不同季節云抗10 號厭氧加工白茶的品質差異探究

馬晨陽，高 暢，田 迪，周小慧，任 玲，李沅達，李亞莉，周紅杰

（云南農業大學茶學院，云南昆明 650000）

白茶主產于我國福建地區，按采摘標準和加工工藝不同可以分為白毫銀針、白牡丹、貢眉、壽眉等。白茶的特點是不炒不揉，初加工工序只有萎凋和干燥[1]。白茶由于其獨特的口感以及功效而受到消費者的青睞，各地的白茶產業發展迅速。其中，云南、浙江、福建等地通過茶樹品種篩選與加工工藝改良，分別生產出一些具有地方特色的白茶產品，如云南白茶利用其大葉種原料的優勢，有效提升了白茶滋味淡薄的缺點。段紅星等[2]發現云南大葉種制作白茶具有獨特的品種優勢，大葉種的品質特征具有開發名優白茶的基礎和條件。蔣賓等[3]通過對云南和福建白茶的差異性進行比較研究后制定了可參考的云南白茶標準化生產加工參數。而劉亞峰等[4]研究發現不同季節的白茶原料也對白茶的滋味具有一定的影響。季節性研究可以幫助改善夏秋茶品質，合理利用夏秋茶資源。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric，GABA）廣泛地分布在動物、植物體內[5]。在食品領域，有關γ-氨基丁酸的研究越來越多。其中，日本津志田藤二郎于1987 年首次發現經充氮除氧處理后的茶鮮葉能積累大量的GABA，而將GABA 含量在1.5 mg/g 以上的茶葉命名為γ-氨基丁酸茶[6]。研究表明，GABA 茶風味獨特且具有預防、輔助治療高血壓等心血管疾病[7]，改善和治療糖尿病[8-9]，抗癌[10]，抗疲勞[11]，改善腦功能增強記憶力[12]，鎮痛作用[13]，抗癲癇病等精神疾病[14-15]，調節激素分泌及控制哮喘病等多種生理功能[16]。目前茶葉加工中主要使用厭氧技術使茶葉中GABA 富集并改變整體氨基酸組分以影響茶葉風味，王芳等[17]發現厭氧溫度對GABA 的富集和成茶GABA 含量均有顯著影響。張金玉等[18]利用厭氧技術加工GABA 紅茶與綠茶，發現兩種茶葉GABA含量隨著厭氧時間的延長而增加，且氨基酸組分整體也呈現獨特變化。李加鳳等[19]研究發現經厭氧處理鮮葉后，用其制成的曬青毛茶與再制成的普洱生茶均符合GABA 茶標準且氨基酸組分與品質有較大改善，證明使用厭氧技術可以有效改善茶葉品質。

目前，通過改變加工工藝來提升云南白茶品質的研究主要以萎凋、干燥等加工步驟為主[20-22]，并未涉及到厭氧加工這項技術。本研究利用云抗10 號春、夏、秋三個季節的鮮葉（一芽二、三葉）為原料厭氧處理后加工白茶，進行感官審評，理化成分檢測并結合UHPLC-MS/MS 高通量檢測技術對白茶的氨基酸組分進行檢測和分析，探究其生化成分和氨基酸組分差異，旨在為云南地區GABA 白茶加工工藝優化、提質增效等方面提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

春、夏、秋云抗10 號茶樹品種一芽二、三葉鮮葉 采摘于云南省大理州云龍縣寶豐鄉大栗樹茶廠的茶園，春、夏、秋季白茶鮮葉采摘時間依次為2021 年4 月、2021 年6 月、2021 年8 月；甲醇、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯 分析純，天津市富宇精細化工有限公司；三氯化鋁、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化亞錫、碳酸氫鈉 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；茚三酮、碳酸鈉 分析純，廣東光華科技股份有限公司；草酸 分析純，天津市光復科技發展有限公司；蒽酮、堿式乙酸鉛 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；濃硫酸、濃鹽酸 分析純，重慶市川東化工（集團）有限公司；福林酚 分析純，上海源葉生物科技有限公司；香莢蘭 分析純，天津市光復精細化工研究所；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，德國CNW Technologies 公司。

AR1140 電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GT10-2 高速臺式離心機 北京時代北利離心機有限公司；BGZ-240 電熱鼓風干燥箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；UV-5100H 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；HWS-28 電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；DSH-10A 水分測定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；SAGA-10TF 實驗室超純水器 南京易普易達科技發展有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；MDF-86V340E 醫用低溫保存箱 安徽中科都菱商用電器股份有限公司；1290 Infinity II series UHPLC System 超高效液相、6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer 質譜 美國Agilent 公司；Heraeus Fresco17 離心機 美國Thermo Fisher Scientific 公司；明澈D24 UV 純水儀德國Merck Millipore 公司；YM-080S 超聲儀 深圳市方奧微電子有限公司；JXFSTPRP-24 研磨儀上海凈信科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樣制備 將剛采摘的鮮葉以厚度5 cm 攤晾1 h、充N2厭氧6 h 后，在溫度20～25 ℃環境條件下萎凋60～72 h，攤葉厚度3 cm 左右，之后60 ℃烘干機干燥至含水量<8.5%。春季、夏季、秋季白茶樣品編號分別為SW、UW、AW。

1.2.2 感官審評方法 按照國家標準（GB/T 23776-2018）《茶葉感官審評方法》，干評茶葉外形的條索、色澤、整碎、凈度，濕評茶葉內質的湯色、香氣、滋味、葉底，根據品質特征給予相應評語，評分采用百分制，在茶學專用審評室由感官審評員（10 人，5 男5 女）進行審評后打分，取其平均值為最后得分。

1.2.3 理化成分檢測方法 水浸出物的檢測參照國家標準（GB/T 8305-2013）《茶 水浸出物測定》、咖啡堿的檢測參照國家標準（GB/T 8312-2013）《茶 咖啡堿測定》、游離氨基酸總量的檢測參照國家標準（GB/T 8314-2013）《茶 游離氨基酸總量的測定》、茶多酚含量的檢測參照國家標準（GB/T 8313-2018）《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》。黃酮總量的測定參照三氯化鋁比色法[23]，可溶性糖總量的測定參照蒽酮比色法[23]，茶樣制備采取三次平行重復原則。

1.2.4 氨基酸類物質檢測方法 采用UHPLC-MS/MS 高通量檢測技術，檢測厭氧白茶樣本的20 種氨基酸目標含量，實驗方法如下：

目標提取：a.稱取20 mg 樣本于EP 管中，加入1000 μL 提取溶劑（體積比為乙腈:甲醇:水＝2:2:1，含同位素標記內標混合物，-40 ℃預冷，渦旋30 s 混勻；b.40 Hz 研磨處理4 min，冰水浴下超聲5 min，重復三次；c.-40 ℃靜置1 h；d.4 ℃，12000 r/min（離心力13800×g，半徑8.6 cm）離心15 min；e.取100 μL 上清液加900 μL 提取溶劑，渦旋30 s 混勻，在4 ℃，12000 r/min（離心力13800×g，半徑8.6 cm）離心15 min；f.取80 μL 上清液至LC 進樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS 分析。

氨基酸標準溶液配制：準確稱取相應量的標準品于10 mL 容量瓶中，分別配制成10 mmol/L 的標準品儲備液。取相應量的標準品儲備液于10 mL 容量瓶中，配制成混合標準溶液。依次稀釋該標準溶液得一系列校準溶液（含與樣品中濃度一致的同位素標記內標混合物）。

上機檢測：流動相條件：超高效液相色譜儀：Agilent 1290 Infinity II series（Agilent Technologies）；液相色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（100×2.1 mm，1.7 μm Waters）；液相色譜A相：1%甲酸水溶液，B 相：1%甲酸乙腈；其他：柱溫為35 ℃，樣品盤設為4 ℃，進樣體積為1 μL。

質譜條件：使用裝備AJS-ESI 離子源的Agilent6460 三重四極桿質譜儀。離子源參數如下：離子源電壓為正離子模式4000 V，負離子模式-3500 V，噴嘴電壓為正離子模式500 V，負離子模式-500 V，氣體（氮氣）溫度為300 ℃，氣體（氮氣）流量為5 L/min，鞘氣（氮氣）溫度為250 ℃，鞘氣流量為11 L/min，噴霧器為45 psi。

氨基酸目標定量、定性方法：進行UHPLCMS/MS 分析之前，將目標化合物標準溶液引入質譜中。針對每個目標化合物，選取信號強度最高的數個母離子與子離子對，對其MRM 參數進行優化，并選取其中響應最好的離子對用于定量分析，其它離子對用于目標化合物定性分析。

1.2.5 差異化合物篩選方法 利用統計學VIP 值、P值進行差異化合物篩選，選取VIP>1 且P<0.05 的化合物為差異化合物。

1.3 數據處理

所有數據測定平行進行3 次，計算平均值。數據處理及作圖采用SPSS26.0、Simca14.0 和WPS Office。使用 Agilent MassHunter Work Station Software（B.08.00，Agilent Technologies）處理氨基酸目標質譜數據與氨基酸目標定量分析。

2 結果與分析

2.1 不同季節云抗10 號厭氧加工白茶的感官評價

根據1.2.2 感官審評方法進行感官審評，結果如表1 所示，不同季節厭氧處理后白茶感官品質特征和得分存在明顯差異。SW 芽葉連枝，干茶色澤翠綠，勻整，香氣花蜜香、毫香帶藥香，湯色黃亮，滋味濃鮮甜爽，有回甘，葉底黃綠、軟嫩明亮，綜合得分為91.05。UW 芽葉連枝，干茶色澤翠綠，尚勻整，香氣花果香，湯色杏黃明亮，滋味鮮爽甜醇，葉底黃綠尚勻整，綜合得分為89.6。AW 芽葉連枝，干茶色澤青褐，勻整、亮，香氣甜香馥郁帶毫香，湯色杏黃明亮，滋味甜爽回甘，葉底黃褐、較軟嫩明亮，芽葉成朵，勻整，綜合得分為90.15。經過厭氧處理后，三個季節的白茶都展現了獨特工藝香（富含γ-氨基丁酸所表現出的獨特香氣類型），可能由于季節性原因，SW 本身內含成分更為豐富協調，所以從感官品質上來看，SW 品質綜合結果最優。

表1 不同季節厭氧處理加工白茶感官審評記錄Table 1 Sensory evaluation records of white tea processed by anaerobic treatment in different seasons

2.2 不同季節云抗10 號厭氧加工白茶的理化成分差異

由表2 可知，SW 可溶性糖、咖啡堿、水浸出物和黃酮的含量與其他兩季白茶有著顯著性差異（P<0.05）。游離氨基酸滋味多鮮甜，對于提高茶湯的鮮爽度、緩解苦澀味具有重要作用[24]，三個季節中氨基酸總量最高的是SW，可以達到5.78%，因其呈味特點可作為茶湯鮮爽味的主要影響成分。可溶性糖是茶湯滋味和香氣的來源之一，是構成茶湯甜味的主要成分[25]，本研究中三個季節可溶性糖的含量范圍在3.25%～4.23%，與劉東娜等[24]的研究一致，其中SW 可溶性糖含量（4.23%）最高，是其具有甜味回甘特點的主要原因。咖啡堿是構成茶葉滋味的主要成分，是苦味的主要貢獻者，既有刺激性又有提神作用[26]。SW 咖啡堿含量（5.25%）高于UW 與AW，三個季節白茶中咖啡堿的含量范圍在4.16%～5.25%，對滋味協調性有著重要貢獻作用，與和明珠等[27]的研究相一致。茶葉中水浸出物是指能被熱水浸出的物質，同時也是茶湯的主要呈味物質，其含量高低反映了茶葉中可溶性物質的多少，標志著茶湯的厚薄和滋味的濃強程度，在一定程度上還反映了茶葉品質的優劣[28]。SW 中水浸出物含量（53.97%）顯著高于其他兩季白茶，使其在感官上呈現滋味濃厚的特點。黃酮類物質及其氧化產物對白茶茶湯的色澤與滋味都有一定的影響[29]。本研究中SW 中黃酮含量最高，可以達到0.86%，三個季節白茶中黃酮的含量范圍在0.68%～0.86%。

表2 不同季節白茶中主要理化成分（%）Table 2 Main physical and chemical compositions in white tea in different seasons (%)

UW 中茶多酚的含量顯著高于SW 和AW（P<0.05），可以達到23.26%。茶多酚對白茶的色、香、味的形成影響極大，是茶葉中最主要的保健作用功能性成分[30]。三個季節白茶中茶多酚的含量范圍在18.67%～23.26%。由上可知，三個季節白茶中的主要生化成分差異顯著，主要差異性應與季節性關聯較大。夏季白茶茶多酚含量高于春季白茶和秋季白茶。結合感官審評結果，夏季白茶和秋季白茶雖然游離氨基酸含量和可溶性糖含量低于春季白茶，但是咖啡堿含量也低于春季白茶，可能是夏季白茶和秋季白茶依然呈現甜醇品質特征的原因。馬原等[31]研究表明茶多酚在夏季白茶中含量最低，與本研究結果相反，可能是因為品種差異及加工環境條件不同，夏季鮮葉當中茶多酚含量最高[32]，采用統一加工參數進行加工后，仍然是夏季白茶茶多酚含量最高。本研究中的白茶黃酮含量較低，可能是由于采用厭氧技術加工后，黃酮參與黃酮與類黃酮途徑生成γ-氨基丁酸從而產生較大消耗[33]。

2.3 不同季節云抗10 號厭氧加工白茶氨基酸組分差異

采用UHPLC-MS/MS 高通量檢測技術測定不同季節厭氧處理加工白茶樣品中γ-氨基丁酸（GABA）、L-谷氨酸和L-天冬酰胺等20 種氨基酸組分質量分數（表3）。由表3 可知，SW 中質量分數最高且與UW 和AW 有顯著性差異（P<0.05）的氨基酸組分有γ-氨基丁酸（1.22 mg/g）、L-酪氨酸（0.58 mg/g）、L-丙氨酸（0.52 mg/g）、甘氨酸（0.02 mg/g）、L-谷氨酸（1.69 mg/g）、L-蘇氨酸（0.53 mg/g）、L-谷氨酰胺（2.61 mg/g）、L-精氨酸（0.15 mg/g）。據圖1 以及結合相關氨基酸呈味研究[34]發現，L-丙氨酸、甘氨酸和L-蘇氨酸可能是SW 茶湯甜味的主要貢獻氨基酸。L-谷氨酰胺可能是SW 茶湯酸味和甜味的主要貢獻氨基酸。L-酪氨酸和L-精氨酸可能是SW 茶湯苦味的主要貢獻氨基酸。γ-氨基丁酸可能是SW 茶湯澀味的主要貢獻氨基酸。β-丙氨酸和L-瓜氨酸可能是SW 茶湯咸味的主要貢獻氨基酸。L-谷氨酸（1.69 mg/g）可能是SW 茶湯酸味、鮮味和咸味的主要貢獻氨基酸。

圖1 不同季節白茶中呈味氨基酸組分與含量差異Fig.1 Differences in flavour amino acid components and content in different seasons of white tea

表3 不同季節白茶中主要氨基酸成分（mg/g）Table 3 Main amino acid compositions in white tea in different seasons (mg/g)

UW 中質量分數最高且與SW 和AW 有顯著性差異（P<0.05）的氨基酸組分有L-絲氨酸（0.92 mg/g）、L-賴氨酸（0.17 mg/g）。L-絲氨酸可能是UW 茶湯甜味的主要貢獻氨基酸。L-苯基丙氨酸和L-賴氨酸可能是UW 茶湯苦味的主要貢獻氨基酸。

AW 中質量分數最高且與SW 和UW 有顯著性差異（P<0.05）的氨基酸組分有L-色氨酸（0.47 mg/g）、L-纈氨酸（0.75 mg/g）、L-脯氨酸（0.59 mg/g）、L-天冬氨酸（0.94 mg/g）、L-天冬酰胺（2.35 mg/g）。L-脯氨酸和4-羥基脯氨酸可能是AW 茶湯甜味的主要貢獻氨基酸。L-色氨酸和L-纈氨酸可能是AW 茶湯酸味與苦味的主要貢獻氨基酸。L-天冬氨酸可能是AW 茶湯酸味、鮮味和咸味的主要貢獻氨基酸。L-天冬酰胺可能是AW 茶湯酸味和甜味的主要貢獻氨基酸。

經過厭氧處理后，夏季白茶和秋季白茶γ-氨基丁酸含量仍然較低的原因可能是當季鮮葉本身氨基酸含量總量較低，因此缺少γ-氨基丁酸合成的前體物質谷氨酸。對于γ-氨基丁酸的富集，除了在萎凋前厭氧處理6 h 這種方式以外，后續還可以通過改變萎凋方式[35]，改變堆青次數[36]和選取成熟度更高的原料進行加工[37]等方式來進行提高白茶中γ-氨基丁酸含量的研究。

2.4 不同季節云抗10 號厭氧加工白茶品質成分PCA和差異化合物篩選分析

主成分分析圖可反映樣本中化合物豐度情況，樣本之間位置越近則越相似，越遠則反之[38]。以三個不同季節白茶的6 種理化成分和20 種氨基酸質量分數進行主成分提取，以第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）建模得到理化成分PCA 得分圖（圖2）和氨基酸PCA 得分圖（圖3）。理化成分主成分圖結果顯示，在模型中三個季節白茶各聚成3 簇，差異明顯且可以較好區分。圖1 中第一主成分PC1 的解釋率（R2X[1]）和第二主成分PC2 的解釋率（R2X[2]）建模可以解釋98.4%的理化成分數據（原始數據詳見表2），證明該模型結果較為穩定可靠。氨基酸主成分圖如圖2 結果顯示，在模型中三個季節白茶聚成3 簇，差異明顯且可以較好區分。且第一主成分PC1的解釋率（R2X[1]）和第二主成分PC2 的解釋率（R2X[2]）建模可以解釋97.84%的氨基酸成分數據（原始數據詳見表3），證明該模型結果較為穩定可靠。

圖2 不同季節白茶理化成分PCA 得分圖Fig.2 PCA scores of physical and chemical components of white tea in different seasons

圖3 不同季節白茶氨基酸成分PCA 得分圖Fig.3 PCA scores of amino acid compositions of white tea in different seasons

為進一步找出對結果分析起貢獻作用和春、夏、秋三季白茶品質差異的特征理化成分和氨基酸組分，采用VIP 篩選閾值（VIP>1）和t檢驗法（P<0.05）分析共得到15 種差異化合物（表4）。咖啡堿、黃酮、L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L-纈氨酸、γ-氨基丁酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、4-羥基脯氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺的含量差異有統計學意義，可作為區別三個季節的標志性差異化合物。

表4 春、夏、秋白茶中VIP 值>1 且具有顯著性差異的成分Table 4 Components with VIP value >1 in spring,summer and autumn white tea had significant differences

3 結論

本文以春、夏、秋三個季節的云抗10 號鮮葉為原料，經厭氧處理后采用統一參數加工白茶，運用感官審評、理化成分測定和UHPLC-MS/MS 高通量檢測技術檢測氨基酸組分含量，探究三個季節白茶的品質差異。研究表明，春季白茶外形翠綠勻整，香氣豐富，滋味濃鮮甜爽回甘，較夏秋兩季白茶品質較好。三個季節白茶理化成分具有顯著差異，氨基酸、可溶性糖、咖啡堿、水浸出物和黃酮在春季白茶中含量最高，茶多酚在夏季白茶中含量最高。三個季節白茶氨基酸組分具有顯著差異，γ-氨基丁酸、L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸在春季白茶中含量最高，L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、L-賴氨酸在夏季白茶中含量最高，L-色氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、4-羥基脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺在秋季白茶中含量最高。經過厭氧處理后，雖然三個季節的白茶在感官審評中都呈現了GABA 白茶的品質特征，如具有厭氧處理后的獨特工藝香等。但只有春季白茶γ-氨基丁酸含量接近GABA 茶標準（1.5 mg/g），因此春季云抗10 號鮮葉（一芽二、三葉）更適制GABA 白茶，后續可以通過檢測揮發性物質成分來進一步探索不同季節厭氧后加工的白茶品質差異。本實驗研究結果可為云南地區的白茶在GABA 白茶加工工藝優化、提質增效等方面提供理論指導。