Captiva EMR-Lipid 技術結合UPLC-MS/MS快速測定牛羊產品中甲苯咪唑及其代謝物的殘留量

葉佳明 ，鐘世歡，葉磊海，吳余欣，王 京

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州 310009）

甲苯咪唑（Mebendazole，MBZ）是一種廣譜的抗蟲藥物，對于線蟲具有較強的驅殺作用。自1971 年問世以來，曾廣泛用于驅除人和動物腸道中的寄生蟲，水產養殖中蠕蟲的治療。甲苯咪唑對于牛羊絳蟲病具有較好療效，在動物飼養過程中曾廣泛使用[1]，其在動物體內的代謝物主要有羥基甲苯咪唑（Hydroxy-mebendazole，MBZ-OH）和氨基甲苯咪唑（Aminomebendazole，MBZ-NH2）。由于甲苯咪唑類藥物致畸作用和胚胎毒性[2-3]。其殘留問題也日益引起人們的關注。日本肯定列表中牛羊產品中甲苯咪唑的最大殘留量為10 μg/kg，歐盟也規定了甲苯咪唑及其代謝物在牛羊肌肉中的最高殘留限量為60 μg/kg，我國《GB 31650-2019 動物性食品中獸藥殘留限量》中規定甲苯咪唑及其代謝物在馬羊肌肉和內臟的最高殘留限量為60～400 μg/kg。

目前對于甲苯咪唑類藥物檢測方法主要集中在高效液相色譜法（HPLC 法）[4-5]和超液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS 法）[6]。高效液相色譜法靈敏度相對較低且抗干擾能力差，大多需要多步凈化處理、方法繁瑣，假陽性高，不利于復雜基質的分析。相比之下液相色譜質譜法具有高效分離和準確定性、定量的優點，已經成為甲苯咪唑類藥物殘留檢測的主要分析方法。目前針對水產品[7]、畜禽產品[8]、乳制品[9]中甲苯咪唑殘留物的測定已有文獻報道，前處理都需要氮吹濃縮，固相萃取凈化、正己烷去脂等多步驟富集凈化手段，耗時費力。通過式凈化方式操作簡便[10]，提取溶液經小柱凈化后，大部分雜質干擾物截留在小柱上，濾液可直接進樣分析，作為一種新型的凈化處理技術具有較好的應用前景[11-12]。本文基于增強型脂質去除凈化技術，以通過式固相萃取方式，結合液相色譜串聯質譜，建立了一種牛羊產品中甲苯咪唑及其代謝物的測定方法。該方法操作簡便、定量準確，可實現牛羊產品中甲苯咪唑及其代謝物的快速檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、甲苯咪唑-D3、羥基甲苯咪唑-D3純度>98%，北京壇墨質檢科技有限公司；氨水、二甲基亞砜、氯化鈉、無水硫酸鎂 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇色譜純，美國Fisher 公司；去離子水（18.2 MΩ·cm）由 Mil-lipore 純水機制得；牛肉（10 批次）、羊肉（10 批次）、牛肚（5 批次）和羊雜（5 批次）購于杭州臨安青山湖農貿市場。

LC-20AD 液相色譜儀 日本島津公司；AB4500液質聯用儀 美國AB SCIEX 公司；安捷倫RRHDSB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Captiva EMR-Lipid 固相萃取小柱（300 mg，3 mL）安捷倫公司；Oasis HLB 固相萃取小柱（60 mg，3 mL）、Oasis MCX 固相萃取小柱（60 mg，3 mL）Waters公司；QuEChERS 粉（900 mg MgSO4、150 mg PSA）

蘇州納普公司；Multi Reax 振蕩器 德國Heidolph 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 稱取5 g 牛羊產品于50 mL 離心管中，加入100 μL 混合內標溶液，加入20 mL 0.2%氨化乙腈溶液，1.0 g 氯化鈉、0.5 g 無水硫酸鎂、渦旋1 min 后，2000 r/min 振蕩提取10 min，4000 r/min 冷凍離心3 min，取3 mL 上清液經Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱凈化后，過0.22 μm 有機濾膜后，待測。

1.2.2 標準溶液配制 標準儲備液的配制：分別精密稱取甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、甲苯咪唑-D3、羥基甲苯咪唑-D3各10 mg，先用5 mL二甲基亞砜溶解，加甲醇稀釋定容至100 mL 刻度，搖勻。

混合標準溶液的配制：分別吸取1.00 mL 甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑標準溶液（100 μg/mL）于同一100 mL 容量瓶中，混勻后用乙腈定容，得到1.00 μg/mL 混合標準溶液。

混合內標溶液的配制：分別吸取1.00 mL 甲苯咪唑-D3、羥基甲苯咪唑-D3內標溶液（100 μg/mL）于同一100 mL 容量瓶中，混勻后用乙腈定容，得到1.00 μg/mL 混合內標溶液。

基質工作液的配制：按樣品前處理方法對空白樣品進行處理后，用空白樣品基質溶液稀釋混合標準儲備液，制成混合標準工作液濃度依次為：0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，內標濃度為5.0 ng/mL。

1.2.3 儀器條件 色譜條件：色譜柱：安捷倫RRHDSB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.25 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：35 ℃。溶液A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈，梯度洗脫程序：0 min，10% B，0～2.00 min，10%～20% B，2.00～3.00 min，20%～80%B，3.00～4.00 min，80% B，4.00～4.10 min，80%～10%B，4.10～7.00 min，10% B。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI 源）。

反吹氣流速（CUR Gas）：20 L/min；氣體1 流速（Gas 1）：50 L/min；氣體2 流速（Gas 2）：50 L/min；離子化溫度（TEM）：550 ℃；射入電壓（EP）：10 V；碰撞池射出電壓（CXP）：18 V。

監測模式：正離子監測模式；監測離子對及相關電壓參數設定見表1。

表1 三重四極桿離子對及相關電壓參數Table 1 Triple quadrupole ion pairs and related voltage parameters

1.3 數據處理

使用 AB SCIEX Analyst software 軟件采集數據，MultiQuant 軟件對數據定量處理，方法學考察中回收率平行測定6 次，樣品平行測定3 次，采用Microsoft Office Excel 2003 和Origin 8.5 進行統計學分析和圖形繪制，結果以平均數表示。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

甲苯咪唑（MBZ）、羥基甲苯咪唑（MBZ-OH）和氨基甲苯咪唑（MBZ-NH2）的共同的咪唑環上帶有NH 基團，在離子化過程中，此類化合物易與H 質子結合，帶正電荷，因此在質譜分析時一般采用正離子掃描模式[4]。在正離子掃描模式下分別對1 mg/L的3 種化合物進行質譜掃描分析，通過優化離子源參數，確認MBZ 的母離子峰為296.0，MBZ-OH 母離子峰為298.0，MBZ-NH2母離子峰為238.0，MBZD3和MBZ-OH-D3相應的母離子峰分別為299.0和301.1，并對其子離子進行全掃描，MBZ、MBZNH2和MBZ-D3失去-COC6H5得到m/z 105.1 子離子碎片，MBZ、MBZ-NH2和MBZ-D3失去-C6H5得到m/z 77.2 子離子碎片，MBZ-OH 和MBZ-OH-D3失去-OCH3后剩余部分得到m/z 266.0 子離子碎片，MBZ-OH 和MBZ-OH-D3失去-C6H5COH 和-OCH3后剩余部分得到 m/z 160.0 子離子碎片，選擇相應子離子以MRM 模式進行監測，優化每種化合物的母離子和子離子所需最佳裂解電壓和碰撞能（CE），得到優化的質譜參數見表1。

2.2 色譜條件的優化

正離子掃描模式下，甲酸的添加會顯著增強待測化合物的響應強度。本文比較了水、0.05%甲酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸的各物質的響應值，結果如圖1 所示，隨著甲酸含量的提高，各物質的響應值也隨之上升，當甲酸濃度在0.1%時，各物質的響應趨于穩定，因此選用0.1%甲酸作為添加量，乙腈和甲醇是液質檢測的通用流動相，乙腈洗脫能力更強，分析時間更短，相同濃度的甲苯咪唑在乙腈中響應值是甲醇的1.5 倍，羥基甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑在乙腈和甲醇中響應相近，無顯著性差別，因此本文選用0.1%甲酸水和乙腈作為流動相。

圖1 不同流動相響應比較Fig.1 Comparison of response between different mobile phases

甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、甲苯咪唑-D3、羥基甲苯咪唑-D3的MRM 圖如圖2 所示。

圖2 MBZ 類化合物MRM 圖Fig.2 MRM chromatogram of MBZ drugs

2.3 提取溶劑的選擇

甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑均屬于弱堿性化合物，水溶解性差，其溶解度受pH 影響較為明顯，在堿性條件下易溶于乙腈、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑[7,9]。查閱相關文獻[13-14]，甲苯咪唑類藥物殘留的測定常使用以下幾種提取溶劑：乙腈、氨化乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯與NaCO3混合溶液等。本文比較了上述四種溶劑提取效果，結果如圖3所示，單純的乙腈與乙酸乙酯提取效果并不理想，三種化合物回收率均小于80%，加入0.2%氨水和1%NaCO3溶液后，回收率大幅提高，0.2%氨化乙腈和乙酸乙酯碳酸鈉混合溶液提取效果均能滿足測定要求，考慮到牛羊肉中有大量蛋白和脂肪類物質，所選用提取液最好能沉淀蛋白，降低基質效應。與乙酸乙酯相比，乙腈沉淀蛋白的作用更為有效[10]。因此本方法選用0.2%氨化乙腈作為提取溶液。

圖3 4 種溶劑提取效果圖Fig.3 Extraction effects diagram of four solvents

2.4 凈化方式的選擇

甲苯咪唑類化合物的凈化方式主要有液液萃取法[8,15]、分散固相萃取法（QuEChERS 法）[6,16]和固相萃取法（SPE）[3,17]。液液萃取法凈化簡單方便但試劑消耗量大，除雜效果較差，單靠液液萃取凈化基質效應較強，降低了方法靈敏度。QuEChERS 法和SPE 法在獸藥殘留分析中應用較為廣泛，具有較好凈化效果，本文比較了QuEChERS 法、HLB 固相萃取法、MCX 固相萃取法、Captiva EMR-Lipid 固相萃取法四種凈化方式。選取50 ng/mL 牛肉基質提取液進行加標回收測定，結果如圖4 所示，QuEChERS法一般以PSA、C18、GCB、MgSO4等為原料進行配比[18-19]，本文嘗試了900 mg MgSO4、150 mg PSA 的經典配比[20]，三種化合物的回收率在72.0%～83.0%之間。親水親脂平衡的HLB 固相萃取柱適用性廣，三種化合物的回收率在79.1%～88.0%之間。由于甲苯咪唑及其代謝物均屬弱堿性化合物，采用混合陽離子MCX 萃取小柱富集，可去除基質中酸性和中性化合物的影響，凈化效果較好，三種化合物回收率在89.1%～93.4%之間。Captiva EMR-Lipid 小柱是基于體積排阻和疏水相互作用機制來去除脂質，對于脂質等雜質去除較好，三種化合物的回收率88.1%～96.5%，凈化效果與MCX 相近，雖然成本上略高于MCX 小柱，但由于其采用吸附雜質的通過式凈化，操作更為簡單高效，無需后續濃縮復溶等步驟，節省溶劑，降低能耗，在獸藥殘留檢測中已得到較好的應用[21-22]。因此本文采用Captiva EMR-Lipid 固相萃取小柱作為凈化手段。

圖4 4 種凈化手段凈化效果比較Fig.4 Comparison of purification effects of four purification methods

2.5 基質效應

牛羊產品中存在大量蛋白質、脂肪等干擾物質，對定量分析中有較大影響，因此有必要研究分析牛羊產品的基質效應。試驗選取牛肉、羊肉、牛肚和羊雜碎四種不同基質的空白樣品，分別繪制0.2～50 ng/mL 的空白基質標準溶液曲線和溶劑標準溶液曲線來評價基質效應。基質效應ME（%）=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率×100。ME 小于80%表現為基質抑制效應；80%～120%基質效應不顯著；大于120%表現為基質增強效應[23-24]。三種化合物的基質效應結果如表2 所示，牛肉羊肉等肌肉組織經凈化處理后樣品溶液中雜質相對較少，三種化合物基質效應在89.1%～106.6%之間，基質效應不顯著。牛肚羊雜碎等內臟部分，基質更為復雜，在牛肚樣品中MBZ-OH 表現為基質增強，MBZ-NH2表現為基質抑制；在羊雜碎樣品中MBZ-OH 和MBZ-NH2均表現為基質抑制，不同化合物在不同基質中基質效應表現也不完全一致。因此在牛肚羊雜碎等基質復雜的內臟樣品結果分析中有必要通過空白基質標準曲線進行定量抵消基質效應的影響。本文采用空白基質標準曲線進行定量分析。

表2 3 種甲苯咪唑藥物的基質效應Table 2 Matrix effects of three MBZ drugs

2.6 方法線性范圍、檢出限、定量限、精密度考察

牛肉羊肉等肌肉組織樣品可選用溶劑標準曲線或基質匹配標準曲線，牛肚羊雜碎等內臟樣品需要選擇基質匹配標準曲線，選取相同基質陰性樣品按上述方法進行處理，配制6 水平的基質匹配工作溶液系列，按方法的色譜和質譜條件，進行LC-MS/MS 分析，參考GB 31656.15-2022[25]方法，MBZ 以MBZ-D3為內標，MBZ-OH 和MBZ-NH2以MBZ-OH-D3為內標，以目標物與相應內標的濃度比為橫坐標，以目標物與相應內標的定量子離子峰峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。結果如表3 所示，MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2回歸方程的相關系數均大于0.999，表明3 種化合物在0.2～50 ng/mL 濃度范圍內均呈良好的線性關系。在實際樣品中以能達到信噪比（S/N）>3 時樣品的測定濃度為方法檢出限（LOD），信噪比（S/N）>10 樣品的測定濃度為方法定量限（LOQ），結合甲苯咪唑相關國家標準要求和藥物的最大殘留限量（MRL），確定本方法的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

表3 3 種甲苯咪唑類藥物回歸方程、相關系數、檢出限、定量限和線性范圍Table 3 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification of three MBZ drugs

2.7 回收率

分別選取牛肉、羊肉、牛肚和羊雜樣品，按1.0、3.0 和10 μg/kg 濃度水平添加標準溶液，每個樣品按上述方法進行處理平行測定6 次，結果見表4。在牛肉基質中甲苯咪唑及其代謝物的回收率為80.7%～108%，RSD 為1.6%～4.8%，在羊肉基質中甲苯咪唑及其代謝物的回收率為86.6%～108%，RSD 為2.3%～5.8%，在牛肚基質中甲苯咪唑及其代謝物的回收率為80.5%～105%，RSD 為1.1%～4.3%，在羊雜基質中甲苯咪唑及其代謝物的回收率為82.8%～104%，RSD為2.4%～5.5%。由此可知，本方法的回收率穩定、精密度較高，符合《GB/T 27404-2008 實驗室質量控制規范 食品理化檢測》要求，滿足日常檢驗需求。

表4 樣品中加標回收和精密度試驗Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of MBZ drugs

2.8 實際樣品測定

隨機采集市場上30 件牛羊產品，按上述方法進行檢測，其中有1 件羊肉樣品檢出MBZ 的代謝物MBZ-OH 和MBZ-NH2，其含量分別為3.8、4.5 μg/kg，有1 件羊雜樣品檢出MBZ 及其代謝物MBZ-OH和MBZ-NH2，其含量分別為5.0、15.1、20.8 μg/kg。我國《GB 31650-2019 動物性食品中獸藥殘留限量》中規定甲苯咪唑及其代謝物在馬羊肌肉中最大殘留限量為60 μg/kg，內臟的最高殘留限量為400 μg/kg，檢出的羊肉和羊雜樣品均未超出限量要求，未發現濫用該類藥物的風險。

3 結論

本文牛羊等動物源性食品為對象，基于增強型脂質去除凈化技術，以通過式固相萃取方式，結合液相色譜串聯質譜，建立了一種能同時測定牛羊產品中的甲苯咪唑及其代謝物的分析方法。選取牛肉、羊肉、牛肚和羊雜樣品進行三水平的加標回收試驗，加標回收率在80.5%～108.0%之間，RSD 為1.1%～5.8%。該方法操作簡便、結果快速準確，克服了目前方法前處理繁瑣、檢測周期長等不足，適用于牛羊產品中甲苯咪唑及其代謝物殘留量的快速檢測。