一步凈化結合超高液相色譜串聯質譜同時測定雅魚中13 類54 種獸藥殘留

楊巧慧，劉中良，陳 亞，李霞雪，張 宇，曾 艷, ，張建雄，聞瑞琪，蘭 韜

（1.雅安市農產品質量監測檢驗中心，四川雅安 625000；2.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山 063000；3.北京科德諾思技術有限公司，北京 102299；4.中國標準化研究院，北京 100191）

“雅魚”（Schizothorax prenanti）又名丙穴魚，四川裂腹魚。屬于硬骨魚綱、鯉形目、鯉科，裂腹魚亞科，包括齊口裂腹魚、重口裂腹魚、等一大類裂腹魚[1]，主要分布在長江支干流中。近年來，由于大修水利工程、水體環境污染及過度捕撈等原因，野生“雅魚”數量急劇減少，“雅魚”已列入長江上游急需保護的特種魚類[2]。目前，人工養殖“雅魚”已在四川、云南、貴州等地廣泛分布，經濟效益顯著[3-5]。特別是四川雅安養殖的齊口和重口裂腹“雅魚”已被評為國家地理標志產品[6-7]。隨著人工養殖規模的擴大，在養殖過程中，常會出現敗血癥、爛鰓病、水霉病等魚病，因此使用磺胺類或其它抗生素、抗菌劑等進行預防和治療。但部分養殖者為提高經濟效益或缺乏對藥物危害的認知而不合理用藥，甚至非法濫用違禁藥物。這些藥物會通過食物鏈給人們帶來危害，因此，養殖雅魚的質量安全日益受到關注。目前，水產品中的獸藥殘留檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）[8]、液相色譜法（HPLC）[9]、液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）[10-11]等。其中，LC-MS/MS 具有高分辨率、高通量的優點，已被廣泛應用于獸藥殘留檢測中[12-13]。

水產品中獸藥殘留的檢測最具挑戰性的步驟是提取、凈化樣品[14]。在現有的前處理手段中，主要的凈化方式有固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）、液液萃取法（Liquid-liquid extraction，LLE）以及近年來被廣泛應用的快速、簡單、廉價、高效、安全的前處理方法（Quick easy cheap effective rugged and safe methodology，QuEChERS）[15]等。與前兩種凈化方式相比較，QuEChERS 法具有使用溶劑少、高樣品通量、操作簡單、成本低廉等優勢，已成為對獸藥殘留分析具有很強適用性的前處理方法[16-17]，該方法較傳統的SPE 前處理式更為簡單，但仍需多次離心、多次轉移液體。但同時也有研究發現，傳統QuEChERS 方法中提取劑內含有少量水，加入無機鹽后，通過離心分層為有機相和水相，然后再分散固相萃取進行樣品凈化，雖然這種方法提高了非極性獸藥的提取率，但鹽的分配卻會導致金屬與四環素等化合物的螯合作用，導致分析物損失[18-19]。Han 等[20]，Lehoyay 等[21]研究發現，QuEChERS 方法中水相的加入，導致部分強極性目標物保留在水相中，提取時不能完全轉移到有機相中，從而獲得較差的提取效率。

方靜等[22]研究表明四川野生“雅魚”中含有較高的蛋白質（含量高達16.72%），賴氨酸含量甚至高出雞蛋蛋白質評分模式的50%。但羅潤博等[23]、張潔等[24]研究發現，蛋白質不僅會干擾待測物的測定，還會引起儀器進樣口堵塞等問題，因此前處理過程中需將蛋白質進行沉淀。趙燕英等[25]的研究表明裂腹魚（雅魚）背部與腹部肌肉的肌內脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量極顯著高于其他魚類，這也增加了樣品的凈化難度。

本試驗在QuEChERS 法基礎上采用增強除脂、蛋白一步凈化的方式（Clean-up LPAS 法，lipid and protein adsorbent）這是一種改良的QuEChERS 方法，通過在吸附材料表面修飾，有針對性地吸附脂肪及蛋白，最大限度地減輕目標藥物的基質效應。同時方法還打破了傳統分散萃取、固相萃取的方式，提取時無需加入無機鹽，凈化只需一步即可，結合LCMS/MS 的檢測對“雅魚”中22 種磺胺類、10 種喹諾酮類、4 種酰胺醇類、4 種四環素類、3 種大環內酯類、2 種鎮靜類、2 種林可胺類、1 種β-內酰胺類、1 種皮質類激素、1 種抗球蟲類、1 種抗病毒類、1 種硝基咪唑類以及孔雀石綠及隱色孔雀石綠共計13 類，54 種獸藥殘留檢測分析進行研究，以期建立快速、準確、高效、經濟檢測“雅魚”中多種獸用藥物殘留的方法，為“雅魚”這一地理標志產品的健康養殖、用藥監管和民眾舌尖上的安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙酸銨（色譜純）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA 二鈉）（分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；KNORTH Clean-up LPAS 凈化柱 北京科德諾思技術有限公司；實驗用一級水 均為本實驗室Milli-Q 型超純水儀所制；所有標準物質（含內標物質）均為純度大于95%的固體標準物質，購自德國 Dr.Ehrenstorfer 公司，標準物質名稱、CAS 號如表1 所示；“雅魚”樣品 來自雅安市“雅魚”養殖基地，隨機采樣。

表1 目標化合物名稱及質譜采集條件Table 1 Name of each target compound and the MS acquisition conditions

1290-6470 型液相色譜串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）美國安捷倫公司；TGL-16 型高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；KN-026S 型強力多管漩渦混合儀 北京科德諾思技術有限公司；PD500 型高速分散勻漿機 英國 Prima Technology Group；GD16Plus 型高速研磨儀 深圳新銳科技有限公司；KH-500B 型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；Milli-Q 超純水機 美國 Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備與保存 “雅魚”樣品的抽取參考GB/T 30891-2014[26]水產品抽樣規范進行，制備和保存參考NY/T 3304-2018[27]中水產品類樣品制備與保存方法進行。將鮮活“雅魚”宰殺后去除頭、骨、內臟等組織，取其肌肉、魚皮組織切塊，通過組織搗碎機進行粉碎，混勻，分裝入密實袋中，貼好標簽，于-20 ℃條件下冷凍保存。

1.2.2 標準溶液配制 準確稱取各目標組分10.00 mg標準物質于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇充分溶解后定容至刻度，混勻后轉移至棕色標樣瓶中，配制成濃度為1 mg/mL 的單一標準儲備液，-20 ℃保存。其中，阿莫西林用乙腈:水（1:1）溶解和定容；喹諾酮類藥物先用適量0.03 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解，然后用甲醇稀釋定容至刻度。隨后將所有單標用甲醇稀釋配制成濃度為10 μg/mL 的混合標準溶液液，將該混合標準溶液用超純水或基質稀釋配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的系列標準工作曲線。

1.2.3 樣品前處理 稱取（2.00 ±0.05）g 樣品于50 mL具塞離心管中，準確加入0.2 μg/mL 混合內標溶液100 μL，渦旋混勻，避光靜置20 min。準確加入8 mL 0.2%甲酸的乙腈:水溶液（90:10），2000 r/min渦旋振搖2 min 后冰水浴超聲20 min 提取，于5000 r/min，4 ℃下離心5 min。取上清液2 mL 過LPAS 凈化柱，凈化柱無需活化、洗脫等步驟，只需在重力作用下通過凈化柱，一步收集濾液。準確移取0.4 mL 濾液，加入0.6 mL 稀釋液（5 mmol/L 的乙酸銨溶液）于同一離心管中，渦旋混勻，過0.22 μm×13 mm PTFE 有機濾膜至2 mL 進樣瓶，供LC-MS/MS 儀器分析。

1.2.4 LC-MS/MS 條件 色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18，50 mm×0.30 mm，1.8 μm；進樣量2.0 μL；流動相A 為甲醇，B 為水相（0.1%甲酸/5 mmol/L 乙酸銨溶液）；梯度洗脫程序：0～2 min，10%A，90%B；2～7 min，10%～80%A，90%～20%B；7～7.5 min，80%A，20%B；7.5～8 min，80%～95%A，20%～5%B；8～9 min，95%A，5%B；9～9.5 min，95%～10%A，5%～90%B；9.5～14 min，10%A，90%B；柱溫35 ℃；流速：0.3 mL/min；

質譜條件：電噴霧電離（ESI）源，正、負離子模式；干燥氣溫度，325 ℃；毛細管干燥氣流量（Gas Flow）：7 L/min；霧化器壓力（Nebulizer）：35 psi；鞘氣流量（Sheath Gas Flow）：12 L/min；鞘氣溫度（Sheath Gas Heater）：300 ℃；掃描方式為動態多反應監測（dMRM），內標法標準曲線定量。各目標化合物的質譜采集條件如表1 所示。

1.3 數據處理

采用Agilent LC-MS QQQ MassHunter 采集軟件進行數據采集，LC-MS QQQ MassHunter 定量軟件進行數據分析，包括標準曲線的建立、結果計算，處理數據用Excel 2019 處理后用Origin Pro 9.0 繪制圖形。本試驗前處理條件優化均采用三個平行樣品進行，外標法進行計算。前處理條件優化完成后，方法學驗證采用內標法進行計算。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優化

為保證每個參數都能順利出峰，且得到較為理想的峰型，試驗反復調整了流動相的組成及梯度洗脫程序等關鍵性液相參數。重點比較了甲醇和乙腈作為有機相與0.1%甲酸水、0.1%甲酸/5 mmol/L 乙酸銨混合溶液的不同組合、比例，同時，不斷調整流動相梯度，確保每個參數在無干擾的情況下在較短的時間內正常出峰。通過試驗，綜合各目標化合物的峰型、檢測靈敏度以及同分異構體分離度，最終確定本試驗最佳流動相為甲醇-0.1%甲酸/5 mmol/L 乙酸銨溶液，梯度洗脫條件如1.2.4 中所示。

在優化好的色譜條件下，用單一標準溶液（2 mg/L）對母離子進行全掃描（MS2Scan），同時設置幾組不同的裂解電壓（Frangment/V），對照每種目標物的相對分子量，找到母離子，選擇母離子響應最大值下的裂解電壓，作為后續最優裂解電壓。產物離子掃描（Product ion scan）時優化碰撞電壓（CE/V），找到特征子離子及最佳CE，保證除內標物外的每個參數均至少有兩個特征離子對。最后采用優化好的條件，進行動態多反應監測（dMRM）分析，內標法標準曲線定量。54 種獸藥組分的保留時間、MRM 離子對、監測模式及最佳CE 見表1，MRM 總離子圖見圖1、圖2。

圖1 正離子模式下MRM 總離子圖（10 μg/L）Fig.1 Total MRM ion diagram in positive ion mode (10 μg/L)

圖2 負離子模式下MRM 總離子圖（10 μg/L）Fig.2 Total MRM ion diagram in negative ion mode (10 μg/L)

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取方式 獸藥殘留檢測中常用的提取方式有超聲、研磨、均質、渦旋等。試驗比較了冰水浴超聲20 min、研磨（2000 r/min，120 s）、均質（8500 r/min，1 min）三種提取方式對目標物提取效果的影響，不同提取方式的回收率結果如圖3。由圖可知，這三種提取方式的提取效果基本一致，但超聲的提取效果相對較好，54 種目標物有46 種目標物的回收率在60%～120%之間，優于研磨提取的43 種、均質提取的41種，因此選擇超聲提取進行后續試驗。

圖3 不同提取方式對提取效果的影響Fig.3 Effect of different extraction methods on the extraction effect

在此基礎上，試驗還發現常溫超聲及冰水浴超聲對目標物提取效果的影響（試驗在7 月進行，常溫超聲后水溫約為40～50 ℃），回收率結果如圖4 所示，結果表明，常溫超聲后，有55.56%的目標物未檢出，有11.11%的目標物回收率低于60%；采用冰水浴超聲時，有85.19%的目標物的回收率在60%～120%之間。結果表明超聲溫度對目標物的提取影響較大，因此，在進行超聲提取時采取冰水浴進行超聲。

圖4 超聲溫度對提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperatures on the extraction effect

2.2.2 提取體積 通過對目標物進行添加回收試驗，比較4、6、8、10 mL 提取劑對提取效果的影響，回收結果如圖5A、5B 所示。結果表明，在提取液為4、6、8 mL 時，大部分目標物的回收率隨提取體積的增加而趨于100%。當提取體積為10 mL 時，目標物的回收率大于120%的個數開始增加，因此試驗選擇提取體積為8 mL。

圖5 不同提取體積回收率情況Fig.5 Recovery of different extraction volumes

2.2.3 緩沖鹽選擇 本試驗比較在提取液中加入EDTA 二鈉（1 g）與不加入對目標物的提取影響，結果發現僅對四環素類（四環素、土霉素、金霉素、強力霉素）藥物影響較大（圖6），與Zhao 等[28]的研究結果一致，這可能是土霉素、金霉素、強力霉素易與金屬離子形成螯合物的原因[29]。整體回收率在60%～120%之間，為節約成本，本試驗選擇不加入EDTA 二鈉，也不加入其它鹽類進行提取。

圖6 EDTA 二鈉對提取效果的影響Fig.6 Influence of EDTA-2Na on extraction effect

2.3 基質效應

基質效應（Matrix effects，ME）是由于基質中其他干擾物質的存在，導致被分析物的信號強度有不同程度的增強或減弱的現象[30]。當采用LC-MS/MS分析復雜的樣本時，在大氣壓電離（Atmospheric pressure ionization，API）界面下，干擾物質與目標分析物共洗脫時，它們可以改變源中的電離效率，可能導致電離抑制或電離增強，這會直接影響定量的準確性，除非基質效應被最小化或補償[31-32]。

本試驗用空白基質溶液配制的標準曲線斜率（k1）與試劑標準曲線斜率（k2）進行比較（ME=k1/k2），ME>1 為基質增強，ME<1 為基質減弱，ME=1 為沒有基質效應，ME 在0.8～1.2 之間，為可接受范圍[33]。試驗比較了54 種獸藥在“雅魚”中的基質效應，結果如表2 所示。

表2 54 種獸藥的方法驗證結果及基質效應、限量值Table 2 Method validation results and matrix effects and limit values of the 54 veterinary drugs

由表2 可知，有26 種獸藥ME<0.8，3 種獸藥ME>1.2，25 種獸藥ME 在0.8～1.2 之間，表現為可接受。由此可見，“雅魚”中的脂肪、蛋白質、氨基酸等物質對試驗中53.7%的獸藥存在基質干擾。因此，為對基質效應進行有效補償，本文采用樣本空白基質結合內標物的方式進行校正，通過加標回收試驗驗證，結果可靠。

2.4 方法驗證

2.4.1 方法檢出限、方法定量限及線性范圍 各獸藥及其代謝物的驗證參數見表2。以目標化合物的響應值為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。結果顯示，54 種獸藥在0.1～50 μg/L 范圍內線性良好，決定系數（R2）均在0.992 以上。在空白基質中添加不同水平的目標化合物（5、10、20、50 μg/kg）。方法檢出限（LOD）和方法定量限（LOQ）根據不同添加水平的標準偏差（SD）與斜率（k）的比值計算，LOD=3.3×（SD/k），LOQ=10×（SD/k）[34]。

54 種獸藥在“雅魚”中的LOD 為0.03～2.5 μg/kg，LOQ 為0.1～8.3 μg/kg，基本優于現有國標中LOD、LOQ[35-37]。各獸藥在中國[38-39]、食品法典委員會（CAC）[40]、歐盟（EU）[41]的限量值（MRL）見表2，其中有MRL 值的獸藥在本試驗中的LOD 值均低于其MRL 值，表明該方法的方法檢出限較低、靈敏度較高，能滿足現有檢測的需求。

2.4.2 準確度及精密度驗證 通過對空白樣品中加入低、中、高三個水平，其中，對LOQ≤5 μg/kg 的目標物添加量為5、10、50 μg/kg，對LOQ>5 μg/kg 的目標物添加量為10、20、50 μg/kg，每個水平三平行樣做加標回收試驗，計算平均回收率及相對標準偏差（RSD），驗證本方法的準確度和精密度。結果表明（表3），在低、中、高三個加標水平下54 種獸藥的回收率在70.45%～118.10%之間，RSD 在0.01%～9.85%之間，符合方法驗證對準確度和精密度的要求[33,42]，能滿足“雅魚”中54 種獸藥殘留要求。

表3 54 種獸藥不同添加量的回收率及精密度Table 3 Recovery rate and precision of different added amounts of 54 veterinary drugs

2.5 實際樣品檢測

應用試驗建立的方法對2022 年實驗室隨機抽取養殖基地50 份雅魚樣品進行檢測。結果顯示，有7 份樣品有藥物檢出，其中，恩諾沙星檢出2 次（檢出值分別為0.98、0.58 μg/kg），達氟沙星各檢出2 次（檢出值分別為1.52、1.32 μg/kg），磺胺甲噁唑檢出4 次（檢出值分別為0.54、0.63、0.47、0.88 μg/kg），共計8 次。以上檢出藥物均低于該方法定量限，遠遠低于表2 中限量值（均為100 μg/kg），其它藥物均無檢出，所有樣品均為合格樣品。

3 結論

試驗對檢測儀器條件和前處方法檢出限理條件（提取方式、提取劑體積、緩沖鹽）進行了優化比較，在傳統QuEChERS 法的基礎上建立了利用一步凈化結合液相色譜串聯質譜儀，同時對養殖“雅魚”中13 類54 種獸藥殘留進行檢測的高通量檢測方法。本方法與傳統QuEChERS 法相比，提取劑內不含水，因此，減少了鹽析、液體轉移、離心等步驟，凈化后液體較QuEChERS 凈化液清澈，操作更為簡單、快捷。利用空白基質結合內標定量的方式，使結果更穩定、可靠。利用“雅魚”基質進行了低、中、高三水平的加標回收，對準確度和精密度、線性范圍、及基質效應等進行了方法驗證，結果均符合實驗室質量控制規范的要求。利用該方法對50 份養殖“雅魚”樣本進行檢測，共7 份樣品，8 樣次定性檢出。由此可見，“雅魚”在養殖過程中確實有使用喹諾酮類和磺胺類藥物對其進行魚病治療，但均未超出限量值，總體質量安全，但后期應加強監測，加強獸藥使用指導和宣傳。

綜上所述，本研究建立了一種可以快速、準確、高通量且經濟檢測“雅魚”中多種類藥物殘留的快速定性定量方法，為后續加大對“雅魚”養殖用藥的監管和藥物殘留的檢測，持續保證“雅魚”的質量安全提供了有效的技術支持。