酶解對香蕉果酒發酵前后風味的影響

鐘思彥，徐玉娟，余元善，吳繼軍，李 璐，盧楚強，陳從貴，鄒 波,

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州 510610；2.廣東源豐食品有限公司，廣東茂名 525000）

香蕉屬芭蕉科植物，主要分布在印度、菲律賓、巴西、中國和印度尼西亞等熱帶和亞熱帶地區。我國是世界上第三大香蕉生產國，在香蕉全球貿易中起重要作用[1-2]。香蕉果肉香甜軟滑，營養豐富，富含酚類、礦物質、類黃酮、膳食纖維等[3-5]，具有降低血脂血壓、防止心腦血管疾病、潤腸通便的作用[6]。但是，香蕉是典型的呼吸躍變型水果，采收時間集中，成熟后不易貯藏，一般2～4 d 會腐爛變質[7]。因此，開展香蕉精深加工對延長香蕉產業鏈具有重要意義。

果酒酒精度較低，富含果香味和水果中的活性物質，深受消費者喜愛。目前，市場上果酒的種類幾乎涵蓋了所有水果品種。香蕉糖度高，適用于果酒發酵，但香蕉果肉含有較多果膠，打漿后果漿粘稠，取汁不易，未經處理的原漿直接釀酒較難。目前香蕉果酒的加工工藝主要采用酶解后再發酵，或者加水制汁后發酵。果膠酶能將果漿中的果膠大分子降解成小分子，降低果漿的粘度，提高出汁率，同時對果酒的品質也有提升。程拯艮[8]發現果膠酶能促進原漿中芳香物質的釋放，豐富香氣組成；還有研究[9]發現果膠酶使火龍果酒的產量提高16%，且果酒香氣更豐富。然而，酶解和非酶解對香蕉果酒發酵前后理化性質尤其是風味變化的對比研究鮮見報道。

香氣是決定果酒風味，影響消費者接受度最關鍵的因素。現有報道主要集中于香蕉酒香氣成分相對含量的測定，如溫海祥等[10]采用液-液萃取的方法提取香蕉酒中的香氣成分，用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）分析得出酯類和醇類是香蕉酒中主要的香氣成分；韋璐等[11]發現香蕉果酒在低溫發酵期間，香氣總相對含量呈現先升后降，最后趨勢平穩。盡管這些研究有助于辨析香蕉酒中香氣成分的種類，但揮發性成分在整體香氣中的強度還取決于成分的濃度和在介質中的閾值[12]，通常以香氣活度值（OAV）表示，當OAV<1 時，該揮發性成分對整體香氣無貢獻，OAV>1 時，該揮發性成分對整體香氣有直接貢獻，且揮發性成分OAV 值越大，對整體香氣貢獻越大[13]。目前，關于香蕉果酒發酵前后香氣成分的濃度變化、OAV 值及香氣主成分分析（PCA）鮮見報道，本研究在分析常規理化指標的同時，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術，通過定量分析、OAV和PCA 系統探究了酶解和非酶解處理香蕉果酒發酵前后揮發性成分的變化規律，為香蕉果酒發酵工藝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉 廣東源豐食品有限公司提供；釀酒酵母FX10 法國 Laffort 公司；氫氧化鈉、果膠酶（500 U/mg）分析純，上海源葉生物科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）、氯化鈉（分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；C5～C32 系列正構烷烴混標 上海安譜璀世標準技術服務有限公司；仲辛醇 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；果葡糖漿、偏重亞硫酸鉀 食品級，湖南岳陽三湘化工有限公司。

PB-10 型pH 計 德國Sartorius 公司；SW-CJ-2FD 無菌工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；ALC-210.4 電子分析天平 德國ACCULAB 公司；SPX-250B-Z 生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；H-200-BIA03 榨汁機 上海韓惠人愛家電科技有限公司榨汁機；RFM3400 阿貝折光儀 英國Stanley 公司；JW-1042 型離心機安徽嘉文儀器裝備有限公司；DMA 35 便攜式密度計奧地利安東帕（中國）有限公司；DB-5 非極性毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）美國Restek；7890B-5977B 型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 科技公司；57330-U 型三相固相微萃取頭（PDMS/DVB/CAR）美國Supelco 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉酒工藝流程 香蕉去皮→打漿/加水打漿→酶解/不酶解→過濾→調配→酒精發酵→過濾→澄清。

1.2.2 樣品分組及制備 經前期對果膠酶、纖維素酶和淀粉酶的篩選及酶用量和酶解時間的研究，將樣品進行以下分組處理：

參考柏建玲等[14]的研究，將香蕉去皮，加2 倍質量水打漿，過濾，所得香蕉汁為樣品1*；香蕉去皮打漿后，加入0.03%果膠酶，50 ℃水浴加熱處理2 h，然后過濾，所得香蕉汁為樣品2*。

在所得兩組香蕉汁中加入果葡糖漿調節TSS到22oBrix；加入偏重亞硫酸鉀，用量為100 mg/kg；接入活化的釀酒酵母FX10，酵母用量為250 mg/kg，發酵溫度20±2 ℃，發酵7 d，酒精發酵結束5000 r/min離心10 min 后取上清液備用；樣品1*發酵所得果酒標記為樣品3*，樣品2*發酵所得果酒標記為樣品4*。果汁和果酒分別取樣儲存于-20 ℃進行后續實驗。

1.2.3 pH、總酸（TA）和可溶性固形物（TSS）的測定

各處理組樣品的pH 采用pH 計直接測定；總酸采用GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》[15]方法測定；TSS 采用數字阿貝折射儀測定。

1.2.4 酒精度的測定 酒精度的測定參考GB 5009.225-2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》[16]，選擇酒精計法進行測定。

1.2.5 揮發性成分測定 頂空固相微萃取（HSSPME）條件參照Wu 等[17]的方法稍作改變：準確稱取5.00 g 樣品于15 mL 頂空萃取瓶中，加入1 g 氯化鈉、1 μL（50 mg/L）仲辛醇內標溶液及磁力攪拌轉子，于40 ℃水浴中平衡10 min；隨后將裝有纖維頭的手柄插入萃取瓶中，置于樣品上方的空氣中（距離樣品液面約2.5 cm），40 ℃下萃取30 min 后，迅速將萃取纖維頭插入氣相色譜儀的進樣口，解析5 min，同時啟動氣相色譜儀采集數據。

GC-MS 條件參照Kanjana 等[18]的方法略作修改：采用DB-5MS 彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）對樣品進行分析，載氣為氦氣，載氣流速為1.7 mL/ min，進樣口溫度為250 ℃，色譜柱升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持5 min，隨后以4 ℃/ min的速度升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/ min的速度升溫至260 ℃，保持5 min。采用不分流進樣模式。質譜條件設定如下：采用全掃描模式采集信號，電離方式EI，電子轟擊能量為70 eV；接口溫度280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描質量范圍為35～350 amu，倍增器電壓（自動調諧+200 V）；掃描速度：5.2 次/秒。

揮發性成分定性分析：與標準信息庫NIST 14 進行比對；采用正構系列烷烴混合標樣C5～C32計算揮發性成分的保留指數，并與參考文獻進行對比；根據所記錄香氣描述以及利用標準品的質譜信息進行定性。保留指數（LRI）計算。

式中，N 是目標物質左側正構烷烴的碳原子數，n 為位于目標物質兩側的正構烷烴的碳分子數之差，tRa，tRN和tR（N+n）分別是待測物質，待測物質左側和右側正構烷烴的保留時間。

揮發性成分定量分析：參照程宏楨等[19]的內標法對化合物進行定量，各揮發物質相對含量=（待求成分物質峰面積×內標物含量）與內標物峰面積之比。

香氣活度值（OAV）的計算方法：

式中，OAV 為揮發性成分的香氣活力值；Ci為香氣成分的含量；OTi為香氣成分在參考文獻中的香氣閾值。

1.2.6 感官評定 參照李祥雨等[13]的方法略作修改，感官評價小組成員由10 位（女性6 人，男性4 人）食品專業學生組成。首先，感官評價員通過嗅聞果汁果酒，成員討論并確定果汁果酒的7 個風味描述詞，分別是：青草味、水果香、花香、奶油香、酒精味、甜香和香氣豐富度。然后將5 mL 香蕉果汁或果酒放在30 mL 的嗅聞瓶中隨機編號，讓成員嗅聞打分。評分采用五點標度法（5 代表感受味道很強，0 代表感受不到味道），取三次重復實驗平均值繪制香氣輪廓雷達圖。

1.3 數據處理

用IBM SPSS Statistics 26.0 進行顯著性分析，Microsoft office Excel 2021 和Origin 2022 進行統計分析、主成分分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 香蕉果酒發酵前后理化指標比較

如表1 所示，樣品2*的pH 顯著低于樣品1*（P<0.05），可溶性固形物含量和總酸顯著高于樣品1*（P<0.05），可能是因為樣品2*是香蕉漿直接酶解后制備的汁，對香蕉中的有機酸和可溶性固形物保留較好，而樣品1*是香蕉漿加水后過濾所得，可溶性固形物和有機酸被稀釋。不同前處理的果汁經酒精發酵后pH 略有下降，總酸含量有所升高，這可能與酵母繁殖和酒精發酵過程中產生CO2、有機酸相關[20]。酶解香蕉汁發酵的果酒酒精度略高，有研究表明[21]，在一定添加范圍內，酒精度和果膠酶添加量呈正相關，本文的研究結果與之一致，這可能與果膠酶分解果膠，促進小分子糖的釋放有關。

表1 香蕉果酒發酵前后理化指標Table 1 Physicochemical indexes of banana wine before and after fermentation

2.2 香蕉果酒發酵前后揮發性成分比較

2.2.1 揮發性物質種類和數量比較 對兩種香蕉汁和兩種香蕉酒進行GC-MS 分析，將GC-MS 檢測到的物質根據內標法算出百分含量，由于不同樣品中物質含量差異較大，數據進行歸一化后再繪制熱圖[22]，如圖1 所示，藍色到紅色表示物質含量依次增加，藍色越深含量越低，紅色越深含量越高。熱圖橫坐標為四組樣品，縱坐標表示香蕉汁和香蕉酒一共檢測出的87 種揮發性成分。從圖可知，四組樣品揮發性成分種類和含量均不相同，其中樣品1*和樣品2*較為相似，樣品3*和樣品4*較為接近，表明不同前處理方式及發酵對香氣成分均有影響，其中發酵影響較大。結合圖2 分析，從四個樣品中分別鑒定出49、47、43 和43 種揮發性成分，總體分為醇類、醛類、酯類、酮類和其他類。其中樣品1*檢測到的揮發性成分最多，包括醇類8 種、酯類20 種、醛類4 種、酮類8 種和其他類9 種，樣品3*和樣品4*檢測到的物質數量較少，都是43 種。樣品3*中包括醇類9 種、酯類24 種、醛類0 種、酮類3 種和其他類7 種，樣品4*中包括醇類9 種、酯類26 種、醛類0 種、酮類4 種和其他類4 種。從含量上看，四個樣品揮發性成分的含量差異顯著，樣品4*的揮發性成分總含量（3499.40 μg/kg）最高，其次為樣品3*（2748.47 μg/kg）、樣品2*（2362.30 μg/kg），總含量最少的是樣品1*（1973.33 μg/kg），其中酶解后發酵的果酒揮發性物質總量比發酵前提高了約1.48 倍，非酶解發酵果酒的揮發性物質總量比發酵前提高了約1.39 倍。可見無論是發酵前還是發酵后，經果膠酶處理的樣品香氣含量更高。

圖1 果汁果酒揮發性成分熱圖Fig.1 Heat map of the volatile components of fruit juice and fruit wine

2.2.2 酯類物質比較 酯類物質是構成果汁果酒風味特征的基本香氣化合物，4 個樣品中酯類的數量都遠高于其他種類，是香蕉汁和香蕉酒中重要的揮發性成分。結合圖2 進一步分析，四種樣品中酯類物質含量最大，均占總物質的40%以上，其中樣品1*的酯類含量為1068.20 μg/kg，占比最高（54.33%），含量最高的物質分別是異丁酸異戊酯、乙酸異戊酯、1-甲基乙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯等，與之前學者的研究一致[23-26]。樣品2*、3*、4*酯類含量分別為1038.45 μg/kg（43.77%），829.13 μg/kg（51.80%）、1213.82 μg/kg（51.73%）。果汁中酯類含量最高的物質均為異丁酸異戊酯，該物質具有水果香、酯香[26]，對香蕉汁香氣有正向影響。結合酯類閾值可知異丁酸異戊酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯等上述6 種酯類和丁酸乙酯是香蕉汁香味的重要組成部分。韋娜[27]采用GC-MS 檢測經果膠酶處理的香蕉酒，發現果酒中含量最高的酯類是癸酸乙酯，與本實驗結果一致，研究還指出隨著存放時間延長，癸酸乙酯含量會降低，甚至消失。韋璐等[11]研究發現，香蕉經復合酶處理后再發酵，果酒中相對含量最高的酯類為辛酸乙酯，其次為癸酸乙酯，與本實驗結果存在差異。這可能與發酵前不同的酶處理、釀酒微生物及發酵工藝有關[28]。

2.2.3 醇類物質比較 醇類物質同樣是香蕉果汁果酒中重要的物質，樣品3*中醇類物質的總含量占比最高，為1282.27 μg/kg（46.58%），樣品1*、2*及4*中含量和占比分別為308.96 μg/kg（15.56%）、530.51 μg/kg（22.32%）、1609.35 μg/kg（45.83%），其中香蕉汁中含量最高的醇類物質為異戊醇，具有花香和水果香氣；香蕉酒中含量最高的除乙醇外的醇類物質為苯乙醇，具有玫瑰花香的面包香味和愉快的水果香氣，對果酒香味的形成有積極作用[29]。

2.2.4 其他類物質比較 除了酯類和醇類，果汁果酒中還含有其他的揮發性物質。由圖2 可知兩種果汁分別都檢出4 種醛類物質，樣品1*中檢出異丁醛、異戊醛、己醛和反式-2-己烯醛，樣品2*中檢出異戊醛、己醛、反式-2-己烯醛和苯甲醛，這些氣味被描述為水果香和青草味，果酒中未檢出醛類物質，說明果汁中醛類物質來自香蕉果實，在發酵過程中轉化為了其他物質。酮類和其他類物質含量較少，不能單獨對樣品整體香氣作出貢獻，但會與其他揮發性成分共同作用影響果汁果酒的風味。

2.3 香蕉果酒發酵前后揮發性成分PCA 分析

主成分分析是利用降級的思維把多個指標轉化為幾個綜合指標的統計方法，可以反映組內樣本重復性的好壞和組間樣本差異性的大小[30]。為了進一步研究香蕉果酒發酵前后的差異，通過揮發性成分含量構建主成分分析模型，如圖3 所示，PC1 方差貢獻率為61.3%，PC2 方差貢獻率為19.8%，累計貢獻率為81.1%，累計貢獻率大于80%，判定該模型有效，可用于后續分析。四個樣品在PCA 圖中得到較好的區分，樣品1*位于第一象限，樣品2*位于第四象限，樣品3*和樣品4*均位于第二、三象限。第一主成分將香蕉汁和香蕉酒區分，第二主成分將兩種工藝的香蕉汁區分。2-庚酮、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、異戊酸異戊酯、丁酸己酯、乙酸丁酯等揮發性成分對PC1 正半軸貢獻較大，這些成分具有香蕉香、甜橙香、蘋果香、熱帶水果香，其中乙酸異戊酯是成熟香蕉果實的典型香氣[31]；辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯、異戊醇、苯乙醇、辛酸等揮發性成分對PC1 負半軸貢獻較大，這些成分具有玫瑰香、蜂蜜香、酒精味、甜酒香、脂肪香和熱帶水果香[32]，其中苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯是發酵后才出現的揮發性成分。丁酸異丁酯、異丁醛、2-壬酮、β-紫羅蘭酮等揮發性成分對PC2 正半軸貢獻較大，這些成分具有蘋果香、菠蘿香[11]、朗姆酒的甜香、焦香、紫羅蘭花香和香蕉香[28-29]；2-戊醇、正己醇、欖香素、反式-2-己烯醛等揮發性成分對PC2 負半軸貢獻較大，這些成分具有水果香、花香[28]、藥香、油脂香和青草香[33-34]。究其原因，發酵生成的新的揮發性成分與酵母的生長代謝有關，如苯乙醇是酵母代謝分解氨基酸（Ehrlich 途徑）形成的代謝產物[33,35]，脂肪酸乙酯等酯類物質則來源于酯化反應[33]。

圖3 香蕉果酒發酵前后PCA 得分圖（A）及載荷圖（B）Fig.3 PCA score diagram (A) and load diagram (B) before and after fermentation of banana wine

2.4 香蕉果酒發酵前后關鍵揮發性成分的確定

揮發性成分的強度能分析出香蕉汁和香蕉酒中重要的香氣化合物，但是不能全面真實地反映單個成分對整體香氣的貢獻大小，為了進一步研究揮發性成分與感官評價之間的聯系，本研究通過測定香氣活度值來確定果汁和果酒中起主要作用的揮發性成分，用揮發性成分的含量與閾值的比值來表示該物質在不同介質的香氣活度值，閾值取揮發性成分在水或10%乙醇中的閾值，表2 展示了果汁和果酒中OAV值大于1 的揮發性成分，分別是正己醇、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、丁酸異戊酯、異丁酸異戊酯、己醛、反式-2-己烯醛、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、異戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，這些物質一般被描述為花香、果香和青草味[36]。其中果汁檢出10 種對風味有一定影響的揮發性成分，包括7 種酯類、2 種醛類和1 種醇類；果酒檢出7 種對風味有一定影響的揮發性成分，包括6 種酯類和1 種醇類，果汁和果酒共有物質有2 種，分別是丁酸乙酯和乙酸異戊酯。果汁與果酒中OAV 值大于1 的揮發性成分明顯不同，因此，可以根據OAV 值大于1 的揮發性成分來區分果汁和果酒。

表2 果汁果酒揮發性成分香氣活度值Table 2 Ador activity value of volatile compounds in fruit wine

選取上述OAV 大于1 的揮發性成分，以其含量構建主成分分析模型，如圖4 所示，樣品1*分布在二三象限，與己醛、丁酸異戊酯、異丁酸異戊酯相關性強，這些物質主要與青草味、香蕉味、洋梨味、杏味和桃味相關[28-29]；樣品2*分布在一四象限，與乙酸丁酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、反式-2-己烯醛、乙酸乙酯、正己醇、乙酸異戊酯相關性強，這些揮發性成分與水果香、梨香、覆盆子香、青草香、溶劑味相關[28-29,33]。如圖5 所示，樣品4*分布在一四象限，與丁酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、異戊酸乙酯相關性強，這些物質主要給果酒帶來杏香、奶油香、甜酒香、玫瑰花香、蘋果香、香蕉香[11,28-29]等積極的香氣；樣品3*分布在二三象限，與樣品4*距離較近。由此可見，選取OAV值大于1 的揮發性成分進行分析，可以更好地區分果汁和果酒，酶解和非酶解的樣品，其中非酶解發酵果酒的整體風味偏弱，酶解后果汁和果酒中酯類成分香氣較強，且發酵前后酯類成分有所變化。

圖4 果汁特征香氣PCA 載荷和得分雙重圖Fig.4 PCA loading and score double plot of aroma characteristics of fruit juice

圖5 果酒特征香氣PCA 載荷和得分雙重圖Fig.5 PCA loading and score double plot of aroma characteristics of fruit wine

2.5 香蕉果酒發酵前后感官評價

香蕉果酒發酵前后，感官評分有較大差異，如圖6樣品1*的青草味評分明顯高于樣品2*，這可能與樣品1*中含有較多己醛相關，該化合物的香氣描述是水果香和青草香，樣品2*中含量升高的反式-2-己烯醛同樣具有水果香和青草香，但己醛OAV 值大于反式-2-己烯醛的OAV 值，因此己醛對香蕉果汁風味貢獻值更大，樣品1*含己醛多，青草味就更重，感官評價結果與圖4 的PCA 結果吻合；樣品3*除青草味和酒精味的評分高于樣品4*，其余香氣描述分值均低于樣品4*，樣品3*青草味更重，推測與發酵前樣品1*己醛含量高相關，樣品4*酒精味更淡則推測與果膠酶的作用相關，果膠酶對香氣種類的影響較小，但能促進香氣間的相互作用，明顯提高果酒香氣的復雜性[9]，樣品4*中部分酒精味被豐滿醇厚的花果香、甜香掩蓋，因此聞起來酒精味更淡。兩種果酒整體風味相似，但經果膠酶處理的果酒香氣更加豐富飽滿，結果與圖5 的PCA 結果一致。由此可見，果膠酶前處理對果汁和果酒整體風味都有積極影響。

圖6 香蕉果酒發酵前后感官雷達圖Fig.6 Sensory radar chart of banana wine before and after fermentation

3 結論

本實驗探究酶解對香蕉果酒發酵前后理化性質和揮發性成分的影響，結果表明經果膠酶處理的樣品，發酵前香蕉汁的TSS 和總酸較高，發酵后酒精度較高；通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術定量分析樣品中的揮發性成分，在四個樣品中共檢出87 種揮發性成分，其中酶解果汁和果酒香氣成分分別有47 和43 種，非酶解果汁和果酒香氣成分分別有49 和43 種；主成分分析及香氣活度計算的結果表明異丁酸異戊酯、丁酸乙酯、丁酸異戊酯等10 種物質是果汁的關鍵香氣物質，發酵后關鍵香氣物質轉化為辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯等7 種香氣物質，發酵前后物質差異大，經果膠酶處理的香蕉汁青草味更淡，而且由該果汁發酵而成的果酒含更多對風味有積極影響的揮發性成分，與感官評價結果一致。由此可見，果膠酶處理可以有效去除果汁中的青草味，且后續發酵的果酒風味更佳。該研究可為香蕉果酒加工提供理論支持。