磁固相萃取結合超高效液相色譜串聯質譜法檢測綠茶中19 種有機磷農藥殘留

郭春麗，余曉峰，韓 芳，賈學穎，雷雨甜，劉會佳，吳 瓊，林 童，伊雄海，宋 偉,

（1.合肥海關技術中心，食品安全分析與檢測安徽省重點實驗室，安徽合肥 230022；2.西寧海關技術中心，青海西寧 810000；3.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200003）

農藥在農業生產中常用于防治蟲害，提高農作物產量，延長產品保質期等[1-2]。有機磷類農藥是一類含有磷原子的有機酯類化合物的總稱，主要用于防治植物病、蟲、草害，具有高效、廣譜、易降解特性，因而在茶樹的種植中被廣泛使用[3-4]。朱鳳等[3]研究表明因食品中農藥殘留引發中毒的農藥中有機磷農藥占比最大，有機磷進入機體會使組織中的乙酰膽堿積累，導致中樞神經系統及膽堿能神經功能異常[5-6]，甚至會誘導細胞癌變[7-8]。GB 2763-2021 規定茶葉中大多數有機磷農藥的最大殘留限量在0.05 mg/kg[9]，甚至規定部分高毒性有機磷農藥被直接禁用[9-10]。茶葉中有機磷農藥殘留問題不可輕視，建立高效可靠的前處理方法對保障茶葉質量安全意義重大。

目前，檢測有機磷常用的的前處理方法有固相萃取（SPE）[11-12]、固相微萃取（SPME）[13]、液液萃取（LLE）[14-15]、液液微萃取（LLME）[16]、QuEChERS 技術[17]等。但上述方法存在前處理步驟繁瑣、耗時長、有機溶劑用量大等不足。有機磷在基質復雜的茶葉中僅痕量存在，凈化效果不理想會嚴重干擾目標物的測定[18]。因此，需要建立一種簡單高效，快速且經濟安全的前處理方法來富集茶葉樣品中的有機磷。

磁固相萃取（MSPE）是將含有目標分析物的待測液中加入具有磁性的吸附劑，經過萃取，將目標物吸附，最后用外加磁場將吸附了目標物的吸附劑從待測溶液中分離的技術。該技術是一種新型前處理技術，具有操作簡便、快捷、低成本、易操控等特點，目前被廣泛研究[19-21]。石墨烯（G）具有共軛體系，比表面積大，化學穩定性好，可與含有苯環結構的有機分子產生強的π-π鍵堆積作用[22-24]，從而選擇性吸附目標物，目前已廣泛用于污染物處理中[25-27]。而磁性石墨烯在復雜的食品樣品基體以及極性污染物分析中的應用還較少。

本實驗結合有機磷農藥結構特點及實驗室現有農藥標品情況，選取19 種有機磷農藥為研究對象進行分析考察。將石墨烯與磁性納米粒子相結合，用化學共沉淀法合成磁性石墨烯，并將磁固相萃取與超高效液相色譜串聯質譜結合，建立同時檢測綠茶中19 種有機磷農藥殘留的方法。實驗考察了吸附劑用量、萃取時間、樣品溶液pH、洗脫劑條件和氯化鈉用量對磁固相萃取效率的影響。本方法能避免傳統固相萃取方法的時間耗損，檢測快速準確，易操控，材料可重復利用，只需要少量的有機溶劑，經濟，安全，該技術在復雜樣品基質以及極性污染物的富集分離中有很好的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 購自超市，為4 月份采摘后加工生產，常溫儲存；石墨 中國Alfa 化學有限公司；氨水（25%～28%）、鹽酸（19%）、甲酸、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯 色譜純，美國Tedia 公司；硫酸鐵銨（NH4Fe(SO4)2·12H2O）、硫酸亞鐵銨（(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O）、氯化鐵（FeCl3·6H2O）、氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、乙酸鈉、乙二醇 分析純，中國國藥集團；實驗用水為超純水 美國Millipore 公司；甲胺磷、樂果、敵百蟲、敵敵畏、氧樂果、辛硫磷、噠螨靈、內吸磷、毒死蜱、苯線磷、硫環磷、硫線磷、氯唑磷、殺撲磷、速滅磷、甲拌磷、毒蟲畏、乙酰甲胺磷、水胺硫磷標準品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

Agilent 1290-6460 超高壓液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀 美國Agilent 公司；JSM-6480 LV 掃描電鏡 日本電子公司；N-EVAP112 氮吹儀 美國Organomation 公司；KQ2200E 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Buchi-R215 旋轉蒸發儀 北京陸德恒泰商貿有限公司；DF 101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海析牛萊伯儀器有限公司；DZF6020真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磁性石墨烯的制備 按本實驗室[28]和參考文獻[29-30]方法制備，采用化學共沉淀法。分別取(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O（2.04 g）、NH4Fe(SO4)2·12H2O（3.01 g）和石墨烯（0.6 g）溶于200 mL 超純水中，在氮氣保護下混勻，以100 W，40 kHz 超聲20 min，在此過程逐滴加入8 moL/L 氨水，保持pH11～12，緩慢將溫度升至50 ℃，在此溫度下1300 r/min 攪拌反應1 h。將沉淀物由磁鐵收集并用去離子水重復沖洗至中性，在真空下干燥得到黑褐色粉末即為磁性石墨烯（Fe3O4@G）。Fe3O4納米粒子參照Zhao 等[31]方法制備：稱取6.8 g FeCl3·6H2O，18 g 乙酸鈉，快速加入250 mL 乙二醇，保持1300 r/min 攪拌反應30 min，充分溶解后將其全部倒入反應釜200 ℃下反應8 h，產物經磁分離后，依次用乙醇、去離子水洗滌3 次，烘干備用。

1.2.2 標準溶液配制 農藥標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）標準品于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃避光保存。

1.2.3 綠茶樣品前處理 提取：參照GB 23200.121-2021[32]的茶葉提取條件并加以優化，將綠茶樣品先浸濕后再用乙腈提取有機磷農藥。稱取1 g（精確至0.01 g）綠茶樣品，加入15 mL 水浸濕后渦勻，再加入10 mL 乙腈，渦勻后，以100 W，40 kHz 超聲提取10 min，加入4 g 氯化鈉，均質后，以8000 r/min 離心5 min。吸取全部上清液于雞心瓶中，殘渣用10 mL乙腈重復提取一次，合并上清液，于旋轉蒸發儀上蒸干，用10 mL 乙腈-水（1:9，v/v）復溶。取1.0 mL 上述復溶液于10 mL 容量瓶中，用乙腈-水（1:9，v/v）定容至刻度，備用。

凈化：磁固相萃取部分參照劉麗文等[33]實驗方法并加以改進。取上述全部溶液加入20 mg Fe3O4@G 吸附劑，渦勻后振蕩萃取20 min。將磁鐵放試管底部聚集Fe3O4@G 后棄去上清液，加入1 mL 丙酮溶液，渦旋解吸1 min，磁分離后，取全部上清液于另一試管中。重復上述洗脫操作2 次，合并上述解吸液，氮氣吹干，隨后用200 μL 乙腈-水（1:9，v/v）溶解，供UHPLC-MS/MS 分析。

1.2.4 色譜-質譜條件 色譜-質譜條件參照GB 23200.121-2021[32]的測試條件并加以優化。

1.2.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse Proshell 120 C18柱（1.9 μm，100 mm×2.1 mm），流動相A 為2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸水溶液，B 為2 mmol/L 甲酸銨-0.01%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序見表1。柱溫：40 ℃；進樣量10 μL。

表1 19 種有機磷農藥梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for 19 organophosphorus pesticides

1.2.4.2 質譜條件 19 種有機磷農藥均為ESI+模式；采集方式為多反應監測MRM；干燥器氣溫度：300 ℃，流速：10 L/min；稍流氣溫度：300 ℃，流速：11 L/min；霧化氣壓力：0.28 MPa；電噴霧電壓：4.0 kV；毛細管電壓：3.0 kV；詳細優化參數見表2。

表2 19 種有機磷農藥多反應監測模式參數Table 2 Multiple-reaction monitoring (MRM) parameters for 19 organophosphorus pesticides

1.2.5 材料形貌表征 石墨烯磁化前后的形貌，采用SEM 將材料在100000 倍尺度下的形貌進行觀察。

1.2.6 萃取性能測試條件 在10 mL 空白樣品提取液中加入50 μL 10 μg/mL 的19 種有機磷農藥混合標準溶液，使其濃度均為50 μg/L，以回收率為指標，考察Fe3O4@G、G 和Fe3O4對農藥的萃取性能，每個實驗重復3 次。回收率按式（1）計算。

式中：R 表示萃取回收率，%；Cf表示標曲測得樣液中目標物的濃度，μg/L；Vf表示樣液最終定容體積，mL；Cq表示加標濃度，μg/L；Vq表示加標體積，mL；F 表示轉換系數。

1.2.7 固相萃取優化條件 茶葉中有機磷的提取方法對測定結果至關重要，為達到最佳萃取效果，以10 mL 空白樣品提取液中固定每種農藥濃度均為50 μg/L，以萃取效率為指標，依據報道[33-34]分別對不同吸附劑用量、萃取時間、溶液pH、解吸溶劑類型和氯化鈉用量進行優化，每個實驗重復3 次。

吸附劑用量是影響萃取效率的重要參數，吸附劑過少會造成目標物不能被完全吸附，過多會浪費吸附材料。因此實驗選取不同質量5.0、10.0、15.0、20.0、40.0、60.0 mg 的Fe3O4@G 材料進行考察。分別在10 mL 空白樣品提取液中加入不同量的吸附劑，渦勻振蕩吸附20 min 后，進行磁分離，HPLCMS/MS 分析上清液。萃取效率按式（2）計算。

式中：R 表示萃取效率，%；C0表示初始時樣液中目標物的濃度，μg/L；Cv表示萃取平衡時標曲測得樣液中目標物的濃度，μg/L。

充足的萃取時間是形成動態平衡的關鍵，磁固相萃取是通過質量傳遞使目標物在溶液與萃取材料之間形成動態平衡的過程。實驗分別考察5、10、15、20、40、60 min 對萃取效率的影響。準確稱取40 mg 吸附劑分別加入到10 mL 空白樣品提取液中，振蕩吸附不同時間后，進行磁分離，HPLCMS/MS 分析上清液。萃取效率按式（2）計算。

樣品溶液的pH 影響吸附劑表面的電荷種類、密度及目標物存在狀態有著重要的影響，本實驗采用甲酸及氨水溶液調節空白樣品溶液pH，考察溶液的pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 對有機磷農藥萃取回收率的影響。分別準確稱取40 mg 吸附劑加入到10 mL 空白樣品提取液中，振蕩吸附20 min后，進行磁分離，HPLC-MS/MS 分析上清液。萃取效率按式（2）計算。

本實驗分別考察四種洗脫有機溶劑，即甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯對19 種有機磷農藥的洗脫效果。10 mL 空白樣品提取液中目標物（固定每種有機磷濃度為50 μg/L）經振蕩吸附，磁分離后，棄去上清液，將磁性材料用不同試劑渦旋洗脫，收集全部洗脫液，氮氣吹干后，200 μL 乙腈-水（1:9，v/v）溶解，供UHPLC-MS/MS 分析。萃取效率按式（3）計算。

式中：R 表示萃取效率，%；C0表示初始時樣液中目標物的濃度，μg/L；V0表示初始時樣液的體積，mL；C1表示解吸后標曲測得樣液中目標物的濃度，μg/L；V1表示解吸后樣液最終定容體積，mL。

在樣品前處理中，氯化鈉起到鹽析作用，使有機相與水相分離，操江飛等[35]研究表明適量的氯化鈉更有利于提高蔬果中有機磷回收率。本實驗稱取1 g 空白綠茶樣品，進行加標回收實驗，有機磷農藥加標水平為100.0 μg/kg，其余前處理步驟按照1.2.3 進行，以回收率為指標，考察氯化鈉用量為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g 時對鹽析的影響。回收率按式（1）計算。

1.3 方法學考察

本實驗用乙腈-水（1:9，v/v）溶液配制5～500 μg/L濃度范圍的混合有機磷標準溶液，依據1.2.4 色譜-質譜條件進行檢測，取不含目標物的空白綠茶樣品，按照1.2.3 對樣品前處理，采用低中高三個水平進行加標實驗，加標水平分別為20.0、40.0、200.0 μg/kg（相當于10、20、100 μg/L），每個水平重復6 次，

1.4 基質效應評價

實際綠茶樣品基質復雜，可能含有大量大分子干擾目標物的測定，因此需要評價該實驗的基質效應。基質效應（ME）為空白提取液中目標物的峰面積與標準純樣液中目標物峰面積之比[36]。

1.5 實際綠茶樣品分析

為驗證本研究建立的方法在實際應用中的可靠性，本方法分析20 份綠茶樣品，按照GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[9]與GB 23200.121-2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331 種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》中茶葉限量的相關規定[32]進行分析。

1.6 數據處理

Agilent MassHunter Workstation Date Acguisition 用于數據采集，Agilent MassHunter Quantitative Analysis 用于數據分析。用WPS Office 計算數據平均值、標準偏差、回收率及相對標準偏差（RSD），使用Origin 85 制圖。

2 結果與分析

2.1 石墨烯和磁性石墨烯的表征

石墨烯磁化前后的形貌如石墨烯圖（1a）以及Fe3O4@G 圖（1b）所示。如圖1a 所示，石墨烯具有褶皺的薄紗狀片層結構，表面暴露大量的活性位點，為農藥吸附提供了大量的空間。從圖1b 可以看出，Fe3O4修飾后的石墨烯的基本結構并沒有發生改變，仍以薄紗片狀存在。石墨烯表面分布大量粒徑約為5～50 nm 的Fe3O4納米粒子，部分納米粒子稍微有些聚合是由于負載程度已接近飽和的緣故。將Fe3O4納米粒子修飾在石墨烯上，可能帶來以下積極作用：a.Fe3O4是一種常用的MSPE 吸附劑，促進吸附行為[28]。b.Fe3O4提供空間位阻，可有效阻止石墨烯堆疊團聚現象，提高石墨烯在水中的分散性[25-27]。c.Fe3O4被石墨烯夾層包圍，可有效減少Fe3O4粒子間團聚和被環境溶液腐蝕的可能，有利于維持其磁性。

圖1 石墨烯（a）和磁性石墨烯（b）的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope (SEM) images of graphene (a) and magnetic graphene (b)

2.2 材料的農藥萃取性能測試

圖2 結果表明，Fe3O4@G、G 和Fe3O4對19 種有機磷農藥的萃取回收率對分別為89.3%～99.9%、92.3%～105.7%和1.2%～16.5%，說明Fe3O4納米粒子對19 種有機磷農藥吸附作用較弱，石墨烯與19 種有機磷農藥之間的吸附作用是萃取過程中的主要作用力。Fe3O4@G 對19 種有機磷農藥在萃取過程中可能產生以下若干相互作用力[28]。首先，石墨烯中每個碳原子都含有一個未成鍵的π電子，可與含有苯環的目標農藥形成π-π共軛體系。其次，上述農藥結構中可能含有供電子能力的O、N 等，易與Fe3O4@G 結構中大π鍵形成共用電子對，促進其吸附形成。再次，Fe3O4@G 結構中含有未被還原的羧基基團，也可與農藥中電負性強的原子形成氫鍵作用力。最后，Fe3O4負載在石墨烯表面，可使Fe3O4@G表面帶有羥基基團，可能與目標農藥化合物中極性基團形成分子間氫鍵作用力。

圖2 Fe3O4@G、G 和Fe3O4 納米離子對19 種有機磷農藥回收率的影響Fig.2 Effect of Fe3O4@G,G and Fe3O4 nanoparticles on the recoveries of the 19 organophosphorus pesticides

為考察不同批次Fe3O4@G 材料吸附性能，實驗室對合成3 批次材料進行對比，針對19 種有機磷種農藥的萃取回收率均在80%～95%之間，每種農藥的相對標準偏差均低于20%，重復性良好。

2.3 磁性固相萃取條件的優化

2.3.1 吸附劑用量對吸附效果的影響 如圖3 所示，當Fe3O4@G 用量在5.0～40.0 mg 條件下，前期萃取效率隨吸附劑用量的增加而快速升高；當繼續增加吸附劑用量，萃取效率基本不變。原因是吸附劑的投加量增加了可利用活性位數量，從而促進了有機磷在Fe3O4@G 上的吸附行為。其中，噠螨靈、毒死蜱、苯線磷、硫環磷和硫線磷最少用量為20.0 mg，其余最少用量均為40.0 mg。為了保證吸附劑的最佳吸附利用率，實驗最終確定Fe3O4@G 用量為40.0 mg。

圖3 Fe3O4@G 用量對19 種有機磷農藥萃取效率的影響Fig.3 Effect of Fe3O4@G amount on extraction efficiency of 19 organophosphorus pesticides

2.3.2 萃取時間對吸附效果的影響 如圖4 知，在前10 min 內，有機磷的萃取效率隨著時間延長而快速增加；10 min 到20 min，萃取效率隨時間緩慢增加；在20 min 時，19 種有機磷的萃取率達到最大，繼續延長吸附時間萃取效率沒有明顯變化。此現象的原因是在反應初期Fe3O4@G 表面有大量未被占據的活性位點，隨著反應的進行，剩余可利用的活性位點數量逐漸減少，并且在固液兩相中有機磷含量梯度的下降阻礙了Fe3O4@G 的進一步吸附，也影響了有機磷向Fe3O4@G 表面的擴散。因此，將萃取時間定為20 min。

圖4 萃取時間對19 種有機磷農藥萃取效率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency of 19 organophosphorus pesticides

2.3.3 樣品溶液pH 的影響 本實驗選擇溶液pH在2～12 范圍對萃取效率的影響（見圖5）。其中，溶液的pH 在6～9 范圍，敵敵畏萃取效率最佳；溶液的pH 在5～9 范圍，甲胺磷、硫線磷和乙酰甲胺磷萃取效率最佳；溶液的pH 在3～10 范圍，氧樂果、內吸磷和毒死蜱萃取效率最佳，其余種類的農藥溶液的pH在2～12 范圍萃取效率均無影響。綜上，同時檢測綠茶中19 種有機磷農藥殘留時溶液的pH 在6～9 范圍內最佳，綠茶樣品經乙腈提取后采用乙腈-水（1:9，v/v）復溶，pH 在7.0 左右，利于19 種有機磷農藥的同時萃取，此pH 下萃取效率為92.0%～99.8%。與此同時，考慮到實驗操作的簡便性，本實驗無須調節溶液的pH。

圖5 溶液的pH 對19 種有機磷農藥萃取效率的影響Fig.5 Effect of pH on extraction efficiency of 19 organophosphorus pesticides

2.3.4 洗脫劑的選擇 從圖6 可以看出，丙酮和乙腈對19 種目標農藥的洗脫效果更佳，乙酸乙酯次之，甲醇相對較差。原因是丙酮沸點低，有機磷的沸點相對較高，萃取吹干過程中沸點低的物質能很好保護沸點高的物質[37]。同時，丙酮可使有機磷更好的溶解，選擇丙酮不僅節約氮吹時間，且使有機磷在萃取吹干的過程中損失率降到最低[38]，因此選取丙酮作為洗脫劑。

圖6 洗脫劑對19 種有機磷農藥萃取效率的影響Fig.6 Effect of desorption solvent type on extraction efficiency of 19 organophosphorus pesticides

為將目標分析物從復合物中完全解吸出來，本文優化了洗脫溶劑量，選取丙酮體積分別為1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL。結果表明當用3.0 mL（1.0 mL×3）丙酮，洗脫復合物時，分析物能被完全解吸。因此選擇3.0 mL 丙酮分3 次解吸每次1.0 mL。

2.4 氯化鈉用量的選擇

結果表明，氯化鈉用量0.5～1.0 g 時，氯化鈉全部溶解于水中，水相與乙腈相不分離；當氯化鈉用量1.0～4.0 g 時，氯化鈉全部溶解于水中，水相與乙腈相開始分層，并且隨著氯化鈉用量的增加，上層分離出的乙腈相增多。由圖7 知，當氯化鈉用量1.0 g 時，有機磷回收率只有12.3%～35.6%，當氯化鈉用量4.0 g時，有機磷回收率在85.8%～95.3%范圍；氯化鈉用量為4.0～5.0 g 時，氯化鈉沒有全部溶解，有機磷的回收率基本維持不變。由于氯化鈉用量4.0 g 時，整體回收率均優于氯化鈉用量1.0 g 時的回收率，故選擇氯化鈉用量為4.0 g。

圖7 氯化鈉用量對19 種有機磷農藥回收率的影響Fig.7 Effect of sodium chloride dosage on recovery rade of 19 organophosphorus pesticides

2.5 Fe3O4@G 的重復使用性

為了研究Fe3O4@G 吸附劑的重復使用性，按1.2.6 萃取性能測試條件將解吸后的吸附劑重復于有機磷農藥的磁性固相萃取實驗中，結果表明吸附劑在重復使用15 次之后，Fe3O4@G 對19 種目標農藥依然保持良好的萃取能力。

2.6 方法學考察

19 種目標農藥線性相關系數均大于0.999。19種目標農藥的LOD（S/N=3）為5.0～6.0 μg/kg，LOQ（S/N=10）在15.0～20.0 μg/kg 之間，平均回收率在61.2%～94.9%之間，相對標準偏差RSD（n=6）在2.6%～10.2%之間。由此表明Fe3O4@G 用于綠茶中19 中農藥精密度良好，準確度高。具體見表3。

表3 綠茶中19 種農藥的線性范圍、平均回收率與精密度Table 3 Linear range,average recoveries and relative standard deviation (RSD) of 19 target pesticides in green tea

2.7 基質效應評價

基質效應比較結果如表3 所示，基質中添加三個水平，每個水平重復三次。結果表明，19 種目標農藥在空白綠茶基質中的ME 為0.81～0.99 之間，為弱基質抑制效應，因此，本實驗可選用溶劑標準溶液外標法進行定量分析。

2.8 實際綠茶樣品分析

經分析，在1 份樣品中檢測到辛硫磷殘留，含量為0.04 mg/kg；在1 份樣品中檢測到噠螨靈殘留，含量為0.05 mg/kg；在1 份樣品中檢測到氧樂果殘留，含量為0.025 mg/kg；在1 份樣品中檢測到毒蟲畏殘留，含量為0.02 mg/kg；在1 份樣品中檢測到毒死蜱殘留，含量為0.038 mg/kg。其他樣品均未檢測到上述19 種農藥殘留。

3 結論

本文采用化學共沉淀法合成磁性石墨烯Fe3O4@G 并成功將其應用于分離富集綠茶中19 種有機磷農藥。本實驗最佳前處理條件為：復合物用量為40 mg；萃取時間為20 min；氯化鈉用量為4 g；洗脫劑為丙酮，洗脫劑用量為3 mL。在最優條件下，方法線性相關系數均大于0.999，19 種有機磷農藥的LOD 為5.0～6.0 μg/kg，LOQ 為15.0～20.0 μg/kg，連續6 次重復操作所得相對標準偏差RSD 在2.6%～10.2%之間，在實際樣品中有較高的回收率。該方法前處理簡單，有機溶劑用量少，適用范圍廣，材料可重復利用。該技術在復雜樣品基質以及極性污染物的富集分離中有很好的參考價值。磁固相萃取是一種新型的樣品前處理技術，在本實驗中尚存在難以解決的問題：a.需要研究更簡便的Fe3O4@G 合成技術；b.盡可能降低本實驗的檢出限以提高檢測準確性與靈敏度。