu)水平組合A3B1C2D2，即原料顆粒30 目，萃取時間 60 min，解析溫度70 ℃，萃取溫度55 ℃，萃取壓力0.6 MPa。

表2 L9（34）正交實驗結(jié)果Table 2 Results obtained under the experimental conditions using the L9(34)orthogonal design

2.3 兩種提取方法井岡蜜柚皮精油得率、理化性質(zhì)對比

從表3 中可以看到，兩種提取方法對JPPEO 的得率影響相差較大，其中低溫連續(xù)相變法（10.99‰±0.58‰）相比于水蒸氣蒸餾法（2.83‰±0.16‰）提取，得率高出了2.88 倍。

表3 井岡蜜柚皮精油部分理化性質(zhì)Table 3 Some physicochemical properties of JPPEO

精油的理化特性是油脂品質(zhì)評定指標(biāo)之一，常表征的理化指標(biāo)有相對密度、折光率、酸值、酯值、碘值。折光率和相對密度的大小均表示精油脂肪酸不飽和程度。而酸值代表的是脂肪中游離脂肪酸含量的多少，也是辨別脂肪質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，油脂的酸值越小，說明油脂的質(zhì)量越好，精煉度越好[29]。酯值是對精油中酯類化合物含量評定的一個指標(biāo)，酯值越高代表油脂的酸敗程度越嚴(yán)重。其值影響精油的風(fēng)味。酯類成分能夠給人一種厚重氣息，使香氣飽滿沉重，但酯類成分過多，又容易形成油膩氣息[30]，這也是低溫連續(xù)相變法提取所得的JPPEO（L-JPPEO）較水蒸氣蒸餾提取所得的JPPEO（H-JPPEO）的香味重的原因。在氣味方面，L-JPPEO 在室溫下為黃色至紅棕色半固體膏狀物，在低溫下放置一段時間后會發(fā)生凝固現(xiàn)象，有少量蠟狀沉淀物析出，具有柚子特有的濃郁香味，且無肉眼可見雜質(zhì)，而H-JPPEO 為黃色澄清液體，具有新鮮蜜柚的特征香氣，無可見雜質(zhì)。

由表3 可得，L-JPPEO 比H-JPPEO 的相對密度和折光指數(shù)略高，這表明兩種方法提取的精油成分相似，但L-JPPEO 中不飽和程度成分更多一些。從表3中還可以看到，H-JPPEO 的酸值和酯值均高于LJPPEO，這表明L-JPPEO 游離脂肪酸含量、酯類成分含量較少，L-JPPEO 質(zhì)量更好。造成兩者理化性質(zhì)差異較大的原因是低溫連續(xù)相變萃取裝置密閉性較好，萃取溫度較低，減少了原料與空氣接觸，抑制精油的氧化變質(zhì)，使精油有較高的不飽和脂肪酸含量，較低的游離脂肪酸含量和酯類物質(zhì)。

2.4 FTIR 分析

L-JPPEO 和H-JPPEO 的紅外光譜圖如圖6 所示。參考朱為宏等[31]，由烯烴雙鍵的特征吸收主要是C=C 伸縮振動、不飽和C–H 伸縮振動以及不飽和C–彎曲振動[32-33]可知，L-JPPEO 在3000～3100 cm-1處出現(xiàn)了=C–H 伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰、在1620～1640 cm-1處出現(xiàn)了C=C 伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰[34]和在790～840 cm-1范圍內(nèi)（797 cm-1）、885～895 cm-1范圍內(nèi)（886.02 cm-1）、985～995 cm-1范圍內(nèi)（988.95 cm-1）出現(xiàn)了=C 面外彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰，而H-JPPEO 在1609.82 cm-1處出現(xiàn)了C=C–C=C 伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰[35]以及在650～730 cm-1范圍內(nèi)（720.78 cm-1）、790～840 cm-1范圍內(nèi)（833.22 cm-1）、885～895 cm-1范圍內(nèi)（891.69 cm-1）出現(xiàn)了=C 面外彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰，說明其物質(zhì)成分中含有較多的烯烴雙鍵，推斷其可能為由異戊二烯構(gòu)成的萜烯類物質(zhì)。

圖6 兩種方法提取井岡蜜柚皮精油的紅外光譜Fig.6 FTIR of JPPEO extracted by two methods

醇、酚分子中都存在羥基，氫鍵區(qū)的O–H 伸縮振動[14]和彎曲振動是這兩類化合物的特征吸收峰，而第二個主要吸收峰為C–O 吸收峰[36]。由圖6 中可知，L-JPPEO、H-JPPEO 分別在3358.16、3420.53 cm-1附近呈現(xiàn)一個寬的吸收峰，該峰為形成氫鍵締合狀態(tài)的 O-H，而且 L-JPPEO、H-JPPEO 均在1000～1250 cm-1處出現(xiàn)了C–O 的吸收峰且該吸收峰通常是譜圖中最強吸收峰之一，L-JPPEO 在譜圖中可能表現(xiàn)為1121 cm-1，由此推測L-JPPEO、HJPPEO 可能含醇類、酚類有機物。

此外，因L-JPPEO、H-JPPEO 在1580～1928 cm-1處存在羰基化合物紅外光譜的特征強吸收帶[27]，表明其中可能均含有含羰基化合物。又L-JPPEO 在1110.30 cm-1處存在脂肪酮的C–C 伸縮振動，進一步推斷其可能含有酮類物質(zhì)。同時，H-JPPEO 在1733.25 cm-1處存在酯類化合物中羰基的伸縮振動并在1030～1300 cm-1出現(xiàn)C–O–C 基團的不對稱及對稱收縮強吸收峰[37]，進一步推斷其可能含有酯類物質(zhì)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，L-JPPEO、H-JPPEO 均在1725 cm-1左右出現(xiàn)醛基的特征吸收峰[38]，說明其可能含有醛類化合物；羧基（–COOH）的C=O 伸縮振動、O-H 的伸縮振動、O–H 的變形振動是識別羧基的主要系列峰[19]。L-JPPEO 在2835～3080 cm-1范圍內(nèi)產(chǎn)生高低不平的O–H 伸縮振動吸收峰，但沒有在1710 cm-1附近產(chǎn)生締合羧基的吸收或在1760 cm-1附近產(chǎn)生游離羧基的吸收、在920 cm-1產(chǎn)生O–H 的變形振動，因此，L-JPPEO 是否含有羧基有待進一步驗證。綜上所述，中紅外光譜分析推測L-JPPEO 和H-JPPEO 含萜烯類化合物、醇類、酚類、醛類以及含羰基化合物，其中，L-JPPEO 含的羰基化合物可能為酮類物質(zhì)，H-JPPEO 含的羰基化合物可能為酯類物質(zhì)，但L-JPPEO 是否含有酸類以及兩種方法提取的JPPEO 含有的其他有機物有待進一步驗證。

2.5 GC-MS 分析

2.5.1 JPPEO 揮發(fā)性成分含量及種類的差異分析不同提取方法所得的JPPEO 揮發(fā)性成分總離子流圖如圖7 和圖8，對GC-MS 所檢測的成分進行NIST數(shù)據(jù)庫匹配，同時采用內(nèi)標(biāo)法對各化合物含量進行計算，結(jié)果如表4 所示。

圖7 低溫連續(xù)相變提取所得井岡蜜柚皮精油GC-MS 總離子流圖Fig.7 GC-MS total ion flow diagram of JPPEO obtained by low-temperature continuous phase transition

圖8 水蒸氣蒸餾法提取所得井岡蜜柚皮精油GC-MS 總離子流圖Fig.8 GC-MS total ion flow diagram of JPPEO extracted by steam distillation

表4 GC-MS 鑒定不同提取方法井岡蜜柚皮精油的揮發(fā)性有機化合物Table 4 Identification of volatile organic compounds in JPPEO by GC-MS

從表4 可以看到，H-JPPEO 和L-JPPEO 中共檢測出40 種揮發(fā)性有機物，其C 鏈均在C10～C20以內(nèi)，包括萜烯類、醇類、酮類、醛類、酯類和酚類、醚類、苯類8 類化合物。從H-JPPEO 和L-JPPEO 精油樣品中分別鑒定出23 和32 種揮發(fā)性有機物，HJPPEO 中檢測出萜烯類15 種、醇類5 種、醛類1 種、酯類2 種。L-JPPEO 中檢測出萜烯類15 種、醇類7 種、酮類3 種、醛類1 種、酯類2 種和酚類1 種、醚類1 種、苯類1 種。兩種方法得到的精油主要成分相近，均為萜烯類物質(zhì)。兩種精油都檢測出的有15 種，包括14 種萜烯類物質(zhì)（α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、檜烯、β-月桂烯、β-蒎烯、水芹烯、羅勒烯、欖香烯、γ-欖香烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、石竹烯、（-）-Alpha-蒎烯、大牛兒烯D；5 種醇類（芳樟醇、馬鞭草烯醇、4-萜烯醇、α-松油醇、（1R,5S）-rel-香芹醇）；1 種醛類物質(zhì)（檸檬醛）。

GC-MS 結(jié)果表明，萜烯類化合物在L-JPPEO、H-JPPEO 中的含量分別為10、673.03 μg/mL，其中D-檸檬烯相對含量最高，分別占4.75、640.93 μg/mL，兩種提取方法得到的精油中相同的萜烯類物質(zhì)共9種，共有成分中 D-檸檬烯、β-月桂烯、β-蒎烯是其發(fā)揮藥理作用的主要成分。其中，D-檸檬烯有類似檸檬的香氣[39]。它的治療作用已得到廣泛研究，已有研究證明其具有抗炎[40]、抗菌[41]、抗氧化[42]、鎮(zhèn)痛、抗癌[43]、抗糖尿病[44]、抗高脂血癥[43]和胃保護作用[45]，以及其他有益健康的作用。β-月桂烯具有鎮(zhèn)痛[46]、抗蚊蟲[47]、止咳[39]作用。醇類物質(zhì)相對含量僅次于萜烯類物質(zhì)，在L-JPPEO 以及H-JPPEO 中的含量分別為7.32、3.17 μg/mL，其中相同成分有芳樟醇、馬鞭草烯醇、4-萜烯醇、α-松油醇、（1R,5S）-rel-香芹醇。根據(jù)相關(guān)研究，桉葉油素具有消炎止痛的功效，其主要應(yīng)用于止咳糖、人造薄荷中[48]。本研究發(fā)現(xiàn)桉葉油素在L-JPPEO 中占比較高，含量高達3.76 μg/mL，而在H-JPPEO 并未出現(xiàn)。在L-JPPEO 中檢出而未在H-JPPEO 檢出的酮類化合物有3 個，含量共為1.62 μg/mL，分別是香芹酮、右旋香芹酮、圓柚酮。其中香芹酮具有抗菌活性、抗氧化活性、抗腫瘤等活性已廣泛被研究[49]；圓柚酮具有刺激的柚子香氣，味苦，是柚子皮油和柚子果汁中重要的香味成分，在香精中具有増味增香的應(yīng)用[50]。而兩種提取法的JPPEO 中酯類、酚類含量較少。綜上，低溫連續(xù)相變法與水蒸氣蒸餾法相比，提取的JPPEO 成分種類更多，提取出較多的醇、酮及熱不穩(wěn)定成分，更全面地反映井岡蜜柚皮中的化學(xué)成分，其原因是低溫連續(xù)相變法以丁烷溶液為溶媒，對井岡蜜柚粉中弱極性以及非極性物質(zhì)的滲透性和溶解能力顯著提高，經(jīng)過對物料進行多次低溫浸提，避免了揮發(fā)性和不耐熱化合物的損失和降解。

2.6 GC-IMS 分析

2.6.1 井岡山柚皮精油GC-IMS 譜圖分析 采用GC-IMS 對不同提取方法JPPEO 揮發(fā)性有機物進行分析和鑒別。圖9 表示JPPEO 的GC-IMS 三維譜圖（保留時間、遷移時間和離子峰強度），從圖中可以直觀看出，兩種提取方法的JPPEO 中的揮發(fā)性成分存在差異，為便于分析，采用俯視圖進行差異對比，如圖10 所示。圖10（a）為JPPEO 的GC-IMS 二維譜圖，縱坐標(biāo)表示GC 分離揮發(fā)性物質(zhì)時的運行時間（Measurement run，Mr），橫坐標(biāo)表示IMS 分離時揮發(fā)性物質(zhì)相對于反應(yīng)離子峰的漂移時間（Drift time，Dt）。整個圖背景為藍色，橫坐標(biāo)1.0 處紅色豎線為反應(yīng)離子峰（Reactive ion peak，RIP 峰，經(jīng)歸一化處理），反應(yīng)離子峰右側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性物質(zhì)，顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大，從圖10（a）可以看出不同提取方法JPPEO 樣品內(nèi)揮發(fā)性有機物可通過GC-IMS 很好地分離。圖10（b）為JPPEO 的GC-IMS 差異譜圖，以L-JPPEO1 為參比，其余譜圖扣除L-JPPEO1 中的信號峰，得到二者的差異譜圖。標(biāo)為（a）的藍色區(qū)域說明該物質(zhì)在此樣品中較LJPPEO1 低，而標(biāo)為（b）的紅色區(qū)域說明該物質(zhì)在此樣品中較L-JPPEO1 高，從圖10（b）中可以看到同一JPPEO 之間幾乎沒有差異，不同樣品之前差異極為顯著，其差異主要表現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量、強度及時間上。若要進一步觀察，需要轉(zhuǎn)換成指紋圖譜進行對比。

圖9 不同提取方法井岡蜜柚皮精油的GC-IMS 三維譜圖Fig.9 GC-IMS three-dimensional spectra of JPPEO extracted by different methods

圖10 不同提取方法井岡蜜柚皮精油的GC-IMS 二維譜圖Fig.10 GC-IMS two-dimensional spectra of JPPEO with different extraction methods

2.6.2 JPPEO 揮發(fā)性成分含量及種類的差異分析為進一步直觀地觀察不同提取方法JPPEO 的揮發(fā)性有機化合物的變化，根據(jù)JPPEO 揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜保留時間和離子遷移時間對揮發(fā)性組分進行定性分析，圖11 為兩種提取方法JPPEO 中揮發(fā)性成分特征峰位置點，每個特征峰對應(yīng)1 種揮發(fā)性有機物質(zhì)并整理至表5。通過GC-IMS 自帶的Library Search軟件進行組分分析，最終從兩種提取方法的JPPEO樣品中檢測到揮發(fā)性成分72 種單體及部分化合物的二聚體，如表5 所示，71 種揮發(fā)性有機物C 鏈均在C2～C15以內(nèi)，主要包括萜烯類18 種、醇類13種、醛類14 種、酮類8 種、酯類9 種、酸類3 種、其它6 種。兩種提取方式的JPPEO 中揮發(fā)性化合物種類基本一致，但不同種類化合物所占比例略有區(qū)別。L-JPPEO 中萜烯類占45.75%，醇類占17.27%，醛類占3.80%，酮類占7.68%，酯類占15.85%，酸類占5.62%，其它類占4.04%，而H-JPPEO 中萜烯類占31.51%，醇類占32.78%，醛類占12.37%，酮類占5.83%，酯類占13.78%，酸類占0.96%，其它類占2.77%。

圖11 兩種提取方法井岡蜜柚皮精油中揮發(fā)性成分特征峰位置點Fig.11 Characteristic peak position of volatile components in JPPEO by two extraction methods

表5 GC-IMS 鑒定不同提取方法井岡蜜柚皮精油揮發(fā)性成分Table 5 Identification of volatile components of JPPEO with different extraction methods by GC-IMS

2.6.3 JPPEO 揮發(fā)性成分的指紋圖譜 為進一步比較不同提取方法JPPEO VOCs 的差異，采用G.A.S.公司開發(fā)的 LAV 軟件的Gallery Replot 插件，選取圖中待分析區(qū)域自動生成指紋圖譜，以識別不同提取方法JPPEO 的特征區(qū)域。如圖12 所示，橫軸為JPPEO 中的所有揮發(fā)性峰，縱軸為同一物質(zhì)在不同提取方法JPPEO 中的信號峰強度。斑點范圍從藍色到紅色，表明揮發(fā)性物質(zhì)的含量從低到高。共識別出70 個信號峰，并用名稱標(biāo)記它們，而數(shù)字則代表未知物質(zhì)。

圖12 兩種提取方法井岡蜜柚皮精油的揮發(fā)性有機物指紋圖譜Fig.12 Finger print of volatile organic compounds in JPPEO by two extraction methods

從圖12 可看出，紅色框內(nèi)A 區(qū)域的19 種化合物在L-FCEO（低溫連續(xù)相比提取）中的相對含量較H-FCEO（水蒸氣提取）高，包含丙酮醇、3-羥基-2-丁酮、二丙硫醚、γ-丁內(nèi)酯、乙酸乙酯、丙酸、乙酸、2-甲基丁酸、3-戊酮、2-已烯醛、苯乙烯、萜品油烯、芳樟醇、2-乙酰基呋喃、乙酸芐酯、呋喃酮、（E,E）-異丙烯、（E）-羅勒烯、β-石竹烯；橙色框內(nèi)B 區(qū)域的乙酸苯乙酯、三環(huán)烯、莰烯、4-萜烯醇、松油烯、松油烯、乙醇、β-蒎烯-D、β-蒎烯-M、α-蒎烯、E-羅勒烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯、月桂烯、γ-松油烯在兩種精油樣品中的含量相差不大；而綠色框內(nèi)C 區(qū)域的各化合物在H-FCEO 中相對含量較高，包括正己醇、庚醛、2-庚酮、2-甲基吡嗪、2-已烯醛、呋喃酮、2,3-丁二醇、乳酸乙酯、異戊醇、丁酸甲酯、2,5-二甲基呋喃、2-乙基呋喃、2-甲基丁醛、3-甲基-2-丁醇、正丁醇、丁醛、2,3-丁二酮、乙酸甲酯、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、己酸乙酯、（E,E）-2,4-庚二烯醛、芳樟醇氧化物、香葉醇、水芹烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯和戊醛27 種化合物。

2.6.4 JPPEO 中揮發(fā)性物質(zhì)的PCA 根據(jù)精油中的揮發(fā)性成分信號峰對其進行主成分分析，使精油的特征差異可視化[51]。選取特征峰對應(yīng)的峰強度值為特征參數(shù)變量，得到第一、二主成分圖（圖13），不同顏色的點代表不同提取方法JPPEO 樣品的歸類情況。如圖13 所示，第一主成分（PC1）貢獻率為98%，第二主成分（PC2）貢獻率為1%，PC1 與PC2 的貢獻率之和為99%，數(shù)據(jù)降維后所得綜合變量在二維空間能很好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息。通過二維空間的數(shù)據(jù)分布差異可以直觀地觀察到組間和組內(nèi)樣品間的差異性，組內(nèi)各樣品相對距離較近或重疊，說明不同提取方法精油樣品的重復(fù)性較好，不同樣品各組數(shù)據(jù)的成簇區(qū)域有明顯的間距，說明不同提取方法精油樣品間的特異性較明顯，樣品間VOCs 差異較大。且兩種精油主要差異在PC1，組間距離明顯，被很好地區(qū)分開。上述結(jié)果表明，JPPEO 中揮發(fā)性物質(zhì)的PCA 分析可針對不同提取方法的JPPEO 進行快速分類鑒別，可用于比較不同提取方法的JPPEO品質(zhì)，為井岡蜜柚精油的開發(fā)利用提供一定的參考。

圖13 不同提取方法井岡蜜柚皮精油的揮發(fā)性PCA 分析Fig.13 Volatile PCA analysis of JPPEO with different extraction methods

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，低溫連續(xù)相變提取JPPEO 的最佳工藝為：顆粒度30 目，萃取溫度55 ℃，萃取壓力0.6 MPa，萃取時間60 min，解析溫度70 ℃，此時精油得率為10.99‰。連續(xù)相變法提取的精油得率比水蒸氣蒸餾法提取的精油得率高出了2.88 倍；精油理化性質(zhì)實驗結(jié)果表明低溫連續(xù)相變萃取的井岡蜜柚皮精油的不飽和脂肪酸含量較高，游離脂肪酸含量較低，酯類成分含量較低，L-JPPEO 質(zhì)量更好。中紅外光譜技術(shù)鑒定L-JPPEO 和H-JPPEO 含萜烯類化合物、醇類、酚類、醛類以及含羰基化合物。GC-MS法從L-JPPEO 精油樣品中鑒定出32 種有機物，萜烯類15 種、醇類7 種、酮類3 種、醛類1 種、酯類2 種和酚類1 種、醚類1 種、苯類1 種。而未從HJPPEO 精油樣品中鑒定出酮類、酚類、醚類、苯類，其余成分種類基本一致，GC-MS 法僅從H-JPPEO鑒定出23 種揮發(fā)性有機物。GC-IMS 法結(jié)果表明兩種提取方式的JPPEO 的化合物種類基本一致，從兩種精油樣品中鑒定出71 種共同有機物，但不同種類化合物所占比例略有區(qū)別，L-JPPEO 精油成分及占比分別為萜烯類（45.75%）、醇類（17.27%）、醛類（3.80 %）、酮類（7.68%）、酯類（15.85%）、酸類（5.62%）、其它類（4.04%），兩種方法得到的精油主要成分相近，均為萜烯類物質(zhì)，與水蒸氣蒸餾相比，低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)提取出較多的酮類及酯類、酸類成分，更全面地反映井岡蜜柚皮中的化學(xué)成分。因此，低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)應(yīng)用于井岡蜜柚皮精油生產(chǎn)，具有萃取溫度和萃取壓力低，萃取時間短，萃取溫度萃取效率高，封閉性好，對精油成分無破壞等特點，展示出良好的經(jīng)濟效益及應(yīng)用前景。