玉米麩皮阿拉伯木聚糖復(fù)合納米載體負(fù)載香草醛及其抑菌性能研究

安 迪，蔡 翔，呂雯欣，陸雅琦，李 丹，馬福敏

（長(zhǎng)春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130022）

香草醛，又名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛，是一種天然有機(jī)化合物，具有多種生物活性，如抗氧化性、抗菌性、抗病毒性和抗炎性等，作為食品香精、保鮮劑、抗氧化劑等廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[1-2]。香草醛的分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基和醛基可與細(xì)菌相互作用，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)食品腐敗菌革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有活性，因此可作為一種食品防腐劑應(yīng)用于食品加工與保藏[3]。然而，香草醛的穩(wěn)定性和水溶性較差，使得香草醛的生物活性不能得到充分發(fā)揮，這極大地影響了香草醛的應(yīng)用范圍[4]。

納米遞送體系是采用納米級(jí)載體包裹待遞送的物質(zhì)，以提高包裹活性物質(zhì)的功能特性的混合體系。該體系具有控制釋放速度、減少食品中營(yíng)養(yǎng)成分損耗的緩釋性優(yōu)點(diǎn)，從而起到增強(qiáng)傳遞效率的作用。多糖或蛋白質(zhì)常用來(lái)作為納米載體，但單一多糖或蛋白質(zhì)納米載體的穩(wěn)定性及生物相容性較低[5]。阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）存在于多種糧食作物的種皮中，親水性強(qiáng)，黏度大，且具有抗氧化和抗炎等多種生物活性，是蛋白質(zhì)和多肽等生物活性物質(zhì)理想的載體[6-7]。玉米醇溶蛋白（Zein）存在于玉米胚乳細(xì)胞，疏水性強(qiáng)，并具有良好的生物相容性[8-10]，但因其水溶性差，且在高離子強(qiáng)度、高溫等極端條件下易變性，限制了其應(yīng)用范圍[11-12]。AX 可與Zein 之間通過(guò)靜電、疏水與氫鍵作用形成的復(fù)合物，增強(qiáng)納米載體的穩(wěn)定性。Dalmolin 等[4]通過(guò)將香草醛負(fù)載于聚乳酸納米粒子中，提高了香草醛的穩(wěn)定性。Li 等[5]將香草醛與殼聚糖交聯(lián)制備可以遞送藥物的納米體系，研究發(fā)現(xiàn)，此種納米粒子可以精準(zhǔn)遞送和釋放藥物，且未來(lái)可作為抗癌藥物載體使用。因此，負(fù)載香草醛的納米載體具有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究將純化后的玉米麩皮AX 組分（F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2）與Zein 復(fù)合，制備負(fù)載香草醛的納米載體，研究其作為香草醛的運(yùn)載體時(shí)的包埋效果及其對(duì)食品中常見(jiàn)的致病菌-單增李斯特菌和大腸桿菌的抑菌效果，為負(fù)載香草醛的復(fù)合納米載體的穩(wěn)定性和抗菌性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米麩皮粗多糖（20%～32%）實(shí)驗(yàn)室自制；玉米醇溶蛋白 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；香草醛麥克林公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿洛糖，均為色譜純）

德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth，TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic Soy Agar，TSA）青島科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；單增李斯特菌（BIO-52964）智立中特（武漢）生物科技有限公司；大腸桿菌O157:H7（CICC21530）吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院贈(zèng)與。

GC-14C 氣相色譜儀 日本島津公司；Spectra-Max M3 多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices 公司；FDU-2100 冷凍干燥儀 日本日立公司；DSC Q2000 差示掃描量熱儀 美國(guó)TA 公司；HiTrap capto（5 mL×3）離子交換柱 美國(guó)GE 公司；AKTA Purifier 型蛋白質(zhì)純化儀 美國(guó)GE 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AX 的分離純化 將80%和90%醇沉后干燥的玉米麩皮粗多糖配成0.1 g/mL 的溶液，經(jīng)陰離子交換柱HiTrap capto 分離純化，用20 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液和含有0.5 mmol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液梯度洗脫，分別各得到兩個(gè)組分多糖[11]。將不同組分的多糖分別收集，濃縮后冷凍干燥，得到四個(gè)組分，分別為F80-1、F80-2、F90-1 和F90-2。

1.2.2 單糖組成測(cè)定 參考閆光玲等[13]的方法，F(xiàn)80-1、F80-2、F90-1 及F90-2 組分的AX 水溶液（濃度為8 mg/mL），分別用4 mol/L 三氟乙酸（體積比1:1）在110 ℃下水解60 min，水解后樣品中加入50%，w/v 的阿洛糖內(nèi)標(biāo)，經(jīng)NaBH4還原（濃度為200 mg/mL）、乙酸酐酯化后，采用氣相色譜法測(cè)定單糖組成。

進(jìn)樣條件：色譜柱：30 m SupelcoSP-2380 柱（內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.2 μm）；載氣：氮?dú)猓∟2）；進(jìn)樣量：4.0 μL；進(jìn)樣溫度：280 ℃；檢測(cè)溫度：280 ℃；程序升溫：初始溫度100 ℃，2 min；10 ℃/min 升至280 ℃，維持10 min；20 ℃/min 降至100 ℃，維持2 min。以阿洛糖為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法結(jié)合峰面積歸一化法，采用N2000 色譜工作站對(duì)各單糖含量進(jìn)行定量。

1.2.3 無(wú)菌納米載體的制備 根據(jù)Yuan 等[14]的方法，采用反溶劑沉淀法制備納米載體。稱取Zein 和香草醛（質(zhì)量比為10:1）溶于乙醇溶液（80%，V/V）中，以500 r/min 的速度攪拌8 h，得到橙黃色澄清溶液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2 溶于無(wú)菌水（濃度為5 mg/mL），500 r/min 常溫下攪拌過(guò)夜，在無(wú)菌環(huán)境下用注射器將制備好的Zein 復(fù)合香草醛溶液以4:3（m/V）、1:3（V/V）的比例緩慢滴入pH4.0 的多糖溶液中，得到負(fù)載香草醛的Zein-AX 分散液。在40 ℃，-1 MPa 條件下，蒸發(fā)掉乙醇，2800 r/min 離心10 min，去除未包封的香草醛。

1.2.4 納米載體包封率的測(cè)定 將新制備的納米復(fù)合載體2800 r/min 下離心10 min，以除去未包封的香草醛沉淀。將收集到的香草醛沉淀溶于2 mL無(wú)水乙醇中，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)膜過(guò)濾后，用酶標(biāo)儀在320 nm 處測(cè)量吸光度。

參照相同條件下制備的香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0146x-0.0089（R2=0.9955），代入方程可得到香草醛濃度。包封率計(jì)算公式如下：

1.2.5 熒光光譜法測(cè)定分子間作用 參照Li 等[15]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。F80-1、F80-2、F90-1 和F90-2 與Zein 制備的復(fù)合納米載體經(jīng)適當(dāng)稀釋后，熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描波長(zhǎng)范圍為300～370 nm，以水為空白，Zein 包埋香草醛制成的納米載體作為對(duì)照，用去離子水將測(cè)量的樣品稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋總€(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，繪制熒光光譜圖。

對(duì)于SCV溫度串級(jí)控制系統(tǒng)，根據(jù)前述分析，其數(shù)學(xué)模型可以近似地以一階慣性環(huán)節(jié)來(lái)逼近，考慮SCV水浴系統(tǒng)的過(guò)程特性[10-11]，通過(guò)測(cè)量系統(tǒng)的階躍響應(yīng)曲線，利用切線法，求得主控對(duì)象NG出口溫度和副控對(duì)象SCV水浴溫度的數(shù)學(xué)模型分別為:

1.2.6 差示掃描量熱法（DSC）測(cè)定 參照Hosseini等[16]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取樣品4.0 mg，并將其放入密封的固體坩堝中，以空鋁盤作為對(duì)照，使用DSC Q2000 差示掃描量熱儀對(duì)F80-1、F80-2、F90-1 和F90-2 與Zein 制備的納米載體進(jìn)行掃描，掃描溫度為20～120 ℃，掃描速度為10 ℃/min，氮?dú)饬魉?0 mL/min，每個(gè)樣品重復(fù)掃描三次。

1.2.7 單增李斯特菌和大腸桿菌菌株的培養(yǎng) 單增李斯特菌于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth，TSB）中進(jìn)行活化，傳代三次以獲得穩(wěn)定菌落數(shù)，稀釋一定倍數(shù)使菌落數(shù)在（1～2.5）×105CFU/mL，涂布在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic Soy Agar，TSA）平板上計(jì)數(shù)，將稀釋后的單增李斯特菌在37 ℃、150 r/min 的條件下培養(yǎng)18 h。大腸桿菌的培養(yǎng)方法同單增李斯特菌培養(yǎng)方法。

1.2.8 復(fù)合納米載體抑菌性能的測(cè)定

1.2.8.1 復(fù)合納米載體對(duì)單增李斯特菌的抑制作用

依據(jù)Cava-roda 等[17]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。香草醛對(duì)照組取150 μL TSB 培養(yǎng)基、100 μL 香草醛貯備溶液（2800 mg/L，pH6）和50 μL 單增李斯特菌于已滅菌的96 孔板中混勻，37 ℃、595 nm 下測(cè)定24 h的OD 值，每小時(shí)讀數(shù)一次。無(wú)菌對(duì)照組取150 μL培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組取150 μL 培養(yǎng)基和50 μL 單增李斯特菌混勻；實(shí)驗(yàn)組分別取150 μL 培養(yǎng)基、100 μL復(fù)合納米載體和50 μL 單增李斯特菌加入已滅菌的96 孔板中混勻，37 ℃、595 nm 下測(cè)定24 h 的OD值，每小時(shí)讀數(shù)一次，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.8.2 復(fù)合納米載體對(duì)大腸桿菌的抑制作用 方法同1.2.8.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 和Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)差異通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）確定，P<0.05 表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，樣品重復(fù)測(cè)定三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖組成分析

通過(guò)氣相色譜法測(cè)定經(jīng)上述陰離子交換色譜純化后的四個(gè)組分的單糖組成，結(jié)果如圖1 和表1 所示。

圖1 不同組分AX 氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of different components AX

AX 中主要為阿拉伯糖和木糖，由圖1 及表1 可知，四個(gè)組分中阿拉伯糖和木糖含量較高，兩種單糖組成之和分別為67.41%、76.12%、77.16%和84.89%，F(xiàn)90 的阿拉伯糖和木糖總含量顯著高于F80（P<0.05）。Li 等[18]的試驗(yàn)表明AX 在乙醇中具有良好的溶解性，并且阿拉伯糖與木糖含量與乙醇濃度呈正相關(guān)。當(dāng)使用90%乙醇進(jìn)行沉淀時(shí)，AX 能夠沉淀出較高含量的阿拉伯糖和木糖。相比之下，使用80%乙醇進(jìn)行沉淀時(shí)，乙醇濃度相對(duì)較低，導(dǎo)致沉淀出的阿拉伯糖和木糖也相對(duì)較少。

阿拉伯糖與木糖的含量比（A/X）可近似代表阿拉伯木聚糖的分支度，各組分的A/X 分別為0.69、0.65、0.75 和0.95，F(xiàn)90 組分的分支度顯著高于F80組分（P<0.05），且F90-2 最高。AX 的分支度指的是分子中側(cè)鏈的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，分支度高意味著分子中有更多的側(cè)鏈，這些側(cè)鏈可以增加分子的分支結(jié)構(gòu)，增加空間位阻，孔隙結(jié)構(gòu)增多，包裹性增強(qiáng)[19]。

2.2 包封率分析

玉米麩皮AX 復(fù)合納米載體對(duì)香草醛的包封率如圖2 所示。

由圖2 可知F80-1、F80-2、F90-1、F90-2 組分制備的復(fù)合納米載體包封率分別為81.18%、69.36%、86.80%和88.48%。Kwon 等[20]采用大豆蛋白分離物和麥芽糊精包裹香草醛制作的復(fù)合納米載體包封率為58.6%，由此可以看出采用玉米麩皮多糖和玉米醇溶蛋白復(fù)合后作為壁材包裹性更好，包封率更高。有研究表明，多糖的高分支度和鼠李糖含量，使其具有較高的乳化性能[21-23]。結(jié)合表1，F(xiàn)90-1 和F90-2 中的鼠李糖含量高，F(xiàn)90-1、F90-2 組分制備的復(fù)合納米載體的包封率高；F80-1 中的鼠李糖含量雖然低于F80-2，但其分支度較F80-2 高，因此F80-1 組分制備的復(fù)合納米載體包封率高于F80-2 復(fù)合納米載體。

2.3 熒光光譜分析

熒光光譜可以用來(lái)檢測(cè)多糖與蛋白結(jié)合的熒光強(qiáng)度變化，上述復(fù)合納米體系在300～370 nm 下的發(fā)射光譜如圖3 所示。由圖3 可知，AX 的加入，導(dǎo)致熒光光譜最大吸收峰明顯降低，F(xiàn)90-1、F80-1 和F80-2 與Zein 裝載香草醛制備的納米載體的最大吸收峰從330 nm 移至320 nm，表明AX 與Zein 和香草醛之間存在相互作用，香草醛的芳香環(huán)與AX 和Zein 結(jié)合，復(fù)合納米載體的疏水性降低，致使發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象[24-25]。此外，相比于對(duì)照組，F(xiàn)90-2 與Zein 裝載香草醛制備的納米載體熒光強(qiáng)度最低，其次為F90-1、F80-1 和F80-2 與Zein 裝載香草醛制備的納米載體，結(jié)合單糖組成分析，推測(cè)是由于F90-2組分阿拉伯糖和木糖總含量較高，分支度也相對(duì)較大，因此可能導(dǎo)致和Zein 的疏水相互作用增強(qiáng)，所以熒光強(qiáng)度顯著下降。

圖3 不同組分復(fù)合納米載體的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of composite nanocarriers with different components

2.4 DSC 分析

采用DSC 對(duì)F80-1、F80-2、F90-1 及F90-2 與Zein制成的復(fù)合納米載體包埋香草醛所得納米體系進(jìn)行熱力學(xué)分析，結(jié)果如圖4 所示。由圖4A 可知，香草醛放熱效應(yīng)的最大溫度點(diǎn)在83 ℃，與Hasanvand等[25]的研究相同，證明了香草醛在81～83 ℃會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象。圖4C～F 可以看出，香草醛的特征峰消失，表明香草醛被包裹在納米載體中，并以無(wú)定形的形式存在[26]。這一觀點(diǎn)在Dalmolin 等[4]的研究中也得到了驗(yàn)證，香草醛在81.64 ℃出現(xiàn)吸熱峰，包封后此吸熱峰消失，說(shuō)明香草醛被封裝在納米載體中。圖4B 可以看出，Zein 的吸熱峰在104 ℃，說(shuō)明蛋白質(zhì)在此溫度下發(fā)生變性，在圖4C～F 中均未發(fā)現(xiàn)此峰值，這可能是因?yàn)锳X 存在大量的親水基團(tuán)，與Zein復(fù)合后降低了其疏水性，使其不易在高溫下變性，提高了其熱穩(wěn)定性[27]。

圖4 不同組分復(fù)合納米載體DSC 掃描圖Fig.4 DSC scanning diagram of composite nanocarriers with different components

2.5 各組分復(fù)合納米載體抑菌性能分析

圖5 可以看出，F(xiàn)80-2 組分與Zein 裝載香草醛制備的復(fù)合納米載體抑制單增李斯特菌效果最好，其次為F90-1、F90-2、F80-1 與Zein 裝載香草醛制備的復(fù)合納米載體和游離的香草醛，復(fù)合納米載體的抑菌活性高于香草醛的抑菌活性，可能是因?yàn)閺?fù)合納米載體提高了香草醛的穩(wěn)定性。

圖5 不同組分復(fù)合納米載體抑制單增李斯特菌效果圖Fig.5 Effect diagram of composite nanocarriers with different components for inhibit Listeria

由圖6 可以看出，F(xiàn)90-2 組分與Zein 裝載香草醛復(fù)合納米載體對(duì)大腸桿菌的抑制作用最好，其次為游離香草醛、F80-2、F90-1 和F80-1 組分與Zein 裝載香草醛復(fù)合納米載體，這可能是由于復(fù)合納米載體可能在進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞時(shí)面臨滲透性和內(nèi)部釋放等問(wèn)題，與游離的香草醛相比，復(fù)合納米載體可能在穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜或進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)遇到障礙，從而降低其抑制效果[17,28]。

圖6 不同組分復(fù)合納米載體抑制大腸桿菌效果圖Fig.6 Effect diagram of composite nanocarriers with different components for inhibit E.coli

復(fù)合納米載體對(duì)單增李斯特菌抑制效果更好的原因可能是由于單增李斯特菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，其結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性菌的大腸桿菌不同，因此復(fù)合納米載體抑菌效果不同。Jay 等[29]研究表明，香草醛對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果比革蘭氏陰性菌更有效。Fitzgerald 等[30]的研究證實(shí)單增李斯特菌對(duì)香草醛的敏感性高于大腸桿菌，且驗(yàn)證了香草醛的抗菌作用。可能是這些因素共同作用，使負(fù)載香草醛的復(fù)合納米載體對(duì)單增李斯特菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌。

3 結(jié)論

本研究采用純化后的玉米麩皮阿拉伯木聚糖（F80-1、F80-2、F90-1、F90-2）和Zein 復(fù)合制備負(fù)載香草醛的納米載體，通過(guò)氣相色譜法分析出不同組分AX 的單糖組成，其中阿拉伯糖和木糖總含量最高，通過(guò)測(cè)定包封率得出四個(gè)組分復(fù)合納米載體的包封率分別為81.18%、69.36%、86.80%和88.48%，熒光光譜法證明Zein 與AX 發(fā)生相互作用，差示掃描量熱法證明香草醛包封在復(fù)合納米載體中，提高了香草醛的熱穩(wěn)定性。抑菌試驗(yàn)可以證明，F(xiàn)80-2 組分復(fù)合納米載體抑制單增李斯特菌效果最好，F(xiàn)90-2 復(fù)合納米載體抑制大腸桿菌效果優(yōu)于游離香草醛，因此AX 復(fù)合納米載體在抑制單增李斯特菌和大腸桿菌方面具有實(shí)用價(jià)值，擴(kuò)大了食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。