九蒸九制對黃精中AGEs 含量、多糖結(jié)構(gòu)及體外活性的影響

馬永強，張一鵬，王 鑫,2, ，張絲瑤

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省谷物食品與谷物資源重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江省林業(yè)科學院，黑龍江哈爾濱 150081）

黃精（Polygonatum sibiricum）作為我國的藥食兩用植物，其主要的活性成分為黃精多糖[1]，具有降血糖、降血脂、防止動脈粥樣硬化等多種藥理作用[2-3]。由于鮮黃精內(nèi)部富含水分，在運輸和貯藏時極易產(chǎn)生霉變、蟲蛀等現(xiàn)象，影響黃精的產(chǎn)品品質(zhì)。同時，鮮黃精具有較強刺激性，生品服用或接觸時，易產(chǎn)生致敏反應(yīng)[4]，脾胃虛寒者直接服用鮮黃精易發(fā)生便溏現(xiàn)象[5]。因此，通常對黃精采用干制、炮制等不同的加工方式，以延長其貨架期，便于大量貯藏和運輸，同時消除其刺激性。

黃精的加工方式多種多樣，在眾多的加工方式中，尤以“九蒸九制”法最為著名，較多典籍中均認為九蒸九制的加工方法可以使黃精“糖性變濃”口感香甜，同時起到減毒增效的作用[6-7]。但是，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)九蒸九制后的黃精多糖含量下降明顯，黃精色澤發(fā)生了明顯的褐變，并散發(fā)焦香，同時，有多位學者在九蒸九制黃精中檢測到了美拉德反應(yīng)的標志產(chǎn)物5-羥甲基糠醛（5-HMF）以及黃精多糖單糖組成改變的現(xiàn)象，說明黃精在九蒸九制的加工過程中很可能發(fā)生了美拉德反應(yīng)，并對黃精多糖產(chǎn)生了一定程度的影響[8-10]。

對于九蒸九制黃精多糖含量下降的現(xiàn)象，有研究將其歸咎于美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的糖異構(gòu)化及糖降解[11]，但并未對其降解及單糖組成改變的機制進行詳細的解答，且鮮有發(fā)現(xiàn)與黃精中AGEs 測定及來源機制相關(guān)的研究。在眾多AGEs 中羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）和羧乙基賴氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL）被公認是AGEs 最重要的指標性成分，會加速人體衰老并與阿爾茨海默病等多種疾病相關(guān)[12]。因此，實驗嘗試通過測定美拉德反應(yīng)代表產(chǎn)物5-羥甲基糠醛（5-HMF）及AGEs 的含量，初步探究九蒸九制黃精中美拉德反應(yīng)對黃精多糖的組成、結(jié)構(gòu)及其黃精多糖對體外活性的影響，為黃精在不同加工方式下功效差異的理論研究提供支撐，同時還能夠為黃精等藥食同源物料的綠色加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精 產(chǎn)自黑龍江省天問山；5-HMF（≥99%）

美國 Sigma-aldrich 公司；CML、CEL（≥98%）阿拉丁試劑有限公司；葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、古洛糖醛酸（guluronic acid，G）、甘露糖醛酸（mannuronic acid，M）等14 種單糖標準品上海源葉生物科技有限公司；硼氫化鈉 西隴科學股份有限公司；α-淀粉酶（4000 U/g）、α-葡萄糖苷酶（60 U/mg）上海和氏璧有限公司；四硼酸鈉鹽酸東曹化學科技有限公司；正己烷、氯仿、乙腈、甲醇、氨水、氫氧化鈉等試劑 均為國產(chǎn)分析純。

ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-XS 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、Oasis MCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Waters 公司；Infinity-II-126 型高效液相色譜儀、Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）安捷倫科技中國有限公司；Scimitar 2000 型紅外光譜分析儀 美國安捷倫公司；STA6000 熱重分析儀 PerkinElmer 儀器有限公司；Alpha 2-4 LDplus 真空冷凍干燥機 上海景萊科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 九蒸九制黃精制備 取鮮黃精除雜洗凈，切片，隔水蒸制3 h，取出稍晾，于100 ℃烘箱中干燥6 h，如此反復(fù)操作至9 次，即得九蒸九制黃精[13]。為方便后續(xù)實驗，將其打磨成粉，過40 目篩備用。

1.2.2 5-HMF 含量測定 稱取5-HMF 標準品加入甲醇，配制成1.0、5.0、10.0、15.0 和20.0 μg/mL 的標準品溶液，進行測定并繪制標準曲線。

稱取鮮黃精及九蒸九制黃精樣品粉末0.4 g，加80%甲醇25 mL，稱重后超聲提取30 min，放冷后再次稱重，以80%甲醇補足減少的質(zhì)量，4000 r/min 離心5 min 后取上清液用0.22 μm 濾膜過濾后得到供試品溶液[14]。

使用Infinity-II-126 型高效液相色譜儀測定供試品溶液中5-HMF 含量。HPLC 條件：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：35 ℃，流動相為水-甲醇（9:1），流速：0.8 mL/min，紫外檢測波長：275 nm，進樣量：50 μL[14]。

1.2.3 AGEs 含量測定

1.2.3.1 對照品溶液制備 稱取CML 和CEL 標準品各5.0 mg 分別溶于5 mL 超純水中，分別配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的CML 和CEL 標準溶液，混勻后將標準溶液梯度稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000 ng/mL的CML、CEL 混合標準溶液。

1.2.3.2 供試品溶液制備 參考宮瑞澤[15]的方法對樣品進行前處理，并稍加改動。稱取鮮黃精及九蒸九制黃精樣品粉末各20 mg，加入正己烷離心完成脫脂。加入硼酸鹽緩沖液（pH9.2）和硼氫化鈉溶液，置于4 ℃條件下放置24 h。然后加入氯仿-甲醇（2:1，V/V）后離心，向沉淀物中加入鹽酸并水解24 h。吸取水解后的溶液在80 ℃下干燥，再復(fù)溶于超純水中。將Waters Oasis MCX 固相萃取小柱進行活化，取1 mL 樣液加到固相萃取小柱中，用3 mL 水及3 mL 甲醇進行淋洗，最后用5 mL 甲醇進行洗脫。將洗脫液在60 ℃氮吹至干，再復(fù)溶于1 mL 超純水中，將其用于液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）測定黃精樣品中AGEs 的含量。

1.2.3.3 檢測條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動相A 為乙腈，流動相B 為0.1%甲酸，梯度洗脫程序：0～1 min，2% A，98% B；1～3 min，2%～5% A，98%～95% B；3～4.5 min，5%～10% A，95%～90% B；4.5～6 min，10%～2% A，90%～98% B。流速0.1 mL/min，進樣量1.0 μL，柱溫30 ℃[16]。

MS 條件：電噴霧離子源正離子模式；毛細管電壓3.5 kV；脫溶劑溫度400 ℃；脫溶劑氣流量600 L/h；錐孔氣流量150 L/h；離子源溫度110 ℃；碰撞氣流量0.16 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.4 黃精多糖提取、分離純化及含量測定 將黃精粉末經(jīng)正己烷脫脂后自然溫度下晾干，在料液比1:20 g/mL、浸提溫度80 ℃、浸提時間2 h 的條件下采用水熱浸提法提取九蒸九制前后的黃精多糖，采用Sevage 法除去浸提液中多余的蛋白質(zhì)，在多糖浸提液中加入4 倍體積的80%乙醇，醇沉24 h 后離心、真空冷凍干燥，得到鮮黃精粗多糖及九蒸九制黃精粗多糖。粗多糖經(jīng)DEAE-52 纖維素柱層析及Sephadex G-100 柱層析后，旋蒸后再次真空冷凍干燥，即得到精制黃精多糖[17]。

取濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液25 mL，將其定容至250 mL 得到標準樣品溶液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 的葡萄糖標準液，依次加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL 蒸餾水，采用苯酚硫酸法，以蒸餾水作空白樣品，在490 nm 處測定吸光值，得到葡萄糖的標準曲線。稱取黃精多糖粉末用去離子水定容后測定其吸光度，帶入回歸方程后計算多糖含量。

1.2.5 九蒸九制法對黃精多糖的結(jié)構(gòu)影響

1.2.5.1 紫外光譜分析 稱取PSP（黃精多糖）、N-PSP（九蒸九制黃精多糖），配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，在200～400 nm 波長范圍內(nèi)進行紫外可見光掃描。

1.2.5.2 傅里葉紅外光譜分析 稱取PSP 及N-PSP粉末5 mg，KBr 壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀對PSP、N-PSP 在4000～500 cm-1范圍內(nèi)進行掃描，并分析加工方式對黃精多糖官能團的影響。

1.2.5.3 剛果紅試驗 分別將PSP 和N-PSP 與剛果紅試劑混合，配制成濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L 的NaOH 溶液，在400～700 nm 范圍內(nèi)進行紫外分光光譜掃描[14]，測定溶液最大吸收波長，使用去離子水代替多糖溶液作為空白對照組。

1.2.5.4 熱重分析 利用熱重分析系統(tǒng)對PSP、NPSP 進行熱重分析，取適量樣品，置樣品容器中，在N2氣氛下測定樣品在0～700 ℃區(qū)間的質(zhì)量變化，控制升溫速率為10 ℃/min。

1.2.5.5 單糖組成分析 a.單糖標準品的衍生化：準確稱取14 種單糖標準品分別配成0.4 mg/mL 的溶液待用。將單糖標準品溶液按等體積進行混合，取400 μL 的混合單糖標準液加入400 μL 濃度為0.6 mol/L 的NaOH 進行混合，再加入400 μL PMP甲醇溶液后漩渦混勻，70 ℃水浴中反應(yīng)2 h，冷卻后加入HCl 中和至中性。加入1200 μL 水及1200 μL的三氯甲烷，渦旋混勻，靜置后棄去三氯甲烷，重復(fù)操作2 次后，將水相用0.45 μm 濾膜過濾后即得到衍生化后的單糖混合標準品供HPLC 進樣分析[17]。

b.黃精多糖的衍生化：稱取PSP 及N-PSP 各15 mg 于20 mL 的鉗口瓶中，加入5 mL 的2 mol/L三氟乙酸溶液，充氮氣封管，于100 ℃烘箱中水解2 h。冷卻后用氮吹儀吹干，加入1 mL 甲醇后繼續(xù)吹干，如此重復(fù)2 次以去除三氟乙酸。加入1 mL 0.3 mol/L 的NaOH 溶液進行充分溶解，得到多糖水解液，吸取400 μL 進行衍生化處理及HPLC 分析[15]。

c.色譜條件：色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH6.7），流動相B 為乙腈；檢測波長為250 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量5 μL；洗脫程序：0～9 min 為86%～83% A，14%～17% B，9～28 min 為83%～78% A，17%～22% B，28～31 min 為78%～50%A，22%～50% B，31～36 min 為50%～86% A，50%～14% B。

1.2.6 九蒸九制對黃精多糖體外降血糖活性的影響研究

1.2.6.1 黃精多糖對α-淀粉酶的抑制作用研究 移取2、4、6、8、10 mg/mL 質(zhì)量濃度的PSP、N-PSP 溶液100 μL，加入100 μL 的α-淀粉酶溶液（1.2 U/mL），37 ℃水浴5 min，加入PBS 配制的淀粉溶液（質(zhì)量分數(shù)1%），37 ℃水浴15 min，再加入2 mL DNS 溶液，沸水浴5 min 后取出冷卻，用蒸餾水稀釋至10 mL，使用阿卡波糖作為陽性對照，在540 nm 處測定吸光度。

式中：A1為緩沖液代替多糖的吸光度值；A2為緩沖液代替酶液和多糖溶液的吸光度值；A3為黃精多糖的吸光度值；A4為緩沖液代替酶液的吸光度值。

1.2.6.2 黃精多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

移取2、4、6、8、10 mg/mL 質(zhì)量濃度的PSP、NPSP 溶液1 mL，加入0.1 mLα-葡萄糖苷酶（1 U/mL）和2 mL 的磷酸鹽緩沖液，37 ℃下保持10 min 后加入1 mL 谷胱甘肽溶液和0.25 mL 對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷，于37 ℃下反應(yīng)10 min，再加入2 mL 碳酸鈉溶液，使用阿卡波糖作為陽性對照，在400 nm 處測定吸光度[18]，根據(jù)公式（1）計算抑制率及IC50數(shù)值。

1.2.7 加工方式對黃精多糖體外抗氧化效果的影響研究

1.2.7.1 黃精多糖DPPH 自由基清除率測定 向試管中加入2 mL 的DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），然后加入1.0 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L pH7.0），最后加入2.0 mL PSP 及N-PSP 樣品溶液（2、4、6、8、10 mg/mL），室溫避光30 min，并以稀釋100 倍的VC溶液作陽性對照，在517 nm 處測得反應(yīng)后吸光值A(chǔ)1，以無水乙醇代替DPPH 得到吸光值A(chǔ)2，蒸餾水對照值為A0，按公式（2）計算DPPH 自由基清除率。

式中：A1為樣品溶液的吸光值；A2為無水乙醇代替DPPH 的參比對照吸光值；A0為蒸餾水代替樣品的空白對照吸光值。

1.2.7.2 黃精多糖ABTS+自由基清除率測定 將7 mol/L 的ABTS 溶液按1:1 的比例與2.45 mol/L的過硫酸鉀溶液混合，避光靜置16 h，采用紫外分光光度計，在734 nm 波長下用PBS 緩沖液（pH7.4）稀釋ABTS 溶液，調(diào)節(jié)吸光度至0.7 備用。分別向試管中加入2 mL ABTS+溶液，加入不同質(zhì)量濃度的PSP 及N-PSP 溶液，避光反應(yīng)20 min，以稀釋一百倍的VC作為陽性對照，在734 nm 處測定吸光度，按公式（3）計算ABTS+自由基清除率。

式中：A1為樣品溶液的吸光值；A0為蒸餾水代替樣品的空白組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品進行3 次測定，相關(guān)性與顯著性差異采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行分析，P<0.05 時表示存在顯著性差異，采用Origin 2018 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-HMF 含量測定結(jié)果

在1.0～20 μg/mL 范圍內(nèi)，以5-HMF 質(zhì)量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到線性方程y=84.207x-45.312，R2=0.9974，表明二者具有良好的線性關(guān)系。以信噪比為3 和10 確定方法的檢出限和定量限，LOD 和LOQ 分別為1.86、6.13 ng/mL。

通過對鮮黃精樣品進行檢測，結(jié)果顯示未檢測到5-HMF。九蒸九制黃精樣品的高效液相色譜圖見圖1，九蒸九制黃精中5-HMF 含量為（631.3±21.5）μg/g。

圖1 九蒸九制黃精5-HMF 液相圖Fig.1 5-HMF liquid chromatogram of nine steaming-nine processing Polygonatum sibiricum

結(jié)果表明，經(jīng)過九蒸九制后黃精中的5-HMF 含量明顯增加，這一變化與張帆[19]的研究結(jié)果一致。由此說明，不同加工方式對于黃精中5-HMF 含量的影響差異較大，黃精在九蒸九制過程中由于受到高溫進而加劇了糖苷鍵斷裂，使得多糖發(fā)生了一定程度的水解現(xiàn)象，經(jīng)過脫水反應(yīng)后從而生成了5-HMF[19]，九蒸九制過程促使了黃精中5-HMF 含量的顯著上升。

2.2 AGEs 含量測定結(jié)果

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限 以CML 和CEL的分子離子峰[M＋H]＋理論精確質(zhì)量數(shù)提取色譜圖，如圖2 所示。在1.0～1000 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子對的響應(yīng)峰面積為縱坐標繪制標準曲線，以信噪比為3 和10 確定方法的檢出限和定量限，結(jié)果如表2 所示。在1.0～1000 ng/mL 范圍內(nèi)，二者均呈良好的線性關(guān)系。

圖2 混合標準溶液中CML 和CEL 的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion flow chromatogram of CML and CEL in mixed standard solution

表2 CML 和CEL 的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)R2、檢出限與定量限Table 2 Linear range,linear equation,correlation coefficient R2,limit of detection and limit of quantitation for CML and CEL

2.2.2 實際樣品測定 九蒸九制后的黃精中CML和CEL 含量見表3。通過表可知，九蒸九制后黃精中CML 和CEL 含量增加至（342.4±11.3）μg/g、（63.7±9.8）μg/g。由此表明，九蒸九制對于黃精的CML 和CEL 含量變化有著較大影響，在蒸制加工過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)使其生成了較多含量的CML 和CEL，這與宮瑞澤[15]的研究結(jié)果一致。在高溫的蒸制環(huán)境中，黃精多糖中的一部分還原糖經(jīng)糖基化反應(yīng)形成了AGEs[20]，此外，黃精中的抗壞血酸可以氧化成L-阿蘇糖，經(jīng)氧化裂解也可以形成CML 及CEL[21]。因此，經(jīng)過反復(fù)蒸制后的黃精中CML 和CEL 含量得以顯著上升。

表3 不同加工方式的黃精中CML 及CEL 含量Table 3 Content of CML and CEL in different process methods of Polygonatum sibiricum

2.3 黃精多糖含量測定及結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 多糖含量的測定 以葡萄糖質(zhì)量濃度和其吸光度值繪制葡萄糖標準曲線，回歸方程為y=0.0145x-0.0034，R2=0.999。根據(jù)標準曲線，采用苯酚硫酸法測得鮮黃精多糖含量為15.32%±1.62%，九蒸九制黃精多糖含量為12.21%±1.43%，且多糖純度在90%以上。結(jié)果表明九蒸九制后黃精多糖含量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這是因為在多次蒸制的過程中多糖發(fā)生了降解，大量水解為單糖和低聚糖從而使得其含量有所降低[22]。

2.3.2 紫外光譜分析結(jié)果 經(jīng)UV 檢測，結(jié)果圖3 顯示PSP 及N-PSP 中蛋白質(zhì)或者其他雜質(zhì)含量極低，說明提取到的兩種多糖均為純度較高的多糖。

圖3 黃精多糖的紫外光譜分析Fig.3 Ultraviolet spectrum analysis of Polygonatum sibiricum polysaccharide

2.3.3 紅外光譜分析結(jié)果 采取傅里葉紅外光譜對不同加工方式后提取的黃精多糖官能團分析（圖4），PSP 及N-PSP 在3325、2925 cm-1處的吸收峰是多糖的O-H、C-H 伸縮振動引起的[23]。在1618、1603、1412 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是-COO-伸縮振動引起的，表明多糖中含有糖醛酸，1022、1050 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是由吡喃糖環(huán)的C-O 鍵引起的，N-PSP 在817、872 cm-1處的吸收峰是由α-糖苷鍵及β-糖苷鍵振動產(chǎn)生[24]，與PSP 相比，N-PSP 在1740 cm-1處出現(xiàn)的特征吸收峰為羧基酯化的C=O 伸縮振動引起的。以上結(jié)果表明鮮黃精和九蒸九制黃精多糖均屬于含吡喃環(huán)的多糖，并且九蒸九制加工后得到的黃精多糖會發(fā)生較為明顯的酯化反應(yīng)[25]。

圖4 九蒸九制對PSP 官能團的影響Fig.4 Effect of nine steaming-nine processing on PSP functional groups

2.3.4 九蒸九制對黃精多糖三螺旋結(jié)構(gòu)的影響 完整的線性三螺旋結(jié)構(gòu)是保持多糖較高免疫活性的前提條件，有研究發(fā)現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu)多糖表現(xiàn)出較強的抗S-180 腫瘤的生物活性[26]，剛果紅能夠與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，絡(luò)合物的最大吸收波長會發(fā)生紅移，并在一定的NaOH 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)亞穩(wěn)性[27]。從圖5 中可看出，剛果紅與PSP 及NPSP 混合后，其最大吸收波長發(fā)生了明顯的偏移并出現(xiàn)亞穩(wěn)區(qū)，由此可推測黃精多糖是一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖組分，且九蒸九制的加工方法并未破壞黃精多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3.5 熱重分析結(jié)果 由圖6 可見，PSP 及N-PSP的熱降解有很明顯的三個階段，當溫度從40 ℃附近升至200 ℃時，PSP 的質(zhì)量損失高于N-PSP，在后兩個階段質(zhì)量趨于一致。這可能是由于溫度升高導(dǎo)致多糖內(nèi)部的部分親水基團水分蒸發(fā)，鮮黃精中提取到的PSP 吸附水與結(jié)合水含量更高。當溫度在200 ℃附近時，多糖樣品的質(zhì)量縮減幅度增大，這可能是因為高溫使多糖分子發(fā)生了劇烈的解聚和分解作用，大量多糖分子被裂解，產(chǎn)生CO2、水蒸氣等析出[28]，當溫度從400 ℃附近升至600 ℃時，由于大多數(shù)多糖在此時已經(jīng)過高溫處理，成為了碳化結(jié)構(gòu)，質(zhì)量分數(shù)的下降趨勢趨于平緩。

圖6 PSP 及N-PSP 熱分析Fig.6 Thermal analysis of PSP and N-PSP

2.3.6 九蒸九制對黃精多糖單糖組成的影響分析采用PMP 衍生化-HPLC 法檢測未蒸制及九蒸九制后的黃精所制得多糖的單糖組成，檢測結(jié)果如圖7和表4 所示。通過與混合的單糖標準品色譜圖對比，可以看出PSP 的多糖組成中Man、GalUA、Glc、Gal、Ara 五種單糖含量較多，其摩爾百分比分別為34.53%、9.59%、21.17%、22.59%、9.55%。N-PSP 的單糖含量有所變化，Glc 比例有所增長，其摩爾百分比達到49.72%，Gal 及Ara 在蒸制后比例變化較小。單糖中Man 及GalUA 的摩爾比有明顯降低，Man從34.53%降至17.06%，GalUA 從9.59%降至1.77%，這與吳豐鵬等[29]的研究趨勢相同。研究結(jié)果表明，在九蒸九制的加工過程中，黃精中的部分糖類物質(zhì)由于發(fā)生美拉德反應(yīng)導(dǎo)致其發(fā)生異構(gòu)化和降解現(xiàn)象[30]，使得黃精多糖中單糖的組成及其含量被改變。

圖7 PSP 及N-PSP 單糖組成分析Fig.7 Monosaccharide composition analysis of PSP and N-PSP

表4 鮮黃精及九蒸九制黃精多糖的單糖組成分析Table 4 Monosaccharide composition analysis of fresh Polygonatum sibiricum and nine steaming-nine processing Polygonatum sibiricum polysaccharide

2.4 加工方式對黃精多糖體外降糖功能的影響分析

在糖的催化反應(yīng)中，α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶起重要作用，可以通過抑制這兩種酶，降低碳水化合物的水解和消化，以達到降低血糖的藥理作用。由圖8A 可知，在質(zhì)量濃度為2～10 mg/mL 范圍，樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率遞增；當樣品質(zhì)量濃度達到10 mg/mL 時，PSP、N-PSP 對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為39.13%、51.23%。雖然黃精多糖與成品藥阿卡波糖相比，藥效有較大的差距，但還是具有明顯的抑制作用。由圖8B 可知，PSP、N-PSP 在質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，對α-淀粉酶的抑制率分別為38.43%、50.13%。結(jié)果表明，相對于PSP，N-PSP 對于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性。有研究發(fā)現(xiàn)含有葡萄糖、半乳糖的多糖具有相對較強的酶抑制能力[31]，在上文對于PSP 及N-PSP 的單糖組成分析中表明，N-PSP 中的葡萄糖比例有所增長，因此其酶抑制能力也更強。由此說明經(jīng)過九蒸九制加工后的黃精得到的多糖具有更好的體外降糖效果。

圖8 黃精多糖降血糖活性研究Fig.8 Study on hypoglycemic activity of Polygonatum sibiricum polysaccharide

2.5 加工方式對黃精多糖體外抗氧化活性的影響分析

由圖9 可知，隨著黃精多糖濃度的增大，DPPH自由基清除率及ABTS+自由基的清除能力均隨之提升。PSP 和N-PSP 對DPPH 自由基清除率的IC50數(shù)值分別為13.31、12.43 mg/mL。對ABTS+自由基清除率的IC50分別為13.42、12.24 mg/mL。陽性對照VC的抗氧化效果明顯高于黃精多糖。研究結(jié)果表明，N-PSP 的抗氧化能力雖弱于VC，但相較于PSP 卻具有一定的提升。這可能是因為黃精多糖通過美拉德反應(yīng)生成吡咯等雜環(huán)化合物，其有利于自由基的親電加成，使得自由基的清除效果增強[32]。并且有研究表明九蒸九制過程會使得黃精中的黃酮、多酚類物質(zhì)發(fā)生富集現(xiàn)象，其含量的增大也會提高NPSP 的抗氧化能力[4]。因此，經(jīng)過九蒸九制后得到的黃精多糖其體外抗氧化活性比PSP 更佳。

圖9 黃精多糖抗氧化活性研究Fig.9 Study on antioxidant activity of Polygonatum sibiricum polysaccharide

3 結(jié)論

通過實驗，在九蒸九制后的黃精中檢測到了5-HMF，含量為（631.3±21.5）μg/g，說明黃精在九蒸九制的過程中發(fā)生了較為明顯的美拉德反應(yīng)，同時產(chǎn)生了晚期糖基化終產(chǎn)物，CML 和CEL 含量分別為（342.4±11.3）μg/g、（63.7±9.8）μg/g。通過傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)N-PSP 出現(xiàn)一定程度的酯化現(xiàn)象，單糖組成分析顯示N-PSP 的單糖組成顯著改變，但九蒸九制并未破壞黃精多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)以及熱穩(wěn)定性。上述現(xiàn)象的主要原因可能是由于九蒸九制過程中黃精內(nèi)部的蔗糖及多糖產(chǎn)生熱降解，導(dǎo)致還原糖含量增加，參與美拉德反應(yīng)，使其多糖含量下降，單糖組成發(fā)生改變，并生成了AGEs。體外活性實驗結(jié)果顯示，九蒸九制的加工方式可以在一定程度上提升黃精多糖體外降血糖和抗氧化活性。其主要原因可能是由于加工過程中N-PSP 糖醛酸含量增加、單糖組成改變帶來的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、多糖-蛋白共價復(fù)合物的出現(xiàn)，使其體外活性作用得到了一定程度的提升，但其潛在的構(gòu)效機制尚有待于進一步研究。本研究對九蒸九制黃精多糖含量下降及其活性作用提升的原因，做出了初步解答，有助于為黃精及藥食同源類產(chǎn)品的高品質(zhì)加工提供新的思路。