不同感官特性醬香型大曲理化指標(biāo)與霉菌群落關(guān)聯(lián)分析

唐佳代，石雨菲，趙益梅，王怡，冷枝，郭敏，孟卓妮，楊亮

（茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州仁懷 564500）

醬香型大曲是由小麥為原料，經(jīng)拌料、壓制成型、入倉(cāng)發(fā)酵和出倉(cāng)貯存而成的糖化發(fā)酵劑[1-2]。醬香型大曲在開(kāi)放式的環(huán)境生產(chǎn)，使得大曲網(wǎng)羅自然環(huán)境中豐富的微生物，而制曲過(guò)程中不同的發(fā)酵溫度、貯存時(shí)間、貯存環(huán)境等因素，導(dǎo)致了大曲微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異[3-6]。微生物在發(fā)酵過(guò)程中所發(fā)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，從而產(chǎn)生了豐富的發(fā)酵基質(zhì)、風(fēng)味物質(zhì)前體物質(zhì)等，為醬香型白酒生產(chǎn)提供了風(fēng)味物質(zhì)前體和發(fā)酵所需酶系等[7-8]。因此，醬香型大曲是集菌系、酶系及物系為一體的重要載體，不同的品溫控制策略等因素使成品曲的感官特性、理化指標(biāo)和微生物群落組成各不相同[9]。

按照不同感官特性醬香型大曲分為黃曲、黑曲和白曲，三種大曲各有特點(diǎn)：黃曲皮厚，醬香濃郁，糖化力較低；黑曲皮薄，常帶有糊味；白曲皮薄，醬香弱，但其糖化率高[10-11]。制曲環(huán)境和工藝等因素造就了大曲中的霉菌以紅曲霉屬M(fèi)onascus、曲霉屬Aspergillus、根霉屬Rhizopus、犁頭霉屬Absidia、木霉屬Trichoderma、青霉屬Penicillium、橫梗霉屬Lichtheimia、擬青霉屬Paecilomyces和毛霉屬M(fèi)ucor等為主[12-14]。霉菌可產(chǎn)生糖化酶、酯化酶等多種酶類(lèi)[15]，能夠分解曲塊和酒醅中的淀粉[16]、蛋白質(zhì)[17]、脂肪等[18]大分子物質(zhì)為發(fā)酵微生物提供營(yíng)養(yǎng)，且作為風(fēng)味前體物質(zhì)參與發(fā)酵，與大曲發(fā)酵特性密切相關(guān)。目前，鮮見(jiàn)可培養(yǎng)的大曲理化指標(biāo)與霉菌群落的關(guān)聯(lián)的報(bào)道，張?jiān)茣譡19]經(jīng)過(guò)對(duì)濃香型大曲微生物群落與理化性質(zhì)的冗余分析，發(fā)現(xiàn)大曲的糖化力、水分與嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬、霉菌屬、根霉菌屬、毛霉屬等呈負(fù)相關(guān)，液化力與嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛霉屬和根霉菌屬呈正相關(guān)，與曲霉屬呈負(fù)相關(guān)；酸度與曲霉菌屬、根霉菌屬、毛霉屬呈正相關(guān)；但與嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬呈負(fù)相關(guān)。

解析大曲中的大曲理化指標(biāo)與霉菌群落組成之間的關(guān)聯(lián)對(duì)挖掘功能性微生物有至關(guān)重要的作用，有助于進(jìn)一步掌握醬香型白酒釀造過(guò)程中的微生物信息。本研究基于傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)分離出不同感官特性醬香型大曲中霉菌，利用分子生物學(xué)鑒定所分離霉菌菌株，結(jié)合冗余分析探究了大曲理化指標(biāo)與間霉菌群落的關(guān)聯(lián)。為利用白酒釀造微生物資源奠定研究基礎(chǔ)，為提高強(qiáng)化大曲的開(kāi)發(fā)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲YQ、黑曲BQ、白曲WQ 貴州省仁懷市某醬香型白酒廠拆倉(cāng)曲，樣品為2020 年11 月，該酒廠某一制曲車(chē)間中五個(gè)曲房中的拆倉(cāng)曲（黑、白、黃曲）各一塊，粉碎混合后用四分法進(jìn)行縮分取樣，備用；氫氧化鈉 分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；硫酸分析純，川東化工集團(tuán)；己酸、乙醇、乙酸 分析純，上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；乙酸鈉 分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；葡萄糖 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；瓊脂 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌真菌基因組提取試劑盒 北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司；2X Blastaq PCR Taq MasterMix 加拿大Applied Biological Materials 公司；QIAquick Gel Extraction Kit 德國(guó)QIAGEN 公司；DL2000 DNA Marker 日本Takara公司；LE Agarose 美國(guó)海晉生物公司。

FA1204N 電子天平 上海菁海儀器有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HH-8J 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州潤(rùn)華電器有限公司；DK-98-II 電爐天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊醫(yī)療股份有限公司；BCD-640WAGM 冷藏柜 青島海爾股份有限公司；SW-CJ-2D 雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái) 上海喬躍電子有限公司；BSD-YX3200 立式智能精密搖床上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5417R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；9700PCR 儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；PowerPac HV 電泳儀 美國(guó)Biorad 公司；3730X 測(cè)序儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同感觀特性醬香型大曲理化指標(biāo)分析 按照QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》[20]對(duì)三種不同感官特性醬香大曲的水分含量、酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力和酯化力進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 不同感觀特性醬香大曲中霉菌的分離、純化與鑒定 稱(chēng)取10 g 經(jīng)研磨的白曲、黃曲和黑曲樣品于含數(shù)顆玻璃珠的90 mL 無(wú)菌水中，振蕩30 min，并取原液1 mL 梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。分別取200 μL 稀釋菌液涂布在PDA 培養(yǎng)基表面[21]。在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d 后將菌株3～4 次點(diǎn)接種培養(yǎng)，獲得純的霉菌菌株。將純化后的菌種接入試管斜面保存，置于4 ℃冰箱保藏備用[22]。

保藏的菌種送至成都羅寧生物科技有限公司，使用DNA 提取試劑盒提取分離純化的霉菌DNA。采用真菌ITS 序列通用引物ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′）擴(kuò)增霉菌的ITS 區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中2XPCR Bestaq MasterMix 25 μL，超純水18 μL，上游引物ITS1 2.5 μL，下游引物ITS4 2.5 μL，DNA 2 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸1 min；4 ℃保溫。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠150 V 電泳20 min 檢測(cè)擴(kuò)增條帶，將回收的PCR 產(chǎn)物用ABI3730XL 進(jìn)行測(cè)序[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

大曲理化指標(biāo)涉及有效的3 組平行檢測(cè)數(shù)據(jù)平均值，結(jié)果使用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）的形式表示，利用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，當(dāng)P<0.05 時(shí)，不同大曲理化指標(biāo)數(shù)據(jù)組之間被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異。基于美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)原始霉菌序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，使用MEGA7.0 軟件中Neighbor-Joining 功能構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用Excel 2019 繪制霉菌群落結(jié)構(gòu)圖，采用Canoco 5.0 軟件[23]完成冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同感官特性醬香型大曲理化指標(biāo)分析

大曲理化指標(biāo)中的水分含量和酸度可在一定程度上表現(xiàn)出大曲質(zhì)量，液化力、糖化力、酯化力則反映大曲中的酶系功能，而發(fā)酵力可反映大曲中某些微生物生長(zhǎng)情況。不同感官特性醬香型大曲理化指標(biāo)如表1 所示，其中水分含量從高到低依次為白曲12.89%，黑曲12.44%，黃曲11.63%，三種大曲水分均低于13%，代表大曲的水分含量適宜且成熟度較好。適宜的酸度可以抑制大曲中雜菌的生長(zhǎng)[24]，醬香大曲酸度的范圍為（1.0～3.5）×10-1mmol/g[20]，三種大曲酸度從高到低依次為黑曲3.16×10-1mmol/g，白曲2.64×10-1mmol/g，黃曲2.52×10-1mmol/g，均在適宜的酸度范圍。發(fā)酵力從高到低依次為黃曲1.56 U，黑曲1.51 U，白曲1.46 U，液化力從高到低依次為黃曲1.23 U，白曲0.98 U，黑曲0.84 U，酯化力從高到低依次為黃曲22.63 U，黑曲22.48 U，白曲22.16 U，糖化力從高到低依次為白曲356.09 U，黃曲283.27 U，黑曲220.07 U。所測(cè)指標(biāo)與張麗等[25]研究中貯存初期的醬香大曲理化指標(biāo)基本吻合。三種醬香大曲的糖化力有顯著性差異，該指標(biāo)反映了大曲對(duì)淀粉的轉(zhuǎn)化率，含量越高，轉(zhuǎn)化率越高[26]。大曲的糖化力與微生物的生長(zhǎng)繁殖有一定的相關(guān)性，特別是霉菌。酯化力和發(fā)酵力都作為大曲生化功能的動(dòng)態(tài)指標(biāo)，與大曲中微生物多樣性及其代謝有密切聯(lián)系。

表1 不同感官特性醬香型大曲理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indicators of sauce-flavor Daqu with different sensory characteristics

2.2 不同感觀特性醬香大曲中霉菌的分離、純化與鑒定結(jié)果

從三種不同感官特性醬香型大曲中共分離純化出霉菌78 株，其中白曲29 株，黃曲26 株，黑曲23株。將78 株霉菌菌株測(cè)序所得序列上傳至NCBI獲得的序列號(hào)，并在BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果和大曲分離所得霉菌序列展示于表2。

表2 不同感官特性大曲菌株測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 2 Sequencing comparison results of Daqu strain with different sensory characteristics

為直觀反映了所分離霉菌間親源性和判斷分離篩選出的霉菌菌株的種屬，利用Neighbor-Joining 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其具體分類(lèi)地位見(jiàn)圖1～圖3 所示。其中33 株霉菌屬于橫梗霉屬Lichtheimia：WQM-21、WQM-24、WQM-25 等13 株菌與MT982159.1Lichtheimia corymbifera同源性達(dá)100%，YQM-10、YQM-05、WQM-07、WQM-17、WQM-19 與MG772621.1Lichtheimia ornata同源性≥99%，YQM-12、YQM-21 與JN579140.1Lichtheimia hongkongensis同源性達(dá)100%，BQM-01、YQM-01、YQM-02 等13 株菌與MH453383.1Lichtheimia ramosa同源性≥99%。4 株屬于青霉屬Penicillium：WQM-09、WQM-32與MN197688.1Penicillium chrysogenum同源性達(dá)100%，WQM-03、WQM-27 與NG070021.1 緩慢產(chǎn)黃青霉Penicillium tardochrysogenum同源性≥99%。3 株屬于曲霉屬Aspergillus：BQM-20 與MT226558.1Aspergillus sydowii同源性達(dá)100%，BQM-23 與MH876710.1Aspergillus quadrilineatus同源性達(dá)100%，YQM-08 與NG069721.1Aspergillus intermedius同源性達(dá)99%。36 株屬于擬青霉屬Paecilomyces：BQM-09、BQM-10、WQM-02 等11 株 與MH874957.1Paecilomyces subglobosus同源性≥99%，BQM-02、BQM-03、BQM-04 等25 株與 ON853979.1Paecilomyces variotii同源性達(dá)100%。1 株附球菌屬Epicoccum和1 株帚霉屬Scopulariopsis：WQM-04 與 MN654935.1Epicoccum endophytica同源性達(dá)100%；BQM-18 與 EU-862178.1Scopulariopsis brevicaulis同源性達(dá)100%。

圖1 白曲霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of mold in WQ

圖2 黃曲霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of mold in YQ

圖3 黑曲霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of mold in BQ

三種不同感官特性醬香型大曲的霉菌群落結(jié)構(gòu)分析如圖4 所示，共鑒定到6 個(gè)屬13 種的霉菌78 株。白曲WQ 中霉菌為Paecilomyces subglobosus（31.03%）、宛氏擬青霉Paecilomyces variotii（24.14%）、傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera（17.24%），Lichtheimia ornata（10.34%）、緩慢產(chǎn)黃青霉Penicillium tardochrysogenum（6.90%）、產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum（6.90%）、Epicoccum endophytica（3.45%）；YQ 中霉菌有分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa（46.15%）、傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera（26.92%）、宛氏擬青霉Paecilomyces variotii（7.69%）、Lichtheimia hongkongensis（7.69%）、Lichtheimia ornata（7.69%）、中間曲霉Aspergillus intermedius（3.85%）；BQ 中霉菌有宛氏擬青霉Paecilomyces variotii（69.57%）、Paecilomyces subglobosus（8.70%）、分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa（4.35%）、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis（4.35%）、傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera（4.35%）、聚多曲霉Aspergillus sydowii（4.35%）、四脊曲霉Aspergillus quadrilineatus（4.35%）。其中宛氏擬青霉Paecilomyces variotii和Lichtheimia corymbifera兩種霉菌在三種大曲中均被鑒定出來(lái)，Lichtheimia ornata存在于白曲和黃曲中，Paecilomyces subglobosus存在于白曲和黑曲中，Lichtheimia ramosa存在于黃曲和黑曲中，中間曲霉Aspergillus intermedius和Lichtheimia hongkongensis僅在黃曲中鑒定出來(lái)，緩慢產(chǎn)黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica和Penicillium chrysogenum僅在白曲中鑒定出來(lái)，短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii和Aspergillus quadrilineatus僅在黑曲中鑒定出來(lái)。在三種大曲共有或特有的霉菌菌種中分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa和傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera在酒曲中具有很強(qiáng)的耐熱性、生長(zhǎng)能力，是產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶的主要菌種[27]，宛氏擬青霉Paecilomyces variotii大多在醬香型大曲中都有發(fā)現(xiàn)，耐熱性很強(qiáng)，可以降解甲醇和糠醛類(lèi)有害物質(zhì)，解除對(duì)酵母菌的抑制作用，是重要的調(diào)節(jié)性霉菌[28]，黑曲和黃曲中鑒定到的曲霉屬Aspergillus作為釀造過(guò)程中主要的供酶菌源，耐熱性好，能產(chǎn)生糖化酶、蛋白酶、淀粉酶等活性較高的水解酶類(lèi)[29-30]，已有多株高產(chǎn)酶的菌株從自然發(fā)酵體系中分離篩選出來(lái)，并被初步應(yīng)用于強(qiáng)化白酒發(fā)酵過(guò)程[31-32]。

圖4 三種不同感官特性大曲霉菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Mold community structure of Daqu with three different sensory characteristics

2.3 大曲理化性質(zhì)和霉菌鑒定的相關(guān)性分析

采用RDA 冗余分析解析優(yōu)勢(shì)菌群與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，其中兩因素間的夾角為銳角時(shí)，表示存在正相關(guān)，反之為負(fù)相關(guān)，兩因素投影到另一個(gè)因素的長(zhǎng)度越長(zhǎng)則相關(guān)性越大[33]。圖5 冗余分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)霉菌與大曲理化指標(biāo)總變異的98.43%能夠被圖中的變量所解釋?zhuān)谝慌判蜉S能解釋59.44%的變異信息，第二排序軸能解釋38.99%的變異信息。液化力與酯化力、發(fā)酵力和糖化力都呈正相關(guān)，其中糖化力與Paecilomyces subglobosus、Lichtheimia corymbifera、緩慢產(chǎn)黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica、Lichtheimia ornata、Penicillium chrysogenum呈正相關(guān)，液化力與Lichtheimia ramosa、Lichtheimia corymbifera、中間曲霉Aspergillus intermedius、Lichtheimia ornata、Lichtheimia hongkongensis呈正相關(guān)，發(fā)酵力和酯化力與Lichtheimia ramosa、Aspergillus intermedius、Lichtheimia hongkongensis呈正相關(guān)，由此看出影響糖化力、酯化力、液化力和發(fā)酵力主要菌屬為橫梗霉屬，研究表明橫梗霉屬與糖化酶系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白有關(guān)[34]；水分與酸度呈正相關(guān)，水分與宛氏擬青霉Paecilomyces variotii、Paecilomyces subglobosus、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii、Aspergillus quadrilineatus、緩慢產(chǎn)黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica、Penicillium chrysogenum呈正相關(guān)；酸度與宛氏擬青霉Paecilomyces variotii、短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii、Aspergillus quadrilineatus呈正相關(guān)，由此看出影響水分含量的主要是青霉屬，影響酸度的主要為擬青霉屬。

圖5 霉菌與大曲理化指標(biāo)之間的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis between mold and physical and chemical indicators of Daqu

3 結(jié)論

本研究以三種不同感官特性醬香型大曲研究對(duì)象，探究了黑、白、黃三種大曲理化指標(biāo)和可培養(yǎng)霉菌群落之間的關(guān)聯(lián)性。經(jīng)測(cè)定三種大曲理化指標(biāo)水分含量均低于13%，酸度均在（1.0～3.5）×10-1mmol/g范圍內(nèi)；發(fā)酵力和酯化力大小為黃曲>黑曲>白曲；液化力大小為黃曲>白曲>黑曲；糖化力大小為白曲>黃曲>黑曲。從三種不同感官特性醬香型大曲中分離78 株霉菌，經(jīng)鑒定為6 個(gè)屬13 種。在三種大曲中均鑒定出宛氏擬青霉Paecilomyces variotii和傘枝橫梗霉Lichtheimia corymbifera，Lichtheimia ornata存在于白曲和黃曲中，Paecilomyces subglobosus存在于白曲和黑曲中，分枝橫梗霉Lichtheimia ramosa存在于黃曲和黑曲中；黃曲中鑒定出的特有菌株為中間曲霉Aspergillus intermedius和Lichtheimia hongkongensis，白曲中鑒定出的特有菌株為緩慢產(chǎn)黃青霉Penicillium tardochrysogenum、Epicoccum endophytica和Penicillium chrysogenum，僅在黑曲中鑒定出的菌株為短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis、Aspergillus sydowii和Aspergillus quadrilineatus。分析不同感官特性醬香型大曲霉菌群落結(jié)構(gòu)與大曲理化指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果表明，糖化力、液化力、酯化力和發(fā)酵力的主要菌屬均為橫梗霉屬Lichtheimia。

本研究初步揭示了三種不同感官特性醬香型大曲理化指標(biāo)和霉菌鑒定之間的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)一步掌握了三種醬香型大曲中的霉菌生物信息，為進(jìn)一步醬香大曲中功能性微生物的研究奠定基礎(chǔ)，并為強(qiáng)化醬香大曲發(fā)酵性能提供數(shù)據(jù)支撐。