梅花鹿角盤膠原蛋白的鑒定及其理化性質(zhì)

黃詩萌，王景琦，皮鈺珍, ，邵俊花,

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.沈陽奉鹿堂生物科技有限公司，遼寧沈陽 110180）

梅花鹿角盤是雄性梅花鹿或馬鹿經(jīng)鋸茸后，于次年脫落的，介于鹿茸骨化和未骨化之間十分堅(jiān)硬的盤狀骨化殘角[1]。世界上養(yǎng)鹿業(yè)較發(fā)達(dá)的國家除中國外，只有新西蘭、俄羅斯、韓國等少數(shù)幾個(gè)國家，受飼養(yǎng)條件的限制，國內(nèi)外從事鹿產(chǎn)品研究的并不多，對(duì)于梅花鹿角盤中主要藥效成分之一膠原蛋白的研究報(bào)道甚少[2]。鹿角盤在民間藥用較為廣泛，具有溫補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血等功效，常用于腰膝酸冷、崩漏下血、陰疽腫痛等的治療[3-4]。目前市場上的梅花鹿角盤，簡單打粉，銷售初級(jí)原料，沒有充分開發(fā)其藥用價(jià)值[5-7]。

通過利用酸溶液中的離子破壞蛋白分子內(nèi)部的次級(jí)作用力和醛胺交聯(lián)鍵，引起纖維膨脹、溶解，從而水解得到產(chǎn)物，即酸溶性膠原蛋白。作為溶劑使用的酸主要有乙酸、檸檬酸、甲酸和鹽酸等，鹽酸溶液濃度一般為0.01 mol/L，有機(jī)酸在0.1～0.5 mol/L 之間[8]。酸法提取能最大程度地保持膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，但產(chǎn)品得率低。通過酶作用不同類型的肽鍵，利用其催化專一性將膠原進(jìn)行限制性酶解，從而水解得到產(chǎn)物，即酶溶性膠原蛋白。蛋白酶會(huì)將分子末端肽Lys 相互作用形成的共價(jià)交聯(lián)鍵切割下來，主體部分（三螺旋結(jié)構(gòu)）即可溶于溶液中，進(jìn)而再被提取出來，這樣溶解的膠原仍有完整的螺旋區(qū)段。本研究比較了酸法和酶法提取的梅花鹿角盤膠原蛋白的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，為梅花鹿角盤中膠原蛋白的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿角盤粉 由遼寧西豐養(yǎng)鹿場提供；胃蛋白酶（酶活力≥3000 U/mg）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（AR 分析純）、甲叉雙丙烯酰胺（AR 分析純）、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma 公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）（AR 分析純）臻鼎生物有限公司；（Bis）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量（BR 生化試劑）德國巴斯夫公司；丙烯酰胺（Acr）（AR 分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；四甲基乙二胺（TMEDA）（AR 分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過硫酸銨（APS）（AR 分析純）美國Amresco 公司。

L-8800 氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；DYY-6C 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；ZHWY-2102 恒溫振蕩搖床 國華電器有限公司；Nicolet 6700 傅立葉紅外光譜儀 Thermo Fisher Scientific 公司；UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯）上海儀器有限公司；CT14RD 型冷凍離心機(jī)上海天美科學(xué)儀器有限公司；CR21G 高速離心機(jī)東京日立公司；210 mm 玻璃干燥器 鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JY2001 型電子天平 上海方瑞儀器有限公司；pH S-25 型酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；40270520 型移液槍 美國熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 梅花鹿角盤ASC 的制備 梅花鹿角盤經(jīng)超微粉碎后，浸于0.5 mol/L HCl 溶液中，料液比為1:10，振蕩脫鈣60 min，振蕩頻率200 r/min，然后用0.5 mol/L 的Na2CO3溶液浸泡，液面沒過梅花鹿角盤粉，攪拌10 h 用紗布濾凈，蒸餾水沖洗三遍，冷凍干燥成粉末；選用0.3 mol/L 乙酸在pH 為2.7，固液比為1:15 的條件下水解36 h 后過濾，向上清液中加入5 mL NaCl 進(jìn)行鹽析24 h，使溶液終濃度為3.0 mol/L，析出絮狀白色沉淀于8000 r/min 離心30 min，沉淀部分用十倍體積的0.5 mol/L 乙酸溶解后，裝入透析袋中，在0.1 mol/L 的乙酸中透析12 h，再在蒸餾水中透析48 h，將透析液冷凍干燥得到酸溶性膠原蛋白ASC[9-10]。

1.2.2 梅花鹿角盤PSC 的制備 將1.2.1 中乙酸水解后的沉淀選用胃蛋白酶（酶活力≥3000 U/mg）在加酶量為1.6%，固液比為1:20，溫度為4 ℃條件下酶解2.5 h，將過濾后的上清液在95 ℃條件下進(jìn)行滅酶5 min 并離心30 min，轉(zhuǎn)速6000 r/min。上清液部分用10 倍體積的0.5 mol/L 乙酸溶解后，裝入透析袋中，在0.1 mol/L 的乙酸中透析12 h，再在蒸餾水中透析48 h，將透析液冷凍干燥得到酶溶性膠原蛋白PSC[11-12]。

1.2.3 氨基酸分析 將1 g 的鹿角盤ASC 與PSC樣品放入反應(yīng)管，添加15 mL 5 mol/L HCl 溶液與3～4 滴苯酚溶液。真空封管，110 ℃條件下水解24 h。水解液加水至50 mL。量取2 mL 水解液，在50 ℃下干燥，再將其溶解于2 mL pH2.2 的磷酸緩沖試劑中。經(jīng)過濾后，放入氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定[13]。

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

1.2.4.1 電泳膠配方 SDS-PAGE 凝膠電泳采用5%的濃縮膠與7.5%的分離膠，用于非連續(xù)電泳系統(tǒng)[14]，具體配方如表1 所示。

表1 SDS-PAGE 凝膠電泳配方Table 1 Formula of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

1.2.4.2 上樣緩沖液配方 上樣緩沖液配方采用2 倍還原緩沖液與2 倍非還原緩沖液，具體配方如表2 所示。

表2 還原和非還原上樣緩沖液Table 2 Sample buffer of reduction and non-reduction

1.2.4.3 樣品制備及電泳 將膠原蛋白樣品ASC 和PSC 分別溶解于0.1 mol/L 的Tris-HCl（pH6.8）緩沖液中，至最終濃度為0.5 mg/mL，4 ℃下放置24 h，10000 r/min 離心3 min。將蛋白上清液與上樣緩沖液l:1 等體積混合，60 ℃加熱3 min，取10 μL 上清液點(diǎn)樣。在槽中倒入含有1% SDS（w/v）的Tris-甘氨酸電泳液（pH8.3）。并于20 V 的濃縮膠和60 V的分離膠電壓下進(jìn)行電泳。

1.2.4.4 染色及脫色 在電泳完成后將凝膠取下。用0.05%的考馬斯亮藍(lán)染色l h。用脫色液在搖床內(nèi)脫色2 h，并觀察結(jié)果。

1.2.5 傅立葉變換紅外光譜（FTIR）掃描 將冷凍干燥的鹿角盤ASC 和PSC 固體樣品分別與干燥過的KBr 固體以2:100 的比例混合。然后研磨均勻，裝樣并壓片。小心取出樣品進(jìn)行測定，設(shè)置傅立葉變換紅外掃描儀分辨率為10 cm-1。在掃描區(qū)間為4000～400 cm-1區(qū)間對(duì)樣品紅外掃描[14]。

1.2.6 紫外掃描 將冷凍干燥的鹿角盤ASC 和PSC固體樣品分別溶于0.3 mol/L 乙酸溶液中，配成2 mg/mL 的膠原蛋白溶液，置于1 cm 比色皿中，設(shè)置紫外-可見分光光度計(jì)在波長范圍為200～400 nm內(nèi)對(duì)其掃描，波長間隔為1 nm，測出最大吸收波長[15]。

1.2.7 梅花鹿角盤膠原蛋白的溶解度 用0.5 mol/L乙酸分別溶解梅花鹿角盤ASC 和PSC 凍干品，分別制成質(zhì)量濃度為3 mg/mL 和6 mg/mL 的蛋白溶液，測定膠原蛋白的溶解度。膠原蛋白的溶解度采用蛋白質(zhì)分散指數(shù)（PDI）表示[16]。

式中：m1為上清液蛋白質(zhì)含量，g；m2為總蛋白質(zhì)含量，g。

1.2.7.1 pH 對(duì)膠原蛋白溶解度的影響 取8 mL 配好的蛋白溶液（質(zhì)量濃度為3 mg/mL）加入到50 mL離心管中，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 7 個(gè)水平后用蒸餾水定容至10 mL，在4 ℃條件下10000 r/min 離心20 min。測定膠原蛋白溶解度。

1.2.7.2 NaCl 濃度對(duì)膠原蛋白溶解度的影響 取5 mL 配好的蛋白溶液（質(zhì)量濃度為6 mg/mL）加入到50 mL 離心管中，與5 mL 濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mol/L 的NaCl 溶液混合，在4 ℃條件下10000 r/min 離心20 min。測定膠原蛋白溶解度。

1.2.8 梅花鹿角盤膠原蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性

取10 mg/mL 梅花鹿角盤ASC 和PSC 溶液100 mL于高速攪拌機(jī)中，10000 r/min 的速度攪打1 min，倒入量筒中讀取泡沫體積；再將泡沫靜置30 min 后，觀察記錄泡沫體積，以大豆分離蛋白作為對(duì)照。膠原蛋白起泡性（FE）和泡沫穩(wěn)定性（FS）的計(jì)算公式如下[17]。

式中：V 為攪打后泡沫的體積，mL；V0為攪打前的初始液體體積，mL；V30為攪打30 min 后泡沫的體積，mL。

1.2.8.1 pH 對(duì)膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

設(shè)置pH 分別為4、5、6、7、8、9 這6 個(gè)水平，分別測定FE 和FS。

1.2.8.2 NaCl 濃度對(duì)膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響 設(shè)置NaCl 溶液濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mol/L 6 個(gè)水平，分別測定FE 和FS。

1.2.9 梅花鹿角盤膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性

稱量一定量梅花鹿角盤ASC 和PSC 凍干品溶解于0.05 mol/L Tris-HCI 緩沖液（pH7.5）中，取1 mL大豆色拉油與3 mL 0.5%膠原蛋白溶液，12000 r/min高速勻漿機(jī)乳化1 min，分別于0、10 min 時(shí)用移液槍吸取50 μL 乳濁液，加入到5 mL 0.1% SDS 溶液中混合均勻，于500 nm 處分別測定吸光度A0和A10，以0.1% SDS 溶液為空白對(duì)照。乳化活性指數(shù)（EAI）及乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）計(jì)算公式如下[18]。

式中：A0為0 min 時(shí)測得的吸光值；A10為乳化液10 min 后測定的吸光值；Δt 為10 min。

1.2.9.1 pH 對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

設(shè)置pH 分別為4、5、6、7、8、9 這 6 個(gè)水平，分別測定EAI 和ESI。

1.2.9.2 NaCl 濃度對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響 設(shè)置NaCl 溶液濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol/L 6 個(gè)水平，分別測定EAI 和ESI。

1.2.9.3 蛋白濃度對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響 設(shè)置膠原蛋白濃度分別為0.5%、1%、2%、3%和4% 5 個(gè)水平，分別測定EAI 和ESI。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差等）及繪圖；用SPSS Statistics 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，通過Duncan 對(duì)平均數(shù)間的差異進(jìn)行比較分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花鹿角盤膠原蛋白分析鑒定

2.1.1 梅花鹿角盤膠原蛋白的氨基酸分析 由表3可知，鹿角盤通過不同方法制備的ASC 和PSC 的氨基酸組成極為相近，且含量豐富。占氨基酸殘基總數(shù)最大的是甘氨酸。氨基酸總量為1000 時(shí)，分別占184、195。這是因?yàn)樵诎被岬男蛄兄校拾彼崾且灾貜?fù)序列存在，而且該序列一直循環(huán)存在于膠原蛋白中。因此通過結(jié)構(gòu)式，可以判斷出甘氨酸殘基約占?xì)埢倲?shù)的33%；其次是蘇氨酸；蛋氨酸含量最低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)酪氨酸、組氨酸和異亮氨酸含量也很低，而且沒有檢測到胱氨酸。以上事實(shí)均證明實(shí)驗(yàn)所制備的膠原蛋白都符合Ⅰ型膠原蛋白氨基酸的模式構(gòu)成[19]。

表3 梅花鹿角盤ASC 和PSC 的氨基酸組成（殘基數(shù)/1000 個(gè)殘基）Table 3 Amino acid composition of ASC and PSC from deer antler base (residues/1000 residues)

膠原蛋白的特征氨基酸是Pro 和Hyp 的總和。在總數(shù)為1000 氨基酸殘基中，ASC 和PSC 中的脯氨酸分別為82 和87。同理，可計(jì)算羥脯氨酸分別為69 和75。Pro 在脯氨酰羥化酶羥基化作用后，膠原蛋白多肽鏈轉(zhuǎn)錄生成羥脯氨酸。ASC 和PSC 的脯氨酸羥基化程度分別為45.69%和46.30%。亞氨基酸（Pro 和Hyp 之和），同樣在殘基總數(shù)為1000 的情況下，ASC 和PSC 的殘基中依次為151 和162。亞氨基酸是環(huán)狀氨基酸，數(shù)量越多，需要破壞膠原蛋白主體結(jié)構(gòu)的溫度就越高。因此熱穩(wěn)定性就越好。所以膠原蛋白的熱變性溫度與亞氨基酸濃度有一定關(guān)聯(lián)性[20]。因此與ASC 相比較，PSC 的熱穩(wěn)定性更好。

2.1.2 膠原蛋白SDS-PAGE 電泳分析 由圖1 可知，鹿角盤ASC 和PSC 具有極相似的蛋白譜圖，圖中主要由α1 和α2、二聚體β鏈及三聚體γ鏈組成。而且α1 鏈的含量要遠(yuǎn)大于α2 鏈，二聚體β鏈含量較高，三聚體γ鏈含量較低。ASC 中β鏈和γ鏈的條帶強(qiáng)度比PSC 稍高，可能是由于ASC 中含有較高比例的分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)成分。相比于ASC，PSC 會(huì)有稍大的電泳遷移速率，這主要是因?yàn)槲傅鞍酌笗?huì)定位切割蛋白中端肽部位的肽，因此會(huì)使PSC 的分子量略小于ASC[21]。

圖1 梅花鹿角盤ASC 和PSC 在還原和非還原條件下的SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE pattern of ASC and PSC from deer antler base under non-reducing and reducing conditions

比較還原和非還原條件下的蛋白電泳圖，會(huì)發(fā)現(xiàn)不同條件下的條帶幾乎一樣。可以得出β-巰基乙醇對(duì)ASC 和PSC 的SDS-PAGE 譜圖無影響。膠原蛋白中不含有二硫鍵，這也印證了表3 的氨基酸組成的結(jié)論，即并沒有檢測到含硫氨基酸—Cys。

2.1.3 膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析如圖2 A、B 所示，除個(gè)別特征吸收峰存在吸收強(qiáng)度的微小差別外，二者的特征吸收峰基本一樣。由酰胺A 譜可以證明三螺旋之間氫鍵的存在。酰胺Ⅰ譜帶與蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，同時(shí)跟酰胺Ⅲ帶一起證明了三螺旋完整結(jié)構(gòu)的存在[22]。因此，紅外光譜圖圖譜也表明了鹿角盤膠原蛋白很好地保留了三螺旋構(gòu)型，是后續(xù)理化性質(zhì)準(zhǔn)確測定的重要前提。

圖2 梅花鹿角盤ASC（A）和PSC（B）的傅立葉變換紅外光譜掃描圖Fig.2 Fourier transform infrared spectroscopy of ASC (A) and PSC (B) from deer antler base

表4 為鹿角盤ASC 和PSC 的紅外光譜的特征吸收峰位置及相關(guān)說明。由N-H 的伸縮振動(dòng)而產(chǎn)生的酰胺A，其吸收峰一般出現(xiàn)在3400～3450 cm-1之間。一旦蛋白中的N-H 基團(tuán)與氫鍵締合，N-H 的伸縮振動(dòng)便會(huì)向低頻率移動(dòng)，對(duì)應(yīng)的波數(shù)會(huì)發(fā)生位移，一般在3300 cm-1左右[23]。FTIR 圖譜表明，ASC 和PSC 分別位于3320.10、3316.58 cm-1處的吸收峰是由酰胺A 的N-H 的伸縮振動(dòng)與氫鍵的締合所引起的。酰胺A 與酰胺Ⅱ帶的泛頻耦合，即發(fā)生費(fèi)米共振，分子中CH2 基團(tuán)的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)則會(huì)產(chǎn)生酰胺B 帶[24]，一般出現(xiàn)在3000 cm-1附近。ASC 和PSC 酰胺B 的較弱吸收峰分別位于2975.57、2968.07 cm-1處。

表4 鹿角盤ASC 和PSC 的紅外光譜吸收峰位置以及相關(guān)說明Table 4 Spectra peak locations of FTIR and assignment of ASC and PSC from deer antler base

在雙鍵區(qū)（2000～1500 cm-1），酰胺Ⅰ譜帶特征吸收波數(shù)通常在1625～1690 cm-1，是由C=O 伸縮振動(dòng)引起，其吸收峰最強(qiáng)，ASC 和PSC 分別在1646.05、1631.44 cm-1處存在較強(qiáng)的吸收。C=O 的伸縮振動(dòng)只取決于肽鏈的構(gòu)型，不受肽鏈側(cè)基的影響，故其對(duì)膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)較為敏感，與膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[25]。由異相N-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)和具有雙鍵性質(zhì)的C-N 伸縮振動(dòng)共同作用產(chǎn)生的酰胺Ⅱ帶，不易受肽鏈側(cè)基影響[26]。ASC 和PSC 分別位于1552.84、1534.37 cm-1，因此它是由N-H 彎曲振動(dòng)以及C-N 伸縮振動(dòng)引起。酰胺Ⅲ是由N-H 變形振動(dòng)所引起的，位于1200～1400 cm-1左右，是由于Gly 骨架和Pro 側(cè)鏈的CH2搖擺振動(dòng)所產(chǎn)生的，證明了膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的存在[27]。ASC 和PSC 的N-H 的變形峰分別位于1244.66、1237.28 cm-1處。

2.1.4 膠原蛋白紫外掃描分析 由圖3A、B 可知膠原蛋白在280 nm 處并無最大吸收峰，表明Try、Tyr 和Phe 等芳香族氨基酸的比例非常小，符合Ⅰ型膠原蛋白特征[28]。膠原蛋白肽鍵中存在羰基等生色基團(tuán)。具體表現(xiàn)為在200～230 nm 有強(qiáng)吸收峰，219.0 nm 和224.0 nm 分別是鹿角盤ASC 和PSC的最大吸收峰處。二者最大吸收峰存在一定差異，可能是其氨基酸組成及結(jié)構(gòu)不同所導(dǎo)致，與其他相關(guān)文獻(xiàn)所報(bào)道中華鱘膠原蛋白的紫外光譜在230 nm 處左右達(dá)到最大吸收峰值結(jié)論相一致[29]。

圖3 梅花鹿角盤ASC（A）和PSC（B）的紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of ASC (A) and PSC (B)from deer antler base

2.2 梅花鹿角盤膠原蛋白理化性質(zhì)分析

2.2.1 梅花鹿角盤膠原蛋白的溶解度

2.2.1.1 pH 對(duì)膠原蛋白溶解度的影響 比較pH 分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0 時(shí)對(duì)膠原蛋白溶解度的影響，結(jié)果如圖4 所示。通過實(shí)驗(yàn)測定，ASC 等電點(diǎn)是6.4±0.1，PSC 等電點(diǎn)是6.9±0.1。ASC和PSC 的溶解度均在pI 附近達(dá)到最低值。因?yàn)楫?dāng)pH 處于pI 時(shí)，膠原蛋白主要以兩性離子狀態(tài)存在，靜電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子間的靜電力最小，使蛋白質(zhì)分子易于結(jié)聚而產(chǎn)生沉淀，因此溶解度最低（P<0.05）。當(dāng) pH 分別為 4 和 10 時(shí)，ASC 和 PSC 溶解性均較好（P<0.05），這是因?yàn)榇藭r(shí)膠原蛋白分子自身帶有一定量的正電荷或負(fù)電荷，呈現(xiàn)出復(fù)雜的陽離子或陰離子狀態(tài)，分子之間存在互相排斥力，阻止了單分子結(jié)聚成沉淀物，從而使膠原蛋白分子具有良好的分散性，溶解度也隨之增大[30]。

圖4 pH 對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 溶解度的影響Fig.4 Effect of pH on solubility of ASC and PSC from deer antler base

2.2.1.2 NaCl 濃度對(duì)膠原蛋白溶解度的影響 將配制好的梅花鹿角盤ASC 和PSC 溶液5 mL 與濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mol/L 的NaCl溶液混合后，比較其溶解度的變化，結(jié)果如圖5 所示。當(dāng)NaCl 濃度為0～2 mol/L 時(shí)，增加鹽量可以增大膠原蛋白在水中的溶解度，即“鹽溶”現(xiàn)象[31]。此時(shí)鹽濃度對(duì)PSC 溶解度的影響顯著大于對(duì)ASC 的影響（P<0.05），使其所帶的正電荷逐漸增強(qiáng)，增大了相互間的排斥力，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定且具有較好的分散性，增大了膠原蛋白的溶解度[32]。當(dāng)NaCl 濃度大于2 mol/L 時(shí)，二者的溶解度均隨鹽濃度的增大而下降，即“鹽析”現(xiàn)象。這是因?yàn)辂}類解離出的高濃度的鹽離子，同周圍水分子結(jié)合形成一層水化膜，降低了膠原蛋白的水合作用，引發(fā)脫水而析出沉淀，從而減小了膠原蛋白的溶解度（P<0.05）[33]。

圖5 NaCl 濃度對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 溶解度的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on solubility of ASC and PSC from deer antler base

2.2.2 梅花鹿角盤膠原蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

2.2.2.1 pH 對(duì)膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響

比較pH 分別為4、5、6、7、8 和9 時(shí)，對(duì)膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖6 所示。梅花鹿角盤ASC 和PSC 在接近pI（6.4±0.1 和6.9±0.1）時(shí)，兩者所形成的泡沫體系很穩(wěn)定（P<0.05）。這是由于膠原蛋白分子間的排斥力很小，靜電吸引作用卻很大，會(huì)提高被吸附在氣/液界面上蛋白膜的厚度和硬度，利于蛋白與蛋白之間的相互作用及蛋白在膜上的吸附作用，從而形成黏稠的吸附膜，提高膠原蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性[34]。即使膠原蛋白在pI 處不溶解，只有很少的蛋白參與泡沫形成，泡沫穩(wěn)定性仍然可以提高。因?yàn)椴蝗懿糠值哪z原蛋白對(duì)泡沫形成雖然沒有貢獻(xiàn)，但卻可以增加蛋白膜的黏度，從而間接提高泡沫穩(wěn)定性。在非pI 時(shí)，ASC 和PSC 其泡沫穩(wěn)定性顯著降低（P<0.05）。

圖6 pH 對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on foam expansion and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.2.2 NaCl 濃度對(duì)膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響 比較NaCl 溶液濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mol/L 時(shí)，對(duì)膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖7 所示。NaCl 的添加可提高梅花鹿角盤ASC 和PSC 的起泡性能，可能是其有助于提高膠原蛋白溶液黏度的原因。當(dāng)NaCl 濃度為0.5～1.5 mol/L 時(shí)，鈉離子能同蛋白中的羧基形成鹽橋而顯著降低了膠原蛋白泡沫的穩(wěn)定性（P<0.05）[35]。

圖7 NaCl 濃度對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on foam expansion and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.3 梅花鹿角盤膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性

2.2.3.1 pH 對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

比較pH 分別為4、5、6、7、8 和9 時(shí)對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖8 所示。梅花鹿角盤ASC 和PSC 的pH 處于pI 時(shí)，其乳化能力和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最低值（P<0.05），偏離pI 時(shí)，均具有較高的乳化性和乳化穩(wěn)定性，PSC 的乳化性略高于ASC，可能是因?yàn)镻SC 的氨基酸側(cè)鏈發(fā)生解離，產(chǎn)生了靜電斥力，利于乳濁液的穩(wěn)定。ASC 的乳化穩(wěn)定性高于PSC，可能因?yàn)榇藭r(shí)的條件有利于膠原蛋白的溶解，并提高膠原蛋白對(duì)水的結(jié)合能力，進(jìn)而提高了蛋白膜的乳化穩(wěn)定性[36]。

圖8 pH 對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on emulsifying activity and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.3.2 NaCl 濃度對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響 比較NaCl 溶液濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol/L 時(shí)，對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖9 所示。適當(dāng)?shù)腘aCl 濃度會(huì)降低膠原分子間的斥力，促進(jìn)鹽溶，從而進(jìn)一步提高膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性；但當(dāng)NaCl 濃度過大時(shí)，電離后的離子會(huì)降低乳液表面電位，斥力能壘也隨之下降，反而會(huì)對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。在NaCl 濃度在0～0.4 mol/L 范圍內(nèi)，能促進(jìn)梅花鹿角盤ASC 和PSC 溶解能力的提高，造成乳化性和乳化穩(wěn)定性呈顯著增加的趨勢(shì)（P<0.05）；當(dāng)濃度大于0.4 mol/L 時(shí)，梅花鹿角盤ASC 和PSC 的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨NaCl 濃度的增大而緩慢下降（P<0.05）[37]。

圖9 NaCl 濃度對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of NaCl concentration on emulsifying activity and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.3.3 蛋白濃度對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響 比較蛋白濃度分別為0.5%、1%、2%、3%、和4%時(shí)，對(duì)膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖10 所示。在蛋白濃度0.5%～2%時(shí)，梅花鹿角盤ASC 和PSC 的乳化性顯著增大（P<0.05）。濃度大于2%時(shí)，增長幅度緩慢，基本保持平穩(wěn)狀態(tài)（P>0.05）。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍诐舛瘸^一定值，吸附層不再有明顯變化，使得膜厚度和強(qiáng)度增加幅度減小[38]。相反ASC 和PSC 的乳化穩(wěn)定性隨著蛋白濃度的增大而降低，在蛋白濃度0.5%時(shí)，兩者的乳化穩(wěn)定性最大，蛋白濃度4%時(shí)，兩者的乳化穩(wěn)定性最小（P<0.05）[39]。

圖10 蛋白濃度對(duì)梅花鹿角盤ASC 和PSC 乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of collagen concentration on emulsifying activity and stability of ASC and PSC from deer antler base

3 結(jié)論

梅花鹿角盤ASC 和PSC 符合Ⅰ型膠原蛋白氨基酸的特征分布。其中蛋氨酸含量最低。ASC 和PSC 的羥基化程度較高，分別為45.69%和46.30%。ASC 和PSC 至少由兩條α鏈（α1 和α2）組成，β鏈含量較高，并含有少量的γ鏈。膠原蛋白分子量約為110 kDa，說明鹿角盤膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白且達(dá)到電泳純。ASC 和PSC 二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均出現(xiàn)酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的特征吸收峰，保存著三螺旋結(jié)構(gòu)。ASC 和PSC 在280 nm 處基本無吸收。其最大吸收峰位于219.0 nm 和224.0 nm 處。ASC 和PSC溶液的pH 越接近膠原蛋白pI，蛋白溶解性越小。當(dāng)NaCl 濃度為0～2 mol/L 時(shí)，發(fā)生“鹽溶”現(xiàn)象，ASC 和PSC 的溶解度隨鹽濃度增大而提高；濃度大于2 mol/L 時(shí)，出現(xiàn)“鹽析”現(xiàn)象，溶解度反而下降。梅花鹿角盤ASC 和PSC 溶液的pH 越接近pI，其乳化能力和乳化穩(wěn)定性越小。當(dāng)NaCl 濃度為0～2 mol/L 時(shí)，增加鹽量可以增大ASC 和PSC 的溶解性、起泡性；鹽濃度在0～0.4 mol/L 范圍內(nèi)，能提高ASC 和PSC 乳化性和乳化穩(wěn)定性。蛋白濃度0.5%時(shí)，兩者的乳化穩(wěn)定性最大，蛋白濃度4%時(shí)，兩者的乳化穩(wěn)定性最小。梅花鹿角盤膠原蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的研究為產(chǎn)品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。