液相色譜-質譜/質譜法測定植物源性產品中強極性殺菌劑三乙膦酸鋁殘留

祝子銅，雷美康，姜芝英，黃超群，葉有標，陳玉嬌，韓 超

（1.衢州海關綜合技術服務中心，浙江衢州 324003；2.杭州海關技術中心，浙江杭州 310016；3.浙江樹人學院，生物與環境工程學院，浙江杭州 310015）

三乙膦酸鋁（Fosethyl-AL）俗名疫霉靈、乙磷鋁等，是一種廣譜、低毒、安全的磷酸鹽類內吸性殺菌劑，有雙向內吸傳導作用。它對霜霉屬、疫霉屬引起的病害有良好的防治效果，是目前國內外防治多種果蔬霜霉病應用較多的藥劑，適用于水稻、蔬菜、瓜類等作物[1]。隨著該類殺菌劑的登記、推廣和使用，該類農藥殘留問題逐漸被人們所關注，歐盟、美國和日本等國家和地區對該類農藥制定了殘留限量標準。歐盟規定三乙膦酸鋁在蘑菇、谷物、油料作物等植物源性食品中的最大殘留限量分別為2、2、2 mg/kg[2]；美國規定三乙膦酸鋁在柑橘類、葡萄、番茄中的最大殘留限量分別為9、10、3 mg/kg[3]；日本規定三乙膦酸鋁在蘑菇、花生中的最大殘留限量分別為0.5、0.5 mg/kg[4]。我國最新頒布的食品安全國家標準GB 2763-2021《食品中農藥最大殘留限量》規定了黃瓜、蘋果、葡萄、荔枝中的最大殘留限量分別為9、10、10、3 mg/kg[5]。隨著這些法規的實施，急需建立配套的測定植物源性食品中三乙膦酸鋁殺菌劑的方法。

目前國內外公開報道的關于三乙膦酸鋁殺菌劑分析手段主要有氣相色譜法[6]、液相色譜-質譜/質譜法[7-10]、離子色譜-質譜/質譜法[11-12]。氣相色譜法需要先采用三甲基硅重氮甲烷在恒溫下對三乙膦酸鋁進行衍生化，在密閉反應瓶中用氫氧化鈉堿解三乙膦酸鋁生成乙醇，然后通過氣相色譜法測定衍生化或堿解后的產物，從而對三乙膦酸鋁進行定量。文獻報道的液相色譜-質譜/質譜法分析三乙膦酸鋁的方法僅僅針對菠菜[7]、橄欖油[8]、葡萄[9]、甘藍[10]等部分基質，對其他果蔬類、谷類及油料類作物無相關研究，方法中均采用基質標準曲線外標法進行定量測定，針對不同種類的樣品需要制備不同的空白基質液，存在工作量大、空白基質不易獲取等問題。本研究采用乙腈進行的提取，以液相色譜-質譜/質譜法結合同位素內標法，提高了工作效率，定量的準確度。本研究采用番茄、甘藍、葡萄、金針菇、大米、花生不同植物源性食品為研究對象，擴充了方法的應用范圍。該分析方法能滿足歐盟、美國、日本等國家的法規要求，助力農產品安全的出口，同時能滿足GB 2763-2021《食品中農藥最大殘留限量》標準中限量要求，對行政執法、國內抽檢風險監測提供技術方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄、甘藍、葡萄、金針菇、大米、花生 購自本地市場（浙江衢州），取代表性樣品約500 g，將其可食部分先切碎，經多功能食品攪拌機充分搗碎均勻，試樣均分為兩份，裝入潔凈容器，密封，并標明標記，于-18 ℃以下冷凍存放；乙腈、甲酸、甲醇 色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司；HLB 固相萃取柱（500 mg，6 mL）、0.22 μm 有機濾膜、無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水 由超純水儀制得；標準物質：三乙膦酸鋁、三乙膦酸鋁-D15純度>98.0%，德國Dr 公司。

PURELAB-Chorus 超純水儀 英國ELGA 公司；AB 4500 Q TRAP 液相色譜-質譜/質譜儀 美國AB SCIEX 科技有限公司；Multifuge X1R 離心機美國賽默飛世爾科技有限公司；T18 高速勻漿機、MS3 basic 漩渦振蕩器 德國IKA 公司；AL204 分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；N-EVAP-24 氮吹儀 美國Organomation 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取經搗碎均勻的試樣（番茄、甘藍、葡萄、金針菇）10 g（精確到0.01 g）于50 mL 離心管中，加入200 μL 10 μg/mL 同位素內標中間液，加入20 mL 乙腈，采用T18 高速勻漿機以9000 r/min均質1 min，在20 ℃下以8000 r/min 離心5 min，上清液轉移至50 mL 容量瓶中，殘渣中再加入15 mL乙腈，渦旋1 min，以8000 r/min 離心5 min，合并上清液至50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，待凈化。

稱取5 g 試樣（大米、花生，精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入200 μL 10 μg/mL 同位素內標中間液，加入5 mL 水，靜置30 min，加入20 mL 乙腈，用均質機以9000 r/min 均質1 min，以8000 r/min 離心5 min，上清液轉移至50 mL 容量瓶中，殘渣中再加入15 mL 乙腈，渦旋1 min，以8000 r/min 離心5 min，合并上清液至50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，待凈化。

HLB 固相萃取柱依次用5 mL 甲醇5 mL 50%甲醇溶液活化，取2 mL 待凈化液至已活化的HLB固相萃取柱中，接收上樣液，再用3 mL 乙腈洗脫，接收洗脫液，洗脫液于45 ℃下氮吹至近干，用水定容至2 mL，渦旋，過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

1.2.2 標準溶液的配制 儲備液：分別準確稱取準適量的標準物質和同位素內標標準物質，用10%乙腈溶液分別配制成濃度為1000 μg/mL 標準儲備液和同位素內標儲備液，于4 ℃避光保存。

中間液：分別準確移取適量的標準儲備液和同位素內標儲備液，用10%乙腈稀釋配制成濃度為10 μg/mL 的標準中間液和同位素內標中間液，于4 ℃避光保存。

標準工作溶液：準確移取標準中間液適量和同位素內標中間液適量，用10%乙腈溶液稀釋至20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0 ng/mL 的標準工作溶液。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱：AQ-C18柱，2.1 mm×150 mm（內徑），粒度3 μm，流動相：A 相為甲醇；B 相為0.15%甲酸溶液；柱溫30 ℃；流速：0.1～0.2 mL/min；進樣量20 μL；液相色譜流速及梯度洗脫見表1。

表1 液相色譜流速及梯度洗脫程序Table 1 HPLC flow rate and gradient elution procedure

1.2.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子化（ESI）負離子模式；電噴霧電壓：-4500 V；氣簾氣壓力：30 psi；離子源溫度：550 ℃；霧化氣壓力：55 psi；輔助氣壓力：55 psi；碰撞氣：Medium；多反應監測掃描（MRM）采集參數見表2。

表2 三乙膦酸鋁質譜參數Table 2 Spectrometric parameter for fosetyl-aluminium

1.3 數據處理

采用Analyst software 1.7（美國AB SCIEX 科技有限公司）軟件進行數據采集，MultiQuant 3.0.2 軟件進行數據處理和標準曲線建立。回收率及精密度采用Microsoft Office Excel 2007 軟件進行計算。回收率的計算均采用六個平行樣品去平均值計算。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的優化選擇

2.1.1 色譜柱的選擇 三乙膦酸鋁為強極性物質，需要采用能夠保留強極性物質的特殊色譜柱[13-14]，一般的C18反相液相色譜柱很難將其保留。查閱參考文獻，AQ C18色譜柱[15-16]和Hypercarb 色譜柱[17-19]能夠用于強極性物質的保留，試驗比較了2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18柱和Hypercarb 2.1 mm×100 mm 5 μm 色譜柱，Hypercarb 2.1 mm×100 mm 5 μm 色譜柱可以將三乙磷酸鋁進行保留，但是峰形拖尾。而2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18色譜柱是一款耐100%水相的色譜柱，該色譜柱填料有適度的表面覆蓋率和完全的封尾，對于高含水量流動相具有很好的兼容性，對有機酸等強極性化合物具有較強的保留能力，能夠將三乙磷酸鋁進行保留且峰形尖銳。圖1 為使用2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18色譜柱三乙膦酸鋁標準溶液色譜圖。因此選擇使用2.1 mm×100 mm 3 μm AQ C18柱作為分析柱。

圖1 三乙膦酸鋁標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of fosetyl-aluminium standard solution

2.1.2 流動相的選擇 參考文獻[20-22]，試驗對比了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.15%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.15%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液作為流動相的分離效果。以三乙膦酸鋁色譜峰的峰形、保留時間（Rt）、信噪比作為參考，對各流動相分離效果進行比較。

三乙膦酸鋁在溶液中解離形成乙基磷酸陰離子，使得三乙膦酸鋁在電噴霧離子源（ESI）離子化時形成[M-H]-的準分子離子峰。推測在流動相中加入一定濃度的甲酸會對乙基磷酸的響應有一定的抑制，但是同時添加甲酸會使乙基磷酸以分子的形式存在，使乙基磷酸的峰形更加對稱。由圖2 可以看出，流動相為甲醇-水時，三乙膦酸鋁色譜峰前伸，峰形不對稱。流動相為乙腈-水時，三乙膦酸鋁色譜峰異常的窄，色譜峰采集的點數比較少，導致色譜峰面積不穩定，重現性不好。流動相加入甲酸后，三乙膦酸鋁峰形變得尖銳對稱。因此選擇使用加入甲酸的溶液作為流動相。

圖2 不同流動相條件下三乙膦酸鋁色譜圖Fig.2 Chromatogram of fosetyl-aluminium in different mobile phase

實驗比較了甲醇-甲酸溶液、乙腈-甲酸溶液作為流動相，色譜峰的信噪比數據。由圖2 和表3 可以得出，當使用甲醇-0.15%甲酸溶液作為流動相時，三乙膦酸鋁色譜峰峰形尖銳對稱、分析時間合適、信噪比明顯較高。因此選擇甲醇-0.15%甲酸溶液作為流動相。

表3 三乙膦酸鋁標準溶液在不同流動相條件下信噪比數據Table 3 Signal to noise ratio of fosetyl-aluminium in different mobile phase

2.2 質譜參數的建立

三乙膦酸鋁在溶液中是以乙基磷酸陰離子的形式存在，可在負源條件下離子化，因此選用ESI-模式，乙基磷酸形成[M-H]-準分子離子峰，作為母離子。采用1 μg/mL 待測化合物的標準溶液，分別以流動注射的方式進行母離子全掃描，確定乙基磷酸的母離子質量數。確定好母離子后分別對噴霧電壓、蒸發溫度、毛細管溫度、氣簾氣流速、輔助氣流速、霧化氣流速行優化。優化好噴霧電壓、蒸發溫度、毛細管溫度、氣簾氣流速、輔助氣流速、霧化氣流速之后，分別對各目標化合物進行子離子及碰撞能量優化，從中選出子離子豐度最高的碰撞能量作為最佳碰撞能量，選擇兩個豐度比較高、穩定性好的子離子作為定性和定量離子，建立多反應監測（MRM）模式。三乙膦酸鋁詳細質譜參數如表2 所示。優化后的條件見“1.2.3”項下儀器條件。圖3 為三乙膦酸鋁及其同位素內標在優化后的液相色譜條件和質譜參數下采集的色譜圖。

圖3 三乙膦酸鋁及其同位素內標多反應監測色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatography of fosetyl-aluminium and fosetyl-aluminium-D15 standard solution

2.3 提取條件的選擇

三乙膦酸鋁為強極性化合物，在溶液中以乙基磷酸陰離子的形式存在，根據工作經驗及分析比較目前已發表的文獻選擇乙腈、1%乙酸乙腈、1/1 乙腈溶液、1%甲酸甲醇等溶液進行提取。實驗后發現乙腈的提取效率最好，單點校正回收率在90%以上；乙腈對于植物源食品表現了很好的滲透性和較高的提取效率，同時又對蠟類、脂肪等非極性成分的提取能力較弱。最終選擇以乙腈為提取溶液，既可以減少植物源食品中的色素，同時目標物的回收率滿足《GB/T 27404-2008 實驗室質量控制規范 食品理化檢測》、Method validation and quality control procedures for pesticides residue analysis in food and feed 相關規定[23-24]。

2.4 凈化條件的選擇

固相萃取、分散固相萃取等幾種方法是常用的凈化方法。用于三乙膦酸鋁的固相萃取柱有HLB、C18固相萃取柱。分散固相萃取劑有C18、PSA、GCB、Florisil 等。GCB 能有效去除樣品中的色素，對于深色的果蔬具有較好的凈化效果。Florisil 適用于從非極性的基液中萃取極性化合物，如胺類、羥基類及含雜原子或雜環的化合物，但是去除色素的能力較弱；PSA 與NH2柱作用效果類似，均可吸附提取液中的極性化合物（如碳水化合物、色素）、有機酸、酚類；C18柱對水相基質中的大部分有機物都能產生保留。實驗比較了HLB 小柱，150 mg 無水硫酸鎂、25 mg PSA、75 mg GCB 幾種凈化方法。經實驗比較，HLB 固相萃取柱可有效去除基質；150 mg 無水硫酸鎂、25 mg PSA、75 mg GCB 對于色素的去除效果較好，但是回收率偏低。因此，本研究選用HLB小柱進行凈化。

2.5 標準曲線和定量限

取按“1.2.2”項下制備好的標準工作液，以“1.2.3”項下的條件進行測定，以目標分析物的濃度與同位素內標濃度比值為橫坐標，以目標分析物的峰面積與同位素內標峰面積比值為縱坐標，進行回歸分析。三乙膦酸鋁殺菌劑在20.0～800.0 ng/mL 范圍內呈良好的線性關系。

該方法的定量限由空白樣品添加目標分析物進行回收試驗獲得，按“1.2.2”項下的條件進行處理，“1.2.3”項下的條件進行測定，以10 倍信噪比（S/N>10）為定量限，結果見表4。本實驗結果顯示，定量限均能滿足歐盟[2]、美國[3]、日本[4]和食品安全國家標準GB 2763-2021《食品中農藥最大殘留限量》[5]的限量值要求。

表4 三乙膦酸鋁的線性數據及定量限Table 4 Linear test results and LOQ of fosetyl-aluminium

2.6 回收率和精密度

測定本方法的回收率和精密度，實驗選用番茄、甘藍、葡萄、金針菇、大米、花生等作為樣品基質，添加不同量的三乙膦酸鋁殺菌劑標準溶液，每個添加水平均做6 個平行樣，加標水平及回收率、精密度結果見表5。

表5 回收率與精密度（n=6）Table 5 Mean recovery rate and precision (n=6)

2.7 方法基質效應

取空白番茄基質樣品，按“1.2.2”項下方法制得空白基質溶液，用空白基質溶液將混合標準中間液稀釋至20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0 ng/mL。另取混合標準中間液，用10%乙腈溶液稀釋至20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、800.0 ng/mL。將上述基質標準工作液和純溶劑標準工作液分別進樣，繪制標準曲線方程。使用上述兩條標準曲線分別對不同添加濃度的番茄基質加標樣品進行校正。回收率數據見表6，從表6 中可以得出使用純溶劑標準曲線進行校準，三乙膦酸鋁回收率低于50%。而使用基質標準曲線進行校正，三乙膦酸鋁回收率在87.4%～118.7%。說明樣品基質對三乙膦酸鋁有較明顯的基質抑制，降低基質效應的方法有通過更進一步的凈化、采用基質標準曲線、對上機溶液進行稀釋、采用同位素內標法等[25-26]。本研究采用同位素內標標準曲線進行定量，可以有效地降低基質效應的影響。表6 為純溶劑標準曲線和番茄基質標準曲線校準后回收率數據。

表6 純溶劑標準曲線和番茄基質標準曲線校準后回收率（n=6）Table 6 Recovery rate of pure solvent calibration and tomato matrix-matched calibration (n=6)

2.8 實際樣品測定

在市內農貿市場購買2 份番茄、1 份甘藍、2 份葡萄、1 份金針菇、1 份大米、1 份花生等實際樣品，利用本文建立的液相色譜-質譜/質譜法結合同位素內標進行測定，購買的樣品中均未檢出三乙膦酸鋁。

3 結論

本研究采用液相色譜-質譜/質譜法結合同位素內標法，針對番茄、甘藍、葡萄、金針菇、大米、花生等多種植物源性產品無需制備不同的空白基質液和配制基質標準曲線，提高了工作效率，解決了空白基質不易獲取等實際檢測問題。該方法采用乙腈進行提取，經HLB 固相萃取小柱凈化，采用AQ C18柱色譜柱分離，以甲醇和0.15%甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為0.1～0.2 mL/min。質譜采用多反應監測負離子掃描模式，同位素內標標準曲線法定量。三乙膦酸鋁在20.0～800.0 ng/mL 范圍內線性良好，決定系數為0.9904。三乙膦酸鋁定量限為100.0 μg/kg。對6 種植物源性產品進行3 個水平加標回收試驗，平均回收率范圍為69.6%～112.3%，相對標準偏差為1.0%～9.8%，能夠滿足歐盟、美國、日本以及我國等國內外法規中對該藥物的最大殘留限量要求。