椰毒假單胞菌酵米面亞種產毒差異蛋白質組學分析

黃秀麗 ，沈 圣，朱文娟，陳佳平，陳國培，趙智鋒，黃永德，陳嘉聰，溫曉裕

（1.惠州市食品藥品檢驗所，廣東惠州 516003；2.惠州市市場監督管理信息中心，廣東惠州 516003；3.深檢集團（深圳）醫學檢驗實驗室，廣東深圳 518131）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans，簡稱椰毒假單胞菌），屬于唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia gladioli）致病變種，它容易在酵米面制品、淀粉制品及變質的木耳或銀耳等食物中生長，在適宜的溫濕度條件下短時間內即可產生大量的米酵菌酸毒素，誤食后會引發嚴重食物中毒甚至死亡[1-2]。椰毒假單胞菌是一種高致死性的食源性致病菌，米酵菌酸毒素是主要致死因子，探討該菌米酵菌酸毒素產生機制，對于有效防控由該菌引起食物中毒事件的發生具有重要指導意義[3-8]。

國內外針對椰毒假單胞菌米酵菌酸毒素產生機制及致病機理等方面的研究均有報道[8-11]，尤其是近年來隨著分子生物學技術的發展，利用基因測序技術從基因組水平揭示米酵菌酸毒素產生機制，發現米酵菌酸毒素產生與bon基因簇有關[12-13]。產毒株中存在較完整的bon基因簇，而非產毒株中存在該基因簇的缺失，推測是同源重組導致[13]。利用蛋白質組學技術從蛋白質組水平探討米酵菌酸毒素產生機制的研究還未見報道。

目前基于多組學包括基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組等技術開展致病菌產毒機制及致病機理的研究報道較多[13-16]，采用多組學技術可以從基因、蛋白和通路等多個分子水平進行綜合分析，更深入地探討相關分子機制。本研究對3 株椰毒假單胞菌完成了基因測序基礎上[13]，利用DDA 非標記定量蛋白質組學技術對菌株產毒培養前后差異表達蛋白進行分析，試圖找到產毒相關蛋白，從蛋白質水平探討米酵菌酸毒素產生機制。利用多組學技術探討米酵菌酸毒素產生機制，可為酵米面制品、淀粉制品等食品生產企業、餐飲企業有效防控由椰毒假單胞菌導致的食品安全風險，進而更好地控制其危害提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株YD、YF、YM 分別從泰國碎白米、東北云耳以及緬甸碎白米中分離且鑒定為產米酵菌酸毒素的椰毒假單胞菌（P.cocovenenanssubsp.farinofermentans），即產毒株；唐菖蒲伯克霍爾德氏菌CICC 10574（B.gladioli，自命名為菌株BL）為不產生米酵菌酸毒素的對照菌株，即非產毒株 購于中國工業微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基（批號11110101）、馬鈴薯葡糖糖半固體瓊脂培養基（批號1101651）廣東環凱微生物科技有限公司；米酵菌酸對照品 上海安譜公司，純度≥95%；QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增強型脂質去除凈化管 廣州安捷倫科技公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美國沃特世；Bradford 蛋白定量試劑盒（批號P0006）碧云天。

B80-1600‖A2 生物安全柜 蘇州安泰空氣技術有限公司；BSP-400 型生化培養箱 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；GT-2227QTS 型智能超聲波清洗儀 廣東固特超聲股份有限公司；Fotector Plus 型高通量全自動固相萃取儀 廈門睿科集團股份有限公司；LCMS-8040 三重四級桿液質聯用儀 日本島津公司；EASY-nLC1200 納升液相色譜儀、Orbitrap exploris 480 高分辨質譜儀 賽默飛世爾科技中國。

1.2 實驗方法

1.2.1 產毒培養 參照GB 4789.29-2020 進行產毒試驗[17]。將試驗用菌株YD、YF、YM 以及BL 分別接種于PDA 培養基上，（36±1）℃培養24～36 h 活化。用滅菌接種環刮取適量菌苔，加到3 mL 無菌生理鹽水的試管中，配成1 麥氏濃度（MCF）的菌懸液（約108CFU/mL），用無菌吸管吸取0.5 mL，滴在鋪好無菌玻璃紙的直徑150 mm 馬鈴薯葡萄糖半固體平板上，用無菌L 棒涂布均勻，于（26±1）℃培養5 d。無菌吸管吸取0.5 mL 無菌生理鹽水作為空白對照。

1.2.2 毒素含量測定 毒素制備參考文獻[18]。將產毒培養后的馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂轉移至三角瓶，100 ℃流動蒸汽滅菌30 min，室溫冷卻后置于-20 ℃冰箱冷凍過夜，第2 d 取出三角瓶置室溫融化，用無菌吸管吸出凍融液，經濾紙過濾至無菌試管或錐形瓶中即為毒素粗提液。取5 mL 毒素粗提液于50 mL 離心管中，加入2 倍體積的80%甲醇水溶液，超聲提取10 min，離心后吸取上清液進行凈化處理。取5 mL 上清液于裝有dSPE EMR-Lipid 吸附劑的凈化柱中，渦旋2 min 后離心，取2 mL 上清液于40 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，0.22 μm有機濾膜過濾后測定。

毒素測定參考文獻[18]。標準溶液配制：準確稱取米酵菌酸標準品10 mg（精確至0.01 mg），用甲醇溶解后轉移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，終濃度為0.1 mg/mL。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序為：0～1.5 min，B：20%；1.5～2.5 min，B：20%～95%；2.5～5.0 min，B：95%；5.0～6.0 min，B：95%～20%；6.0～7.0 min，B：20%。質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；負離子掃描模式；DL 管溫度為250 ℃；加熱器溫度為400 ℃；霧化氣流量為3 L/min；干燥氣流量為15 L/min；其他質譜參數見表1。

表1 米酵菌酸的質譜參數Table 1 Chromatogram parameters of bongkrekic acid

1.2.3 蛋白質組學分析 菌體收集：產毒培養結束后將帶菌的玻璃紙放入滅菌的50 mL 離心管中，加入30 mL 無菌生理鹽水，振蕩5 min，用滅菌后的鑷子取出玻璃紙，離心管10000 g 離心10 min，棄去上清液，再加入30 mL 無菌生理鹽水，振蕩后離心，重復2～3 次，沉淀即為收集的菌體。試驗重復3 次，每次3 個平行，每3 個平行樣混合為1 個樣本，用于蛋白質樣本制備。

樣品前處理為課題組自建方法，具體操作如下：稱取100 mg 樣本，加入500 μL 尿素裂解液（尿素8 mol/L，tris 50 mmol/L，含1×蛋白酶抑制劑，pH8.0），樣本在冰水浴中用探頭式超聲儀超聲10 min（超3 s，停2 s，功率30%）至溶液變澄清；超聲處理后的樣品于4 ℃下20000×g 離心15 min，取上清480 μL至新的離心管，使用Bradford 蛋白定量試劑盒定量，加50 mmol/L 碳酸氫銨稀釋樣本，使蛋白濃度約5 μg/μL 左右；加1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）到樣本中，終濃度為10 mmol/L，37 ℃孵育1 h；樣本冷卻至室溫，加1 mol/L 碘乙酰胺（IAA）至終濃度為20 mmol/L，室溫避光孵育1 h；樣本全部轉移至FASP 超濾管中14000×g 離心15 min，加入200 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨，14000×g 離心15 min，除去收集管中廢液，重復2 次；超濾管放到新EP 管上（封口膜密封接口處），加入100 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨和2 μL trypsin，37 ℃孵育12～16 h；14000×g 離心15 min 收集肽段，加100 μL H2O，14000×g 離心15 min，以徹底收集肽段；加入20%甲酸至終濃度0.5%，冰上靜置15 min 終止酶解；在含有抽干肽段的離心管中加40 μL 0.1%甲酸水溶液，劇烈渦旋5 min 充分溶解肽段，4 ℃下20000×g 離心30 min，取上清35 μL 于新的離心管；使用nanodrop 測定肽段濃度，用0.1%甲酸水溶液調節其濃度到500 ng/μL。

液相色譜條件：色譜柱：C18自制柱（內徑：100 μm，長度30 cm）；流動相：A：0.1%甲酸水；B：20%乙腈水+0.1%甲酸；梯度洗脫程序：0～95 min，B：5%～40%；95～113 min，B：40%～50%；113～115 min，B：50%～90%；115～120 min，B：90%；流速：300 nL/min；上樣量：500 ng。質譜條件：一級質譜參數為分辨率：60000；掃描范圍（m/z）：350～1500；射頻透鏡（%）：50；自動增益控制目標（%）：300；最大累積時間（ms）：20；電荷價態范圍：2～7；動態排除模式：排除前1 次掃描，排除時間持續60 s，強度閾值：5e4；二級質譜參數為隔離窗口（m/z）：1.6；碰撞能（%）：30；分辨率：15000；自動增益控制目標（%）：標準模式；最大累積時間（ms）：22。

1.3 數據處理

采用MaxQuant 軟件（version 2.0.3.1）對DDA質譜數據進行搜索鑒定，數據庫為Uniprot（Burkholderia gladioli），蛋 白FDR（假陽性率）<0.01 的為鑒定成功。數據的統計分析主要由R 軟件（Version 4.0）完成，顯著差異蛋白分析由R 包metaX 完成。產毒前后顯著性差異蛋白的篩選主要通過單變量分析來計算。菌株產毒培養前的2 次重復蛋白表達量平均值作為一個變量（D（菌株YD）/F（菌株YF）/M（菌株YM）/L（菌株BL）），產毒培養后3 次重復蛋白表達量平均值作為一個變量（CD（菌株YD）/CF（菌株YF）/CM（菌株YM）/CL（菌株BL）），差異倍數FC（Fold change）則為CD:D、CF:F、CM:M 和CL:L 的比值。當FC≥1.5 且T檢驗統計顯著性P-value≤0.05 則為上調（up-regulated），FC≤0.67且P-value≤0.05 的則為下調（down-regulated）[19-20]。采用BLAST 軟件與KEGG 數據庫比對，設置Evalue<1e-5，從而注釋到每個鑒定蛋白的通路。

2 結果與分析

2.1 顯著性差異蛋白的統計

利用DDA 非標記定量蛋白質組學技術對4 個菌株產毒培養前后菌體蛋白質進行分析。共鑒定到38161 條序列，4420 個蛋白。產毒培養后菌株米酵菌酸毒素產生情況（結果表示為平均數±標準差）及鑒定蛋白統計見表2。

產毒培養5 d 后，菌株YD、YF、YM 及BL 中較接種前顯著性差異表達蛋白統計見圖1。產毒菌株YD 上調表達蛋白為254 個，下調表達為235 個；產毒菌株YF 上調表達蛋白為228 個，下調表達為410 個；產毒菌株YM 上調表達蛋白為238 個，下調表達為313 個；標準菌株BL 上調表達蛋白為135 個，下調表達為330 個。產毒培養后，產毒菌株YD、YF 及YM 中上調表達的蛋白在228～254 個之間，均明顯多于標準菌株BL，下調表達的蛋白則菌株YD 低于菌株BL，而菌株YF 高于菌株BL，菌株YM 與菌株BL 較接近。

圖1 不同菌株產毒培養后顯著性差異表達的蛋白Fig.1 Significantly differentially expressed proteins of different strains after toxin-producing culture

2.2 顯著性差異蛋白的功能注釋

本研究利用多個功能數據庫（GO、Pathway、Reactome 等）對鑒定到的蛋白進行功能注釋，以期揭示顯著性差異蛋白功能分類。其中KEGG PATHWAY 數據庫中將生物代謝路徑劃分為6 類。產毒培養后菌株YD、YF、YM 及BL 中顯著性差異表達蛋白參與代謝路徑統計見表3。差異表達的蛋白中，參與新陳代謝路徑蛋白占比最多，占71.86%，如碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質代謝等；其次為參與遺傳信息傳遞蛋白，占9.70%，如翻譯、折疊、分類和降解以及復制、修復等；參與人類疾病蛋白也較多，占9.51%，如耐藥性等；再其次為參與生物體系統蛋白，占5.61%，如衰老、免疫系統等；參與細胞過程蛋白，占2.00%，如運輸和分解代謝等；參與環境信息處理蛋白最少，占1.33%，如信號轉導等。

表3 顯著性差異蛋白參與代謝路徑統計Table 3 Significant difference in protein participation in metabolic pathway statistics

2.3 產毒株與非產毒株間顯著性差異蛋白分析

為了從蛋白質水平探索米酵菌酸毒素產生機制，對產毒株與非產毒株產毒培養前后差異表達蛋白進行了分析。產毒培養后，在3 株產毒株中均顯著性上調表達蛋白為30 個，其中有5 個蛋白在非產毒株BL 中也上調表達，故選取僅在產毒株產毒過程中顯著性上調表達的25 個蛋白進行分析（見表4）。產毒培養后，在3 株產毒株中均顯著性下調表達蛋白為65 個，其中34 個蛋白在非產毒株BL 中也下調表達，故選取僅在產毒株產毒過程中顯著性下調表達的31 個蛋白進行分析（見表5）。產毒培養后，未找到在產毒株中顯著性上調表達而在非產毒株中顯著性下調表達或者在產毒株中顯著性下調表達而在非產毒株中顯著性上調表達的蛋白。

表4 產毒培養后在產毒株中顯著性上調表達的蛋白Table 4 Proteins significantly up-regulated in toxin-producing strains after toxin-producing culture

表5 產毒培養后在產毒株中顯著性下調表達的蛋白Table 5 Proteins significantly down-regulated in toxin-producing strains after toxin-producing culture

產毒培養后，僅在產毒株中顯著性上調表達蛋白有25 個，包括參與抗生素、氨基酸合成的二氫吡啶二羧酸合成酶、二羥基酸脫水酶，參與氨基酸代謝的過氧化氫酶、酰胺水解酶，參與淀粉和蔗糖代謝的α淀粉酶家族蛋白，參與氮素代謝的碳酸酐酶，參與磷酸肌醇代謝的Io1C 蛋白等。與細菌趨化性相關蛋白有核糖ABC 轉運蛋白、反應調節受體蛋白、甲基受體趨化性蛋白II 等，鞭毛組件包括鞭毛P 環蛋白、鞭毛M 環蛋白、鞭毛鉤蛋白FlgE，鞭毛是細菌移動和趨化性的運動器官，同時與細菌致病性也密切相關[21]。此外，與群體感應、毒素產生相關的轉錄調節因子LysR 家族蛋白（F2LH04）也在產毒培養后顯著性上調表達。除上述蛋白外，還有5 個未知蛋白也在產毒培養后顯著性上調表達。

產毒培養后，僅在產毒株中顯著性下調表達蛋白有31 個，包括參與萜類骨架及萜類生物合成的角鯊烯-蒎烯環化酶、4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶、4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶，參與淀粉和糖類代謝的CDP-6-脫氧-δ-3，4-葡萄糖還原酶、UDP-N-乙酰烯醇丙酮酰葡糖胺還原酶、UTP -葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶，參與氨基酸代謝的多胺氨丙基轉移酶、氨甲酰磷酸合酶、磷酸組氨醇轉氨酶，還有參與葉酸生物合成的GTP 3’，8-環化酶、GTP 環化水解酶FolE2，與核糖體相關的50S 核糖體蛋白L31 型B、30S 核糖體蛋白S2。轉錄調節因子LysR 家族蛋白（F2LAQ5）在產毒培養后其表達量降低。除上述蛋白外，還有4 個未知蛋白也在產毒培養后顯著性下調表達。

3 討論

本研究應用DDA 非標記定量蛋白質組學技術對椰毒假單胞菌（產毒株）與非產毒株產毒培養前后差異表達的蛋白進行分析，旨在從蛋白質水平探索米酵菌酸毒素產毒機制。通過對產毒株與非產毒株產毒培養前后差異蛋白分析，篩選到56 個顯著性差異蛋白，其中包括上調蛋白25 個，下調蛋白31 個。這些蛋白中有參與抗生素合成、氨基酸合成與代謝、淀粉和糖代謝、能量代謝等相關蛋白，也有與生物膜形成、群體感應、毒素產生、脅迫響應等相關蛋白，還有一些功能未知蛋白。產毒培養后，產毒株中顯著性上調表達的25 個蛋白中，有6 個蛋白與細菌趨化性相關，占比較高，基于趨化性與病原菌致病性等相關研究的報道[21-24]，推測趨化性可能在椰毒假單胞菌米酵菌酸毒素產生過程中發揮重要作用。

趨化現象在運動性細菌中普遍存在，細菌通過受體蛋白感知環境信號，隨后調整鞭毛運動方向來趨利避害進而得以存活下來[22]。有研究發現趨化性與病原菌致病性相關，在病原菌定殖和侵染過程中發揮重要作用，趨化性和運動性增強了病原菌的侵染力，運動和趨化突變體導致致病性明顯減弱[23-24]。了解趨化性在細菌致病機理中的作用，可為通過趨化性控制細菌侵染、減少病害發生提供理論依據。此外，有些細菌對環境污染物如芳香族化合物、硫化物等具有趨化性，越來越多的研究結果顯示趨化性與降解性緊密相關，細菌趨化性在環境污染治理、生物修復中也發揮重要作用[25-26]。

趨化運動在伯克霍爾德菌（Burkholderia）中也普遍存在。伯克霍爾德菌利用趨化性尋找盤基網柄菌宿主以維持共生關系[27]。洋蔥伯克霍爾德氏菌G4對甲苯、三氯乙烯、和維生素C 等具有趨化性[28]。伯克霍爾德氏菌SJ98 對氯代芳香族化合物具有趨化性等[29]。椰毒假單胞菌是唐菖蒲伯克霍爾德菌中的致病變種，趨化性與該菌致病性等相關研究還未見報道。基于趨化性與細菌致病性相關研究的報道，以及本研究發現產毒培養后產毒株中趨化性及鞭毛運動性相關蛋白表達量顯著增加現象，推測趨化性可能在椰毒假單胞菌米酵菌酸毒素產生過程中發揮重要作用，后續可開展趨化性與該菌米酵菌酸毒素產生及致病相關機理研究。

此外，椰毒假單胞菌產毒培養后，基質中可檢測到高含量的米酵菌酸毒素，該毒素為一種脂肪酸類物質，有研究報道磷脂類和不飽和長鏈脂肪酸類可引起假單胞菌（Pseudomonas）負趨化運動[30]，米酵菌酸毒素是否作為負趨化物，介導了椰毒假單胞菌的趨化性運動以躲避有害環境進而攫取營養產生更多的米酵菌酸毒素，后續還需進一步實驗確證，比如通過電鏡觀察毒素產生過程是否發生鞭毛著生方式的變化，通過游動平板法等方式觀察產毒培養過程中是否會發生運動方式的改變以及群集趨化性反應等。通過了解趨化性在椰毒假單胞菌米酵菌酸毒素產生及致病過程中的作用，后續可以通過趨化性控制細菌感染及毒素產生，進而為減少由該菌引起的食品安全事故的發生提供理論依據。

4 結論

通過對椰毒假單胞菌產毒培養前后差異蛋白質組學分析，篩選出了56 個僅在產毒株中顯著性差異表達蛋白，這些蛋白參與抗生素合成、氨基酸代謝、群體感應、趨化性以及毒素產生等活動。趨化性在運動細菌中普遍存在，產毒培養后產毒株中趨化性信號受體蛋白以及鞭毛組件蛋白表達量顯著增加，推測趨化性運動可能在米酵菌酸毒素產生過程中發揮重要作用，米酵菌酸毒素是否作為趨化物介導了椰毒假單胞菌趨化性運動以趨利避害進而更有利于米酵菌酸毒素的產生，還需進一步確證。