基于右旋糖酐酶制備小麥多孔淀粉及其特性

王博巖，李 強，吳一卓，章均哲，吳旭東，張 磊，呂明生，王淑軍,

（1.江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室 江蘇海洋大學，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室 江蘇海洋大學，江蘇連云港 222005；3.海陽市市場監督管理局，山東煙臺 265100）

淀粉是自然界第二大碳水化合物，也是我國重要的食品和加工原料。通過物理、化學和酶法可制備功能淀粉，如：抗性淀粉、多孔淀粉、緩慢消化淀粉、淀粉基吸水劑、淀粉基表面活性劑、淀粉基絮凝劑等。功能淀粉主要應用于食品加工、食品包裝材料、藥物緩釋等領域，提高了淀粉的應用價值[1-2]。其中多孔淀粉主要通過物理、化學和生物酶法等方法制備[3-4]。

生物酶法制備多孔淀粉工藝簡單，綠色環保。葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶等單酶或多酶復合常用于制備多孔淀粉[5]。張倩倩等[6]對大米淀粉濕熱處理后，選用α-淀粉酶來制備大米多孔淀粉。宋志偉等[7]使用α-淀粉酶水解玉米淀粉，顯著提高了淀粉顆粒的比表面積。Das 等[8]用β-淀粉酶制備馬鈴薯和玉米多孔淀粉。Majzoobi 等[9]用α-淀粉酶來制備小麥多孔淀粉，吸水吸油率為27.87%和13.5%，甲基紫負載率為39.23%。然而，在小麥、紅薯、玉米等淀粉中含有的α-1,6 糖苷鍵，其對淀粉酶的水解有一定的阻礙作用[10]。右旋糖酐酶（Dextranase）能夠特異性水解α-1,6 糖苷鍵[11]。目前尚未見其用于制備多孔淀粉的報道。酶法制備的多孔淀粉廣泛應用于環境、醫藥和食品等領域，用于香料、抗氧化劑的載體，負載植物精油、功能性藥物和益生菌等活性物質[12-15]。功能性藥物多具有敏感性高、水溶性低和穩定性差的特點[16-17]。通過多孔淀粉負載后，可以顯著提高功能性藥物的活性[18]。

本研究選用小麥淀粉和右旋糖酐酶制備多孔淀粉。測定了小麥多孔淀粉的比容積、溶解率、膨脹率以及吸水吸油率。選取兩種廣泛添加于功能性食品的藥物（姜黃素和甲磺酸達比加群酯）和兩種抗生素（制霉菌素和氧氟沙星），研究了小麥多孔淀粉的負載率，測定了負載姜黃素的多孔淀粉在模擬胃腸道的釋放效果。研究結果以期為小麥多孔淀粉的加工提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級小麥淀粉 上海寶鼎釀造有限公司；右旋糖酐酶制備于糖單胞菌K1（發酵純化制備，活性≥0.5 U/mL）、姜黃素、制霉菌素、氧氟沙星、甲磺酸達比加群酯 阿拉丁股份有限公司；DNS 顯色劑（3,5-二硝基水楊酸）、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀和甲醇 分析純，國藥集團；花生油 益海嘉里股份有限公司；胃蛋白酶（1:30000）都萊生物生物技術有限公司；胰蛋白酶（1:250）鼎國昌盛生物技術有限公司。

FreeZone 凍干機 LABCONCO 股份有限公司；Scientific Multiskan Sky 全波長酶標儀、is5 傅里葉紅變換紅外光譜儀 Thermo 股份有限公司；X’PERT POWDER XRD 射線衍射 PANalytical 股份有限公司；JSM-6390LA 掃描電鏡 日本電子；SZ-100 粒度分析儀 HORIBA 股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 右旋糖酐酶制備小麥多孔淀粉 根據報道，物理處理有助于提高淀粉的酶解效率，本實驗選用了濕熱處理以提高多孔淀粉的制備效率[3]。

淀粉對酶敏感性的測定：稱取3 g 烘干至恒重的小麥淀粉，加入5%～35%超純水充分攪拌，密封后置于25 ℃水浴鍋中平衡20 h 后，在110 ℃下恒溫干燥箱中處理2 h，冷凍干燥后碾磨過200 目篩。稱取0.4 g濕熱處理小麥淀粉，加入1.6 mL（pH8.5，50 mmol/L）Tris-HCl 緩沖液，50 ℃水浴平衡10 min，加入1 mL酶液，50 ℃恒溫振蕩1 h，立即加入4% NaOH 2.5 mL溶液終止反應，用DNS 法測量釋放的葡萄糖的量。根據公式（1）計算淀粉對酶的敏感性。

式中：c 為DNS 比色法測得的葡萄糖質量濃度，mg/mL；v 為反應體系中液相體積，mL；0.9 為從葡萄糖到淀粉的轉化系數；m 為反應前淀粉質量，mg。

分別稱取3 g 酶敏感性最佳的濕熱處理淀粉與小麥淀粉，加入15 mL（pH8.5，50 mmol/L）Tris-HCl緩沖液，于燒杯中混合均勻，50 ℃恒溫搖床中預熱15 min，加入10 mL 酶液搖勻，在50 ℃下分別恒溫振蕩反應（2～16 h），在反應2、4、8、16 h 后加入4%NaOH 3 mL 溶液終止反應，12000 r/min 離心2 min，將淀粉冷凍干燥，研磨后過200 目備用。

1.2.2 小麥多孔淀粉的表面結構和粒徑分析 將小麥淀粉、濕熱小麥淀粉、酶解小麥淀粉、濕熱并酶解不同時間的小麥淀粉均勻加在導電膠上，噴金后用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）在6000 倍下觀測。多孔淀粉的粒徑分布用粒度分析儀測定，將小麥淀粉與小麥多孔淀粉（濕熱處理并酶解16 h 的小麥淀粉）加入去離子水，12 W 超聲20 s使淀粉顆粒均勻分散后檢測。

1.2.3 淀粉比容積、溶解率和膨脹率測定 采用張倩倩等[6]的方法確定多孔淀粉的比容積、溶解率和膨脹率。分別稱取2 g 濕熱并酶處理不同時間的小麥淀粉和天然小麥淀粉放入10 mL 量筒中。晃動量筒保持淀粉面水平，讓淀粉自由落下，求每克淀粉所占的體積，則為淀粉比容積。分別稱取0.3 g 濕熱并酶處理不同時間的小麥淀粉和天然小麥淀粉，加入15 mL 蒸餾水于燒杯中混合均勻，在60 ℃下攪拌30 min，5000 r/min 離心10 min，將上清液置于水浴鍋中沸水蒸干，然后于105 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重。根據公式計算溶解率（S）和膨脹率（B）：

式中：A 為上清液烘干后質量，g；W 為淀粉樣品干質量，g；P 為離心后沉淀質量，g。

1.2.4 多孔淀粉吸水和吸油率的測定 采用Liu等[19]的方法測定多孔淀粉的吸水和吸油率。分別稱取200 mg 濕熱并酶處理不同時間的小麥淀粉和天然小麥淀粉置于小燒杯中，加入2 mL 的花生油/水混合并攪拌30 min，倒入已知質量的離心管中，以4000 r/min 離心10 min，倒出離心后的上層液，倒置至油水不再滲出，根據公式（4）計算吸油/水率。

式中：W0為離心管的質量，g；W1為多孔淀粉干質量，g；W2為離心后離心管吸水（油）后的淀粉質量，g。

1.2.5 多孔淀粉藥品負載率的測定 采用Trindade等[20]的方法，測定姜黃素、甲磺酸達比加群酯、氧氟沙星和制霉菌素的負載率。即準確稱量多孔淀粉（濕熱并酶解16 h 的小麥淀粉），加入5 mL 去離子水制備均勻的乳液，加入1 mL 藥品溶液（2 mg/mL），使多孔淀粉與藥物的比例分別為10:1、20:1、40:1、80:1和160:1（w/w），超聲攪拌30 min。5000 r/min 離心10 min，將上清液去除，沉淀冷凍干燥。將干燥的樣品研磨后裝入棕色玻璃瓶，-20 ℃儲存。精確稱量100 mg 固定化后的多孔淀粉，與1 mL 二甲基亞砜分析純混合。使用渦旋振蕩儀混勻振蕩10 min 并在900 W 下超聲處理10 min，用0.45 μm 濾膜過濾，重復兩次。檢測吸溶液的吸光度值（藥品的吸收峰分別為姜黃素OD420nm，氧氟沙星OD324nm，甲磺酸達比加群酯OD340nm，制霉菌素OD310nm），依據標準曲線計算藥品的負載量。根據公式（5）計算負載率。

標準曲線：將2 mg/mL 的藥品用二甲基亞砜進行梯度稀釋，以二甲基亞砜為空白，測定不同稀釋液的吸光度值，繪制標準曲線。

1.2.6 X 射線衍射測定 將干燥多孔淀粉、負載藥品的多孔淀粉（160:1）和四種藥品在CuKα（λ=0.15406 nm）、功率為1600 W（40 kV×40 mA）、掃描范圍為5°～30°（2θ）、掃描速度5°/min、步長0.02 的條件下檢測。

1.2.7 傅里葉紅外光譜測定（FTIR）將干燥多孔淀粉、負載藥品的多孔淀粉（160:1）和四種藥品以1:200 比例與溴化鉀的混合研磨呈粉狀，在10 Pa 下壓片成型，波數范圍為4000～400 cm-1，分辨率為1 cm-1。

1.2.8 模擬多孔淀粉的胃腸道的溶出 姜黃素對光、熱、pH 具有高度的敏感性[21]，選取負載姜黃素的多孔淀粉進行體外模擬釋放試驗。采用Marefati等[22]的方法制備模擬的胃液和腸液。首先加入2 g NaCl，7 mL 1 mol/L 的HCl 和0.26 g 胃蛋白酶，接著用1 mol/L HCl 調節至pH2 并用超純水稀釋至1 L 制備模擬胃液。500 mL 超純水中加入6.8 g KH2PO4制備模擬腸液，然后加入胰酶（10 g/L），用0.1 mol/L NaOH 將pH 調節至6.5 并稀釋至1 L。按照1.2.5 的方法，將100 mg 不同比例負載的藥品加入1 mL 模擬胃液（pH=2.0），檢測藥品在模擬胃液中的釋放。將負載藥品的多孔淀粉裝入透析袋（截留分子量3 kDa），放入含有胃液的EP 管中。在37 ℃放置0 至2.5 h，每30 min 取樣檢測。隨即再將相同的透析袋置于1 mL 模擬腸液（pH6.5）中，在37 ℃放置0～5 h，每1 h 取樣檢測，根據公式（6）計算姜黃素的釋放率。

1.3 數據處理

本研究試驗均設置3 組平行，采用SPSS 24.0軟件進行Tukey’s 檢驗且，P<0.05 為統計學上顯著。采用Origin pro 9.1 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 淀粉含水量對酶敏感性的影響

濕熱處理淀粉的含水量對右旋糖酐酶敏感性有顯著影響。隨著含水量的增加，淀粉對酶的敏感性也隨之增加（圖1）。當淀粉含水量為30%時，淀粉對酶敏感性最高，酶敏感性達到8.5%，顯著高于含水量為25%和35%的7%和7.2%。增加含水量可使淀粉顆粒體積逐漸膨脹，支鏈淀粉附近的α-1,6 糖苷鍵發生斷裂的可能性增加，影響淀粉的結構，淀粉的無定形區對酶的可及性會增加[23]。然而，淀粉含水量過高時，濕熱處理使糊化程度加重，反而影響淀粉對酶的敏感性。因此，選擇含水量為30%的淀粉進行濕熱處理。

圖1 小麥淀粉含水量對酶敏感性的影響Fig.1 Effect of wheat starch moisture content on enzyme sensitivity

2.2 小麥多孔淀粉的表面結構與粒徑

如圖2 所示，原淀粉表面光滑，經酶處理后，淀粉顆粒表面出現凹坑，這與已報道的文獻相似[20]，隨著酶解時間延長，淀粉表面出現的凹坑逐漸增多，淀粉顆粒也逐漸變小，濕熱處理+酶解16 h 后，淀粉顆粒表面出現了明顯的孔洞，表明右旋糖酐酶可以制備小麥多孔淀粉。而使用酶處理的原淀粉在16 h 僅有較少的凹坑，結果表明濕熱處理有助于酶解制備多孔淀粉。經檢測，小麥淀粉和小麥多孔淀粉的平均粒徑分別為15.13±1.17、5.21±0.93 μm（圖3）。結果表明，右旋糖酐酶對小麥淀粉表面侵蝕使得淀粉粒直徑減小[24]。這與掃描電鏡顯示的結果一致。

圖2 不同處理方式的小麥淀粉的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of wheat starch treated in different ways

圖3 酶解對小麥多孔淀粉粒徑的影響Fig.3 Effect of enzymatic digestion on particle size of wheat porous starch

2.3 小麥多孔淀粉的比容積、溶解率和膨脹率

由表1 可知，隨著酶解時間的延長多孔淀粉的比容積、溶解率和膨脹率均顯著增加（P<0.05），酶解16 h 的小麥多孔淀粉比容積從1.21±0.01 提高到2.11±0.02 cm3/g。多孔淀粉的溶解率與膨脹率也分別達到了9.02%±0.21%與9.91%±0.22%。酶水解后，在非結晶區的直鏈淀粉會散出，從而提高了淀粉的溶解率[25]。在淀粉顆粒中形成的孔洞降低了其結構強度，水分子進入淀粉孔洞中，提高了淀粉的膨脹率。

表1 小麥多孔淀粉比容積、溶解率和膨脹率Table 1 Wheat porous starch specific volume,solubility and expansion ratio

2.4 小麥多孔淀粉的吸水和吸油率

表2 顯示，隨著酶解的時間的延長，小麥多孔淀粉的吸水和吸油能力顯著提高（P<0.05）。酶解16 h的淀粉的吸水率和吸油率分別達到了80.12%±2.30%和78.23%±3.00%。淀粉顆粒的孔洞數量的增多，使水和油的分子更容易進入淀粉的內部，提高了淀粉的吸水率和吸油率[26]。

表2 小麥多孔淀粉吸水吸油率Table 2 Water and oil absorption rate of wheat porous starch

2.5 小麥多孔淀粉的負載率

表3 顯示藥物的負載率。隨著多孔淀粉與藥物比例的增加，多孔淀粉負載藥物的量也隨著增加。四種藥品的平均負載率從14.30%±2.13%增加至75.07%±1.23%。多孔淀粉對不同藥物的負載率沒有顯著性差異（P>0.05）。多孔淀粉增加了表面積，使藥物負載于多孔淀粉中[27]。

2.6 小麥多孔淀粉負載藥物的XRD 檢測

對小麥淀粉、酶解小麥淀粉和負載藥物的多孔淀粉的檢測結果見圖4。酶解后的小麥淀粉在15°、17°、18°、23.5°主峰略有下降，與Song 等[28]報道的α-淀粉酶水解使蠟質玉米淀粉和普通玉米淀粉的主峰略有下降相似。表明右旋糖酐酶制備小麥多孔淀粉沒有破壞淀粉的晶體結構。文獻報道多孔淀粉是典型A 型晶型，在2θ為15°、17°、18°、23.5°處形成特征峰[29]。通過對比淀粉、多孔淀粉、姜黃素、甲磺酸達比加群酯、制霉菌素、氧氟沙星的XRD 光譜圖，負載了四種藥物的小麥多孔淀粉未顯示出其藥物原有的特征峰。與報道的酪蛋白負載姜黃素的結果相似，即XRD 圖譜中觀察不到姜黃素的特征峰[28]。因此，小麥多孔淀粉負載四種藥物后，四種藥物的特征峰消失，表明四種藥物已被成功地包埋在多孔淀粉中了[30]。

圖4 小麥淀粉和酶解淀粉（A）、藥品（B）和多孔淀粉包封藥品（C）的XRDFig.4 XRD of wheat starch and enzymatic hydrolysis of starch(A),drugs (B) and porous starch encapsulated with drugs (C)

2.7 小麥多孔淀粉負載藥物的FTIR 檢測

圖5A 顯示，經酶處理后，小麥多孔淀粉特征吸收峰與小麥淀粉相比沒有明顯變化，多孔淀粉在2927、1646、1241、1367 cm-1處的特征峰分別為-CH2、C-C、C-O 和C-O-O 這與文獻[31]報道的一致。表明酶處理后，多孔淀粉保留了基本成分。

圖5 小麥淀粉和酶解淀粉（A）、多孔淀粉負載制霉菌素和氧氟沙星（B）和多孔淀粉負載姜黃素和甲磺酸達比加群酯（C）的紅外圖譜Fig.5 Infrared spectra of wheat starch and enzymatic hydrolysis of starch (A),porous starch encapsulated with mycophenolate and ofloxacin (B) and porous starch encapsulated with curcumin and dabigatranate mesylate (C)

FT-IR 光譜檢測結果表明，小麥多孔淀粉均有效地負載了藥物。多孔淀粉在1646 cm-1處有特征峰，負載制霉菌素后，該峰紅移到1630 cm-1，負載氧氟沙星后，該峰紅移到1622 cm-1，負載姜黃素后，該峰紅移到1628 cm-1，負載甲磺酸達比加群酯后，該峰紅移到1610 cm-1。此外，由圖5B 和5C 可見，負載藥物多孔淀粉均保留了藥物和多孔淀粉的特征峰。如：姜黃素在1602 cm-1處可以觀察到的特征峰，同時，在多孔淀粉負載的姜黃素中也可觀察到1602 cm-1處的峰。表明小麥多孔淀粉可以負載疏水性的藥物。

2.8 小麥多孔淀粉負載藥物的體外釋放

在模擬胃消化液中，負載姜黃素多孔淀粉的釋放率見圖6（A）。藥品的釋放率受多孔淀粉的載藥量影響較大。多孔淀粉與姜黃素的比例為10:1、20:1、40:1、80:1、160:1 時，2.5 h 的釋放率分別為25.25%、28.15%、29.1%、30%、33.8%。

圖6 小麥多孔淀粉負載姜黃素在胃液（A）和腸液（B）中的釋放Fig.6 Release of wheat porous starch-fixed curcumin by gastric(A) and intestinal (B) fluids

經過胃模擬釋放后，負載姜黃素的多孔淀粉再次在模擬腸液中釋放，結果見圖6（B）。多孔淀粉與姜黃素的比例為10:1、20:1、40:1、80:1、160:1時，姜黃素5 h 的釋放率分別為35.58%、37.52%、37.96%、38.21%和42.43%。數據表明，姜黃素在腸道中的釋放率增加。胃和腸道的pH 的變化大，從pH2 升到pH6.5，影響了腸道中酶的活性，且在腸道中釋放時間為5 h，從而影響了多孔淀粉中藥物的釋放[28]。

根據文獻報道，多孔淀粉可以減緩負載藥品的釋放[18]。多孔淀粉通常在小腸環境中難以消化，可以成功地將負載的藥物輸送到結腸中，并被微生物群分解為碳水化合物，最終使負載的藥物全部釋放[32-33]。

3 結論

本研究用右旋糖酐酶制備小麥多孔淀粉。結果表明，濕熱處理可促進右旋糖酐酶制備多孔淀粉，淀粉含水量為30%時，淀粉對酶的敏感性最高。在酶處理16 h 后，多孔淀粉的比容積為2.11±0.021 cm3/g，吸水率和吸油率分別提高到80.12%和78.23%；多孔淀粉對四種不同藥物均表現出較好的負載能力。當多孔淀粉與藥物的比例為160:1 時，藥物負載率均超過了70%。XRD 結果表明，原淀粉和多孔淀粉的結晶型為A 型，酶處理沒有改變小麥淀粉的結晶構型；FTIR 圖譜顯示，原淀粉和多孔淀粉的特征吸收峰沒有明顯變化，吸附了藥物的多孔淀粉顯示出藥物的特征峰。在胃液中模擬藥物釋放，2.5 h 的釋放率約為30%。在腸液中模擬藥物釋放，5 h 的釋放率約為40%。小麥多孔淀粉負載姜黃素可以顯著降低藥物的釋放。研究結果為制備小麥多孔淀粉提供了實驗依據。