鐵皮石斛多糖的低共熔溶劑提取工藝優化

馮思敏，廖偉先，潘杰峰，余佳浩，陳碧蓮，邵 平,

（1.浙江工業大學食品科學與工程學院，浙江杭州 310014；2.浙江工業大學化學工程學院，浙江杭州 310014；3.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052）

鐵皮石斛是蘭科屬草本植物，被稱為“九大仙草之首”，含有多種活性物質，如多糖、氨基酸類和生物堿等[1]。其中，鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛的主要功能活性成分，具有抗氧化、抗衰老、免疫調節、抗腫瘤和降血糖等作用[2-5]。因此，建立高效、綠色的鐵皮石斛多糖提取工藝有利于鐵皮石斛的藥食兩用價值的開發。邱現創等[6]通過超聲輔助法提取鐵皮石斛多糖，提取率可達25.39%。廖霞等[7]利用微波輔助結合酶解提取法，鐵皮石斛多糖提取率可達29.40%。李貝貝等[8]研究了閃式提取法提取鐵皮石斛多糖，在最佳優化工藝條件下浸泡30 min 后，常溫下提取3 次，提取率達到31.45%。Kui 等[9]從石斛中提取出了3 種水溶性多糖，其主要由甘露糖和葡萄糖以不同的比例組成。高云霄等[10]用熱水浸提法從鐵皮石斛中提取得到一種以1,4-鏈接為主，存在少量1,2,4-、1,3,4-、1,4,6-分支結構和端基結構的O-乙酰化葡甘露聚糖。鐵皮石斛多糖的結構是其呈現生物活性的基礎，選擇不同的提取、純化分離方法，所得到的多糖在單糖組成及多糖結構上會有顯著不同，而這往往會直接影響多糖的生物活性。

低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）由氫鍵受體和氫鍵供體混合而成[11]。DES 已被證明是一種新型綠色溶劑，具有成本低、易合成、無毒和可生物降解等優異性能[12-14]。其現已被用于功能成分的提取，如提取槲皮素[15-16]、提取甜菜堿[17-18]及提取姜黃素[19-20]，目前，已有部分研究將DES 的綠色提取工藝用于鐵皮石斛總黃酮的提取[21]，但其在鐵皮石斛多糖的提取中應用較少。

DES 具有安全性高、價格低廉及綠色等特點，課題組前期對近40 種不同比例和原料的DES 進行了篩選，發現基于氯化膽堿及乳酸的DES 產生的氫鍵數最多[22]。因此，本研究選擇氯化膽堿與乳酸作為制作DES 的原料，利用響應面法優化鐵皮石斛多糖的提取工藝。在鐵皮石斛多糖提取后，進一步研究其單糖組成及可能的分子結構，以期為鐵皮石斛多糖的高效提取提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛 購自云山斛皮石斛基地；苯酚、濃硫酸、乳酸、鼠李糖（純度98%）、半乳糖（98%）、核糖（純度>99.5%）、木糖（純度99%）國藥集團化學試劑有限公司；氯化膽堿、阿拉伯糖（純度98%）杭州吉工生物科技有限公司；無水硫酸鈉 杭州雙木化工有限公司；DEAE-52 纖維素柱填料、Sephadex G-100上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（純度99.7%）、乙酸酐 杭州邦易化工有限公司；無水乙醇、甘露糖（純度99%）杭州方平化工有限公司；D2O 安徽澤生科技有限公司；三氟乙酸 德國Merck 公司；鹽酸羥胺、吡啶 上海泰坦科技股份有限公司；所用試劑均為分析純；實驗室用水均為超純水。

HWS-12 型數顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；P7 型紫外分光光度計 北京高能科迪科技有限公司；RE-52 型旋蒸儀 上海錦賦實驗儀器設備有限公司；DDSJ-308A 型電導率測定儀 雷滋儀電科學儀器股份有限公司；Bruker AM-600 型核磁共振 Bruker Physik-AG 公司；Finnigan Trace Ultra-DSQ II 單四級桿氣相色譜-質譜聯用儀器Thermo 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DES 試劑的制備 參考DES 的制作方法[23-25]并稍作修改，將氯化膽堿與乳酸以摩爾比4:1 稱量20 g 氯化膽堿，50 g 乳酸，置于藍蓋瓶中，后加入21 mL的去離子水混合，置于80 ℃的數顯恒溫水浴鍋內加熱至大部分試劑熔化，再轉移至磁力加熱攪拌器上，在80 ℃下不斷攪拌獲得均一透明的液體，即為DES，然后按照添加水稀釋到不同濃度的DES，貯藏備用。

1.2.2 鐵皮石斛粗多糖的提取 稱取約1.00 g 鐵皮石斛粉末，按照一定的液料比加入不同濃度的DES，設定提取溫度及提取時間，提取完成后離心（4000 r/min、20 min），取上清液，加入其4 倍體積的無水乙醇進行沉淀，并常溫靜置過夜，第二天進行離心去上清液后復溶鐵皮石斛粗多糖，利用旋蒸去除乙醇，得到鐵皮石斛粗多糖。

1.2.3 單因素實驗 以鐵皮石斛多糖提取率為指標，參照李佳等[2]選取2 h 為本試驗的提取時間，溫度設置為70 ℃，液料比為90:1 mL/g，考察DES 濃度（20%、30%、40%、50%、60%）；DES 濃度為30%，液料比為90:1 mL/g，考察提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）；溫度設置為70 ℃，DES 濃度為30%，考察液料比（50:1、70:1、90:1、110:1、130:1 mL/g）對鐵皮石斛多糖提取率的影響。

1.2.4 響應面試驗 依據單因素實驗結果，運用Design-Expert 8.0.6 軟件進行 Box-Behnken 試驗，采用三因素三水平（A：DES 濃度、B：提取溫度、C：液料比）進行響應面試驗設計，考察鐵皮石斛多糖提取率變化，因素水平設計見表1。

表1 響應面設計因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.5 陰離子交換柱純化多糖 將所得粗鐵皮石斛多糖粉末溶解，用微孔濾膜去除雜質后，經壓力泵上樣注入DEAE-52 陰離子交換柱，采用 0、0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L 的氯化鈉溶液進行梯度洗脫[13]。利用自動收集器收集洗脫液，每管收集體積為10 mL。采用苯酚-硫酸法測定每管洗脫液的多糖含量，并測定其在490 nm 下的紫外分光光度，以管數為橫坐標，多糖吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。合并相同組分洗脫液濃縮凍干，得到純多糖。

1.2.6 葡聚糖凝膠柱純化多糖 對經陰離子交換柱純化后所得的鐵皮石斛多糖洗脫組分進行葡聚糖凝膠柱純化[14]，稱取鐵皮石斛多糖溶于蒸餾水中，配制成濃度為10 mg/mL 的溶液，定容后用微孔濾膜過濾，經Sephadex G-100 凝膠色譜柱進行純化，用蒸餾水作為洗脫液，用自動收集器收集，每管收集體積8 mL。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，以管數為橫坐標，多糖吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。收集所得到的多糖溶液進行凍干得到鐵皮石斛精多糖。

1.2.7 多糖提取率及純度測定方法 葡萄糖標準曲線制備：采用苯酚-硫酸法[26]制作標準曲線，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程為y=0.9229x-0.0144，R2=0.9989。按照1.2.2 的方法提取操作重復3 次，用苯酚-硫酸法比對標準曲線測定總糖含量。參照賈夏等[27]的3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定還原糖的濃度，并計算多糖的純度。

式中：M總，總糖的質量，g；M還，還原糖的質量，g；M，粗多糖質量，g。

按下列公式計算多糖提取率：

式中：M多糖，粗多糖中多糖的質量，g；m，稱取的鐵皮石斛粉的質量，g。

1.2.8 鐵皮石斛多糖的單糖組成測定 參照Anna等[28]并稍作修改，精確稱取10.0 mg 鐵皮石斛多糖至具塞試管，加入6 mL 2 mol/L 三氟乙酸，密封置于110 ℃烘箱中水解2 h，冷卻后加入2 mL 甲醇旋轉蒸發，再依次加入鹽酸羥胺10 mg、吡啶2.5 mL，90 ℃水浴加熱30 min，冷卻后加入乙酸酐2.5 mL，90 ℃水浴加熱30 min，冷卻，即得多糖衍生化物。其余各單糖標準品的制備方法同上。最后進行GCMS 測定[19]。

1.2.9 鐵皮石斛多糖的核磁共振測試 參照Xi 等[29]并作修改，精確稱取100.0 mg 干燥的鐵皮石斛多糖用D2O 溶解后，冷凍干燥，如此反復3 次，將溶解后的多糖置于核磁管中在Bruker AM-600 型核磁共振儀上進行均一多糖的核磁譜圖測定，掃描時間為8 h，對其進行1H-NMR 和13C-NMR 分析，得到核磁共振圖譜。

1.3 數據處理

采用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 進行響應面分析，數據通過Graphpad Prism 8 軟件進行計算繪圖。采用多重比較法進行顯著性分析（P<0.05 表示差異顯著）。實驗數據為三組數據平均值，以平均值±標準偏差（X±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 DES 濃度對鐵皮石斛多糖提取率的影響 DES濃度的變化對鐵皮石斛多糖提取率的影響如圖1 所示。由圖1 可知，鐵皮石斛多糖的提取率呈先上升后逐漸下降的趨勢，當DES 的濃度從20%升到40%時多糖提取率從15.1%升到30.7%，原因可能是隨著DES 濃度的提高，DES 中氫鍵受體和配體的數量逐漸增加，導致氫鍵數目會增加[22]，讓更多的多糖滲入到提取液中，從而提高了多糖提取率。當DES 濃度繼續提高，多糖的提取率逐漸下降，這是因為DES 試劑是由氯化膽堿和乳酸配制而成，試劑內部離子力通常較強且黏度較大，不利于溶質的溶出，因此在使用過程中加入適量的蒸餾水來降低溶液的剪切力[30]。因此在40%DES 濃度時更有利于鐵皮石斛多糖的提取，并選取DES 濃度為30%、40%、50%做響應面試驗以確定最佳DES 濃度。

圖1 DES 濃度對鐵皮石斛多糖提取率的影響Fig.1 Effect of DES concentration on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.1.2 溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響 溫度變化對鐵皮石斛多糖提取率的影響如圖2 所示。由圖2 可知，鐵皮石斛多糖的提取率變化呈緩慢上升后下降的趨勢，當溫度從50 ℃升高到80 ℃時，多糖提取率最高，從14.2%升高到23.4%，是因為隨著溫度的升高，增加了物質的熱運動，提高了多糖分子擴散效率，使多糖在整個體系中的溶解更迅速。當溫度繼續提升到90 ℃，多糖的提取率反而略有下降。一方面，可能是因溫度繼續升高時，鐵皮石斛多糖中可能存在熱敏性物質，在溫度升高條件下會使得這些成分易變性降解[31]，另一方面，較高溫度導致蒸發，影響了溶劑平衡，從而降低了提取率。因此，選取提取溫度為70、80、90 ℃做響應面試驗以確定最佳提取溫度。

圖2 溫度對鐵皮石斛多糖提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.1.3 液料比對鐵皮石斛多糖提取率的影響 液料比對鐵皮石斛多糖提取率的影響如圖3 所示，鐵皮石斛多糖的提取率變化呈現先上升后下降的趨勢，當液料比為110:1 時提取率最高，從18.1%升高到32.2%，可能是由于DES 為黏稠液體，在一定范圍內，隨著液料比提高，溶劑與鐵皮石斛的接觸面積增多，增加了多糖的溶出，使得多糖提取率增加；但溶劑加入過多時，溶劑用量較大，鐵皮石斛粉與溶劑接觸面積不斷增大，溶出了其他雜質，導致多糖溶解被抑制[32]。因此，選取90:1、110:1、130:1（mL/g）做響應面試驗以確定最佳液料比。采用DES 不僅對鐵皮石斛多糖實現了綠色提取，同時在提取率上也優于超聲輔助、微波輔助結合酶解及閃式提取[6-8]。

圖3 液料比對鐵皮石斛多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果 在鐵皮石斛多糖提取的過程中，以DES 濃度、提取溫度和液料比為影響因素，多糖提取率為響應值。試驗設計與結果見表2。

表2 響應面優化試驗設計及結果Table 2 Designs and results of Box-Behnken test

2.2.2 響應面二次回歸模型的建立與方差分析 由表2 的試驗結果，用響應面分析軟件操作，得出鐵皮石斛多糖提取率為響應值 Y 的回歸方程：Y=33.55+1.56A+0.36B+0.75C-0.42AB+0.14AC+0.13BC-6.29A2-6.75B2-5.92C2。

由表3 方差分析結果可知，該模型的F=681.25，回歸模型項P<0.0001，失擬項P>0.05，為不顯著，說明試驗誤差小[33]。試驗結果與模型擬合度好[34]。由F檢驗可知，影響鐵皮石斛多糖提取率的主次因素為DES 濃度>液料比>提取溫度，方差分析顯示，A、C 對 Y 影響極顯著（P<0.001），B 對 Y 影響顯著（P<0.05），A2、B2、C2都是極顯著的模型項（P<0.001）。

表3 回歸模型的方差分析結果Table 3 Regression model of variance analysis results

2.2.3 響應面曲面分析因素之間的交互作用 用Design-Expert 8.6 軟件，對DES 濃度、提取溫度、液料比3 個因素兩兩交互，做不同因素間響應面3D圖，響應面圖和等高線圖可以反映各因素間的相互作用及最佳參數。三維圖越陡峭[35]，表明相應因素對多糖提取率影響較大。圖4B 等高線圖為近圓形可知液料比和DES 濃度的交互作用對響應值的影響不顯著；由圖4C 可知，鐵皮石斛多糖的提取率隨液料比及提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，等高線圖為近圓形說明對鐵皮石斛多糖提取率無顯著影響。由圖4 知，兩因素交互項AB>AC>BC，其中僅有AB 的P<0.05，表明AB 兩因素間交互作用對響應值的影響顯著，隨著提取溫度的升高，分子運動加快，提高了溶劑的滲透能力，提取率隨之升高，但溫度過高可能會對多糖分子結構產生破壞作用[36]。

圖4 各因素交互作用對鐵皮石斛多糖提取率的影響Fig.4 Effect of interaction of various factors on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2.4 響應面優化與驗證實驗 利由響應面軟件分析顯示預測最佳提取工藝條件為DES 濃度39.5%、提取溫度80.1 ℃、液料比112.4:1（mL/g），鐵皮石斛多糖提取率為33.5%。根據實際情況調整提取參數為DES 濃度40%、提取溫度 80 ℃、液料比110:1（mL/g），在此條件下提取2 h，得出驗證結果多糖提取率為 33.2%±0.28%，擬合度好，誤差為1.7%，充分驗證了模型的準確性，該工藝優化合理、有效。多糖的純度為56.95%±1.2%。與傳統的提取方法相比較，本文采用DES 溶劑提取鐵皮石斛多糖實現了較高的提取率，陳盛余等[37]采用微波輔助提取鐵皮石斛多糖，其提取率為9.77%，而王琳等[38]采用熱水浸提法提取鐵皮石斛多糖，其提取率為30.83%，均較DES 溶劑提取率低，此外本研究提取方法綠色、安全性高，可以為后續的提取提供一種高效綠色的方案。

2.3 陰離子交換柱純化

如圖5 所示，DOP 純化后得到3 個多糖洗脫組分，DOP1 為蒸餾水洗脫得到的組分；DOP-2 為0.05 mol/L NaCl 溶液洗脫下的組分；DOP-3 為0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫下的組分。由洗脫圖譜可見三個組分均未出現拖尾現象，表明各組分間分離效果較好，與DOP-2 和DOP-3 相比較，DOP-1 組分相對含量高，占比為72.6%。洗脫過程在260 和280 nm波長處未出現特征性吸收峰，這表明其不包含游離的蛋白質和核苷酸[39]，達到初步純化的效果。

圖5 鐵皮石斛粗多糖陰離子交換柱洗脫曲線Fig.5 Anion exchange column elution curve of crude Dendrobium officinale polysaccharides

2.4 葡聚糖凝膠柱純化

繼續采用Sephadex G-100 色譜柱對DOP-1 進一步純化，結果如圖6 所示。DOP-1 獲得一個集中的單峰，表明其純度較高。收集8～30 管DOP-1 的洗脫液并進行冷凍干燥得到純化多糖，測定其純度為90.8%，命名其為DOP-1-1。

圖6 鐵皮石斛多糖的葡聚糖凝膠柱洗脫曲線Fig.6 Dextran gel column elution profile of Dendrobium officinale polysaccharides

2.5 鐵皮石斛的單糖組成分析

采用GC-MS 對DOP-1-1 進行單糖組成分析，多糖的總離子流色譜圖如圖7 所示。通過對比標準單糖（圖7A）可知，鐵皮石斛多糖組分主要由葡萄糖和甘露糖單糖組成，根據峰面積計算葡萄糖和甘露糖的總和占比80%，葡萄糖和甘露糖質量比約為43:37，此外還含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等。表明DOP-1-1 是一種葡甘露聚糖為主的雜多糖。

圖7 單糖標準品（A）和鐵皮石斛多糖（B）GC-MS 總離子流色譜圖Fig.7 GC-MS total ion flow chromatogram of monosaccharide standard (A) and Dendrobium officinale polysaccharides (B)

2.6 鐵皮石斛多糖的核磁共振分析

鐵皮石斛多糖的1H NMR（圖8A）顯示9 個異頭氫，其化學位移δ分別為1.85、2.13、3.29、3.50、3.76、4.07、4.70、5.35、5.45；13C NMR 譜圖（圖8B）顯示有7 個信號峰，其化學位移δ分別為20.28、60.42、69.99、71.54、75.00、76.53、100.16。在4.070～4.741 ppm與4.036～4.703 ppm 處的強烈異頭質子信號峰是由D2O 中 的HDO 所引起 的[40]。1H NMR 光譜中δ3.76 ppm 和13C NMR 光譜中δ71.54 ppm 處的強烈信號提示其可能含有（1→3）糖苷鍵的連接方式[41]。1H NMR 光譜中δ3.29 ppm 和13C NMR 光譜中δ69.99 ppm 處的強烈信號提示多糖中存在（1→4）糖苷鍵[27]。在δ3.50 ppm 處的信號峰提示提示可能存在（1→2，4）糖苷鍵[42]。1H NMR 光譜中δ5.45 ppm的化學位移來自1，3-Galp 的H1。此外1H NMR 一般用于研究多糖糖苷鍵的結構特點[43]，α糖苷鍵的質子信號通常集中在大于5 ppm 的位置，而β糖苷鍵的化學位移一般低于5 ppm，表明其同時含有α糖苷鍵和β糖苷鍵。

圖8 鐵皮石斛多糖的核磁共振圖譜Fig.8 Nuclear magnetic resonance mapping of Dendrobium officinale polysaccharides

3 結論

本文通過DES 溶劑提取鐵皮石斛多糖的結果表明，響應面試驗得到最佳提取工藝為DES 濃度40%、提取溫度 80 ℃、液料比110:1（mL/g），此條件下鐵皮石斛多糖提取率達 33.2%±0.28%，多糖的純度為56.95%±1.2%。在纖維素柱與凝膠柱純化后，多糖的純度可達90.8%，多糖組分主要由葡萄糖和甘露糖構成，其質量比約為43:37，還含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等，結構中同時含有α糖苷鍵和β糖苷鍵，采用DES 法提取多糖，可以有效提高多糖提取率。本研究建立了一套綠色、高效的鐵皮石斛多糖提取方法，為后續的鐵皮石斛多糖開發提供參考。