昆布多糖的復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化及其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

張 涵，殷 澳，張會(huì)佳，侯相竹，高 陽, ，徐多多,

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117）

昆布是海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布（鵝掌菜）的干燥葉狀體，可化痰軟堅(jiān)散結(jié)，有利水消腫之效，同時(shí)兼具食用藥用雙重價(jià)值[1]。隨著海洋生物資源的不斷開發(fā)，昆布作為重要的海洋產(chǎn)物，其生物活性價(jià)值引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[2]，我國對昆布的研究主要集中在昆布多糖（Laminarin）、褐藻膠、粗提碘等方面[3]。昆布多糖是昆布最主要活性成分之一[4]，由D-吡喃葡萄糖通過β-1,3 糖苷鍵連接而成，具有三螺旋結(jié)構(gòu)。多糖的組成及結(jié)構(gòu)對其藥理活性具有一定影響[5-6]，如昆布多糖可以加速膽固醇的代謝和轉(zhuǎn)化，同時(shí)還可促進(jìn)胰島素的分泌，起到降血糖降血脂的作用[7-8]；低分子量的巖藻聚糖硫酸酯片段抗凝血效果良好，且硫酸化程度越高抗凝血活性越高[9]，抗血栓活性也越明顯[10]；除此之外昆布多糖還具有抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抗病毒[13]、抗細(xì)菌[14]等藥理活性，滿足人們對保健和醫(yī)藥的需求[15]。

多糖的提取方法包括熱水浸提法[16]、酸提取法[17]、超聲浸提法[18]和酶法提取[19]等，或組成聯(lián)合提取方法，如超聲輔助酶法[20]、微波輔助酶法[21]、微波輔助酸液[22]等，輔助聯(lián)合法可在一定程度上彌補(bǔ)單一提取方法的不足，更大程度提高多糖得率。現(xiàn)有的提取方法會(huì)存在一些局限，傳統(tǒng)水提操作繁瑣且得率較低[23]，酸提取和超聲提取易破壞多糖的結(jié)構(gòu)[24]；相比之下，酶提法成本較低、效率更高，可充分保留多糖的生理活性[25]。一是因?yàn)槊缚膳c底物特異性結(jié)合，減少溶出阻力[26]。二是酶解法可將多糖分解成分子量較小的片段，增加多糖溶出率[27]。單一酶解與復(fù)合酶提取效果差別較大[28]，因復(fù)合酶間具有協(xié)同作用[29]，若僅是探究復(fù)合酶添加量對得率的影響而忽略復(fù)合酶間的相互作用，多糖得率則會(huì)明顯降低。若僅考慮復(fù)合酶比例而忽略酶活性等影響易造成多糖活性差、得率低的結(jié)果[30]。纖維素酶和果膠酶可降解植物細(xì)胞壁，木瓜蛋白酶可將細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)酶解消化[31]，利于多糖溶出。綜上，本文先選擇纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶組成復(fù)合酶，通過正交試驗(yàn)確定其最佳配比，再選用響應(yīng)面法以酶解時(shí)間、溫度、液料比、pH 為影響因素優(yōu)化提取工藝，并探究昆布多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為昆布多糖的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆布藥材 安徽毫藥干草國藥股份有限公司，批號(hào)：1 902013；纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（100 U/3.8 mg）、阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）

上海源葉生物科技有限公司；巖藻糖 Toronto Research Chemicals；半乳糖醛酸（25 g）FLUKA 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（500 次）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；明膠（99%）、氯化鋇（99%）、硫酸鉀（AR，99%）上海麥克林生化科技股份有限公司；無水碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、溴化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 成都市科隆化學(xué)品有限公司。

UV745N 型紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；M200pro 型酶標(biāo)儀 熱電科技儀器有限公司；BSA224S-CW 型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SHY-2A 型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)合酶提取昆布多糖工藝流程 參考王歆彤等[32]的方法并稍作修改，先將昆布干燥粉碎過40 目篩，取5 g 昆布粉末于錐形瓶中加入一定體積純水，通過檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖鹽溶液調(diào)節(jié)pH，添加最佳配比的復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）于一定溫度下通過搖床水浴酶解一定時(shí)間，沸水滅酶15 min，4000 r/min 離心10 min 后取上清定容，苯酚硫酸法測定并計(jì)算多糖得率。提取液濃縮至原體積的1/5，在提取液中加95%乙醇直至乙醇濃度達(dá)80%，3000 r/min 離心5 min 取沉淀，凍干后可得昆布多糖粉末。

1.2.2 復(fù)合酶添加量配比優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 各單因素實(shí)驗(yàn)固定條件均為：昆布粉末5 g、液料比40:1（mL/g）、pH6.0、50 ℃、酶解2.5 h，按照1.2.1 方法，分別考察纖維素酶（90、100、110、120、130 mg）、果膠酶（70、80、90、100、110 mg）、木瓜蛋白酶（45、50、55、60、65 mg）對昆布多糖得率的影響。

1.2.2.2 對比復(fù)合酶與單酶的提取效果 研究纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶三種單酶的最適添加量及復(fù)合酶（1.2.2.1 中三種酶上述最適添加量相加總和）對昆布多糖得率的影響。

1.2.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以纖維素酶（A）、果膠酶（B）和木瓜蛋白酶（C）添加量為自變量，以昆布多糖得率為因變量，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，確定復(fù)合酶最佳配比，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 復(fù)合酶添加量正交試驗(yàn)Table 1 Orthogonal test of complex enzyme dosage

1.2.3 復(fù)合酶提取昆布多糖工藝參數(shù)優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 各單因素實(shí)驗(yàn)固定條件均為：昆布粉末5 g、添加最佳配比復(fù)合酶、酶解時(shí)間2 h、pH6、液料比40:1 mL/g、溫度50 ℃，分別考察酶解時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）、液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g）、pH（4、4.5、5、5.5、6、6.5）和溫度（30、40、50、60、70 ℃）的影響。

1.2.3.2 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇時(shí)間（A）、pH（B）、液料比（C）和溫度（D）作為Box-Behnken 響應(yīng)面的4 個(gè)影響因素，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，建立自變量與昆布多糖得率（Y）之間的函數(shù)關(guān)系，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 復(fù)合酶提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Test factors and levels of response surface of complex enzyme extraction technology

1.2.4 昆布多糖得率計(jì)算

1.2.4.1 標(biāo)曲的制作 參考溫思萌等[33]的方法并稍作修改，選擇以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 溶于100 mL 容量瓶中配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水補(bǔ)足至1.0 mL，先后加入5%苯酚溶液1.0 mL 和濃硫酸5.0 mL，于484 nm 處通過紫外分光光度計(jì)測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，巖藻糖濃度為橫坐標(biāo)，得到巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線y=6.8626x+0.0019，R2=0.9999。

1.2.4.2 多糖的測定及得率計(jì)算 將提取液測定的吸光度值代入巖藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得昆布多糖得率（Y）計(jì)算公式：

式中：C：待測樣液中多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V：待測樣液的體積（mL）；F：待測樣液的稀釋倍數(shù)；M：昆布粉末的質(zhì)量（g）。

1.2.5 傳統(tǒng)水提法與優(yōu)化后復(fù)合酶提法的比較

1.2.5.1 昆布多糖的制備 復(fù)合酶提法：取5 g 昆布粉末，按照1.2.3.2 項(xiàng)下優(yōu)化后的復(fù)合酶提取最佳工藝酶提昆布多糖，沸水滅酶15 min，4000 r/min 離心10 min 取上清，定容至300 mL，按照1.2.4 項(xiàng)下方法測定昆布多糖得率，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)取平均值。

傳統(tǒng)水提法：取5 g 昆布粉末，固定實(shí)驗(yàn)條件（溫度、pH、液料比和時(shí)間）與復(fù)合酶法最佳提取工藝相同的條件水提昆布多糖，4000 r/min 離心10 min 取上清，定容至300 mL，按照1.2.4 項(xiàng)下方法測定昆布多糖得率，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)取平均值。

1.2.5.2 昆布多糖理化性質(zhì)測定 采用苯酚-硫酸法以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定中性糖含量[34]；采用間羥基聯(lián)苯法以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品測定酸性糖含量[35]；通過BCA 法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)含量[36]；采用明膠-氯化鋇法以恒重硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品測定巖藻糖硫酸酯含量[37]。

1.2.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn) 參考張艷秋等[38]方法并稍作修改。采用PBS 緩沖液（pH6.8）配制系列濃度的昆布多糖和阿卡波糖溶液（均為1～5 mg/mL）。各取40 μL 樣液至96 孔板中，加入0.04 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL 后于37 ℃孵育5 min，加入0.5 mmol/L 的PNPG 溶 液20 μL 后 于37 ℃孵 育30 min；加入0.1 mol/L 的碳酸鈉溶液100 μL 終止反應(yīng)。以40 μL PBS 緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)作為背景對照組，以40 μL PBS 緩沖液為空白對照組。在405 nm 處測定各孔的光密度值（OD），重復(fù)三次取平均值，計(jì)算抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

選擇IBM SPSS Statistics 25 和Design-Expert 13 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 2021 繪圖，通過GrapHPad prism 9 計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶添加量配比優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 纖維素酶和果膠酶可消化植物細(xì)胞壁使其水解成葡萄糖，且不會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)部的纖維素骨架，充分保留多糖的結(jié)構(gòu)和活性，木瓜蛋白酶可溶解糖蛋白中的蛋白質(zhì)[39]，故復(fù)合酶種類選擇以上三種。各酶添加量對昆布多糖得率的影響見圖1。三種單酶的多糖得率在所測濃度范圍內(nèi)都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，因?yàn)樵黾用傅奶砑恿靠墒姑附夥磻?yīng)更加完全，酶解出的多糖含量更多；繼續(xù)增加酶的濃度，多余的酶會(huì)與底物競爭，導(dǎo)致一定量的酶會(huì)被消耗[40]，多糖的得率下降。破壞昆布細(xì)胞壁是增加多糖溶出率的關(guān)鍵，因此纖維素酶和果膠酶提取的多糖得率略高，且效果差距較大。通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定各單酶最佳添加量：纖維素酶110 mg、果膠酶90 mg、木瓜蛋白酶55 mg。

圖1 三種單酶添加量對昆布多糖得率的影響Fig.1 Effect of three single enzyme supplemental levels on the yield of laminarin

2.1.2 復(fù)合酶與三種單酶提取的多糖得率 三種單酶與復(fù)合酶提取昆布多糖得率的對比如圖2 所示，復(fù)合酶提取的昆布多糖得率都顯著高于三種單酶（P<0.05），分別比纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶高出4.55%、6.46%、7.34%。故選擇復(fù)合酶提取昆布多糖。

圖2 三種單酶與復(fù)合酶提取昆布多糖的得率對比Fig.2 Yield of laminarin by three single enzymes and compound enzymes

2.1.3 復(fù)合酶添加量比例優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)周期短、次數(shù)少，因子選擇區(qū)間固定在試驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)范圍內(nèi)，可以迅速找到各水平最佳組合，結(jié)果直觀。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4，由表4 可知，正交試驗(yàn)的P值<0.01，說明復(fù)合酶配比對多糖得率的影響極顯著，且三種單酶產(chǎn)生的影響也均為極顯著（P<0.01）。通過表3 的R 值得出果膠酶的影響效果最強(qiáng)，其次為木瓜蛋白酶，纖維素酶的影響效果最弱；根據(jù)k 值分析出最佳復(fù)合酶配比為A1B2C2，即復(fù)合酶最佳比例為纖維素酶100 mg、果膠酶90 mg、木瓜蛋白酶55 mg，下述的響應(yīng)面優(yōu)化探究最佳工藝時(shí)復(fù)合酶添加量即為最佳配比。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment design and results

表4 正交試驗(yàn)的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments

2.2 復(fù)合酶法提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 時(shí)間、液料比、pH 及溫度對昆布多糖得率的影響見圖3，除液料比外其余三個(gè)影響因素的昆布多糖得率在測定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)先升后降趨勢，液料比對昆布多糖得率的影響是在測定范圍內(nèi)先上升后保持穩(wěn)定。如圖3a 所示，昆布多糖得率在1.5 h 處達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶解時(shí)間，多糖得率開始下降，因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長會(huì)破壞部分多糖的結(jié)構(gòu)[41]；多糖得率在10:1 到60:1 mL/g 范圍內(nèi)隨液料比增加而先增加后保持不變（圖3b），溶液體積增加，溶劑的擴(kuò)散速率加快，多糖溶出量增加[42]；溶液體積過多時(shí)細(xì)胞全部漲破，多糖溶出率不會(huì)再發(fā)生變化[43]。昆布多糖的得率在pH6、溫度50 ℃時(shí)達(dá)到峰值（圖3c 和圖3d）。pH 和溫度都是影響酶活性的關(guān)鍵因素，酶解反應(yīng)不完全將導(dǎo)致多糖的得率變低，復(fù)合酶在弱酸性條件下有較好的酶解效果，三種酶各自有最適溫度和pH，溫度和pH 超過酶的活性范圍則酶解反應(yīng)不完全，將導(dǎo)致多糖的得率變低[44]。圖3可得各影響因素的單因素選擇結(jié)果：時(shí)間1.5 h、液料比50:1 mL/g、pH6、溫度50 ℃。

圖3 四個(gè)考察因素對提取昆布多糖得率的影響Fig.3 Influence of four factors on the yield of laminarin

2.2.2 復(fù)合酶提取多糖工藝響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 相較于正交試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果只能是某種組合，且在初步篩選時(shí)難以確定變化規(guī)律，而響應(yīng)面試驗(yàn)靈活準(zhǔn)確，可分步進(jìn)行，若設(shè)定的目標(biāo)或水平偏差較大可及時(shí)進(jìn)行調(diào)整，得到的模型結(jié)果也可預(yù)測目標(biāo)的變化及規(guī)律。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見表5，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行二元多次回歸擬合，得到回歸方程：Y=18.00+0.1383A+0.1183B+0.2550C-0.1567D+0.3000 AB+0.1625AC-0.1275AD+0.0700BC+0.0100BD+0.0525CD-0.2706A2-0.5631B2-0.2306C2-1.24D2。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Response surface test design and results

回歸模型方差及結(jié)果見表6，回歸模型的P值<0.0001，該模型極顯著；回歸方程失擬項(xiàng)的P值>0.05，不顯著，該模型可信度高；調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.9776，即昆布多糖得率的變化規(guī)律有97.76%的概率可由該模型解釋；變動(dòng)系數(shù)CV=5.95%，模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合性較好，該模型可用于預(yù)測昆布多糖提取工藝優(yōu)化的試驗(yàn)。通過分差分析表可知，各因素對多糖得率的影響大小為：C>D>A>B；各因素兩兩間的相互作用AB、AC、AD 對多糖得率具有顯著影響（P<0.05）；各單因素以及單因素的平方對多糖得率的影響都具有極顯著作用（P<0.01）。

表6 回歸模型方差及結(jié)果Table 6 Variance and results of regression model

各因素對響應(yīng)值的影響結(jié)果見圖4，根據(jù)圖4a可知時(shí)間較pH 等高線更呈橢圓形，時(shí)間對多糖得率的影響比較強(qiáng)烈，二者交互作用顯著；由圖4b 分析得出液料比較時(shí)間的等高線各曲線之間較密集，液料比對多糖得率的影響較明顯；由圖4c 觀察出溫度與時(shí)間的響應(yīng)曲面坡度較陡峭，溫度對多糖得率的影響較大；因此液料比對昆布多糖得率的影響最顯著，其次分別是溫度、時(shí)間、pH。由圖可以得出，兩因素間交互作用的影響從大到小排列：AB>AC>AD>BC>CD>BD，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 響應(yīng)面等高線圖與三維圖Fig.4 The contour map and 3D map of response surface

2.2.3 工藝驗(yàn)證 根據(jù)方程得到復(fù)合酶提的優(yōu)化工藝為酶解時(shí)間1.8 h、pH6.1、液料比59:1 mL/g、酶解溫度49.4 ℃，預(yù)測多糖得率為18.183%。通過三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定實(shí)際的昆布多糖得率為18.19%±1.04%，實(shí)測值與預(yù)測值接近，即響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶提取昆布多糖的工藝切實(shí)可靠。

2.3 復(fù)合酶法與傳統(tǒng)水提昆布多糖的比較

5 g 昆布粉末通過復(fù)合酶提取得到凍干的多糖粉末1.4 g，提取的昆布多糖中的中性糖、酸性糖、硫酸根、蛋白質(zhì)含量分別為52.72%、11.76%、19.49%、2.66%，多糖平均得率18.19%±1.04%。傳統(tǒng)水提多糖得率5.28%±0.34%，復(fù)合酶法是其3.44 倍，魏碧娜[45]通過傳統(tǒng)水提法得到的海帶多糖得率2.5%，程仕偉等[46]采用水提法提取的海帶多糖得率4.99%，高潔[47]歸納比較七種不同提取方法對海帶多糖得率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶法提取的多糖得率是水提法的2.36 倍。水提的昆布多糖中的中性糖、酸性糖、硫酸根、蛋白質(zhì)的含量分別為13.93%、1.82%、17.71%、5.03%，以活性成分含量為指標(biāo)，傳統(tǒng)水提法除蛋白質(zhì)含量外均低于復(fù)合酶法提取的昆布多糖，即選擇提取效果更好的復(fù)合酶法。

2.4 昆布多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果

α-葡萄糖苷酶抑制劑是治療糖尿病的常用藥物，現(xiàn)有的降糖藥售價(jià)高、不耐受，找到有效藥物抑制劑則是重中之重[48]，研究發(fā)現(xiàn)食用藻類對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[49]。昆布多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，昆布多糖在1～5 mg/mL 范圍內(nèi)對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨著濃度的增大而增大，最大抑制率為79.04%±3.17%。昆布多糖的IC50值為1.443 mg/mL，小于阿卡波糖的IC50值1.851 mg/mL。昆布多糖對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。

圖5 昆布多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Experimental results of inhibiting α-glucosidase activity of laminarin

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過先正交試驗(yàn)再響應(yīng)面優(yōu)化得到了復(fù)合酶法提取昆布多糖的最佳工藝參數(shù)：取5 g 昆布粉末加入295 mL 純水，通過緩沖液將pH 調(diào)至6.1，加入100 mg 纖維素酶、90 mg 果膠酶和55 mg 木瓜蛋白酶，搖床水浴加熱至49.4 ℃酶解1.8 h，在此優(yōu)化工藝下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的多糖得率為18.19%±1.04%，與預(yù)測值18.183%接近，是傳統(tǒng)水提多糖得率的3.44倍，測定的糖含量、硫酸酯基等活性物質(zhì)也明顯高于傳統(tǒng)水提。復(fù)合酶法多糖得率高，效率快，可提取出低分子量的多糖增加藥理活性。昆布多糖對α-葡萄糖苷酶具有明顯抑制作用，在5 mg/mL 達(dá)到最大抑制率為79.04%±3.17%，因此具有潛在降糖功效，為昆布在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用提供了參考。