親脂性匹配色譜分離-超高效液相色譜-串聯質譜法測定果蔬中21 種三唑類殺菌劑

孟 虎 ，李源槿，趙丹妮，張雅婷，張 丹，楊 琦，馮歆軼

（1.西安市產品質量監督檢驗院，陜西西安 710065；2.陜西中檢評價技術有限公司，陜西西安 710065）

高效液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜法（High performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）具有高的靈敏度和特異性，廣泛應用于農藥殘留的定性定量分析[1-3]。HPLC-ESI-MS/MS 在復雜基質如食品的分析過程中通常會出現基質效應（Matrix effects，MEs），嚴重影響分析方法的準確度、靈敏度和精密度。與目標分析物從色譜柱上共洗脫的干擾基質組分會影響目標分析物的離子化效率，引發“離子增強”或“離子抑制”作用，進而導致基質效應的產生[4-5]。

目前降低基質效應的方法主要有同位素內標法[6-8]、空白基質匹配校準法[9-10]、樣品稀釋[11-13]和樣品前處理[14-15]等。其中，空白基質匹配校準法是目前最常用的補償基質效應的方法，廣泛應用于農藥殘留的測定，但對于不同的樣品需要分別配制相應的空白基質標準溶液，顯著增加了檢測工作量[14,16]，且多農殘測定時，多種農藥同時陰性的樣品也不易獲得。此外，樣品前處理是一種有效的降低基質效應的方法，能夠選擇性除去基質組分，不同的方法如固相萃取[17-18]、液液微萃取[19]以及分散固相萃取[20-22]等已被用于樣品前處理。但是，前處理過程在去除基質組分的同時，分析物也可能會受到損失，因此，樣品前處理通常只能除去部分基質組分[23]，需要通過液相色譜分離過程進一步分離目標分析物和基質組分，減少分析物和基質組分的共洗脫，降低基質效應[24]。然而，目前仍缺少能夠提高農藥殘留色譜分離效率的有效策略，因而有必要發展一種新的液相色譜分離方法，用以改善農藥和基質組分的色譜分離，降低基質效應。

大部分農藥通常使用反相的烷基鍵合相色譜柱進行分離，分離過程主要依據不同化合物與烷基鍵合相之間疏水相互作用強度的差異來實現[25-26]，色譜分離與這些化合物和烷基鍵合相的親脂性密切相關。目前農藥殘留液質分析通常使用C18柱分離[7,22,27]，但對于很多農藥其色譜分離效果不理想，仍然存在顯著的基質效應，這可能是由于其鍵合的十八烷基是高度親脂的，其親脂性遠高于大部分農藥。基于此，本研究提出親脂性匹配色譜分離，作為一種有效的液相色譜分離策略，用以提高農藥殘留的色譜分離效率，改善農藥和基質組分的色譜分離。本研究選取三唑類殺菌劑為研究對象，采用分散固相萃取凈化，選用與三唑殺菌劑具有相近親脂性的色譜柱進行分離，建立果蔬中21 種三唑殺菌劑的UPLC-MS/MS 檢測方法，探究不同親脂性烷基鍵合相對三唑殺菌劑和基質組分色譜分離的影響，為農藥殘留的UPLC-MS/MS分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用橙子、黃瓜、香蕉和蘋果 購自本地農貿市場；乙腈、甲醇 色譜純，美國Honeywell 公司；甲酸 色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；QuEChERS 提取鹽包（4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉）、聚四氟乙烯微孔濾膜（0.22 μm）、石墨化碳黑（GCB）（38～120 μm）、N-丙基乙二胺（PSA）（40～63 μm）上海安譜實驗科技股份有限公司；標準物質亞胺唑（97.5%）、氯氟醚菌唑（99%）德國Dr.Ehrenstorfer 公司；標準物質粉唑醇（99.5%）、三唑醇（98.2%）、三唑酮（98.4%）、環丙唑醇（98.0%）、腈菌唑（99.6%）、氟環唑（98.0%）、滅菌唑（97.8%）、四氟醚唑（99.9%）、腈苯唑（98.5%）、氟硅唑（99.1%）、戊菌唑（99.1%）、戊唑醇（99.3%）、聯苯三唑醇（1000 μg/mL）、葉菌唑（97.9%）、己唑醇（99.1%）、烯唑醇（98.0%）、丙環唑（98.5%）、苯醚甲環唑（98.3%）和種菌唑（98.8%）購自壇墨質檢科技股份有限公司。

ACQUITY UPLC-TQD 超高效液相色譜-串聯質譜儀（UPLC-MS/MS）配電噴霧離子源（ESI），美國Waters 公司；TG-16 高速冷凍離心機 湖南湘儀科技公司；JE1103C 電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器公司；ACQUITY BEH C8色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）美國Waters 公司；JYL-C022E 粉碎機 九陽股份有限公司；Milli-Q 超純水機 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 標準儲備溶液：分別準確稱取21 種農藥標準品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1000 mg/L 標準儲備溶液，-20 ℃冰箱避光保存。

混合標準中間液：分別準確移取21 種標準儲備溶液各1.0 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，得到10 mg/L 混合標準中間液，-20 ℃冰箱避光保存。使用時用乙腈稀釋成不同濃度的系列標準工作溶液，現用現配。

1.2.2 樣品前處理 將樣品切成小塊狀，放入粉碎機制成均質樣品，放入密閉容器中，-18 ℃冰箱冷凍保存備用。準確稱取10 g（精確至0.01 g）橙子樣品至50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈后混勻，渦旋振蕩1 min，加入QuEChERS 提取包后立即劇烈振蕩1 min，以5000 r/min 離心5 min，取2 mL 上清液至含有300 mg 無水MgSO4、50 mg PSA 和5 mg GCB的離心管中，渦旋振蕩1 min，5000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm PTFE 濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY BEH C8色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；自動進樣器溫度：15 ℃；進樣體積：3 μL；流速：0.2 mL/min；流動相：0.05%甲酸水溶液（A 相），甲醇（B 相）；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Program of mobile phase gradient elution

1.2.4 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（Electron spray ionization，ESI），正離子模式；監測方式：多反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓：3.2 kV；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣N2流速550 L/h；錐孔氣N2流速：50 L/h，21 種殺菌劑的多反應監測質譜分析參數見表2。

表2 21 種三唑殺菌劑的多反應監測質譜分析參數Table 2 Optimized MRM parameters for the 21 triazole fungicides

1.2.5 基質效應的評價 采用橙子、黃瓜、香蕉和蘋果空白樣品按照1.2.2 方法進行前處理，得到空白基質溶液。分別用空白基質溶液和乙腈配制濃度為5、10、20、50、100、250 μg/L 的基質匹配標準工作溶液和溶劑標準工作溶液，繪制基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線，依據式（1）通過兩種曲線斜率的比值來計算基質效應（ME）[28-29]。

式中：ME 為基質效應；A 為基質匹配標準曲線的斜率；B 為溶劑標準曲線的斜率。

當ME%≤-10%時，表現為基質抑制效應；當ME%≥10%時，則為基質增強效應；若-10%

1.3 數據處理

數據采集由Waters TQD MassLynx 軟件完成，采用儀器自帶數據處理軟件QuanLynx 4.1 對測定結果進行定性和定量分析。加標回收試驗為5 次平行測定結果，以平均值±標準偏差表示。用Excel 2010進行數據分析處理，Origin 8.0 繪制統計圖表。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

本研究使用21 種1 mg/L 的三唑殺菌劑標準溶液通過針泵導入質譜儀，在正、負離子模式下分別進行掃描，結果顯示21 種三唑殺菌劑在電噴霧正離子模式下質譜響應更高。通過調整優化錐孔電壓，使母離子響應強度達到最佳，再通過調整優化碰撞能量，使得對應的子離子響應強度達到最佳，選擇受基質干擾小、相對豐度高的離子作為定量離子，得到的質譜分析參數見表2。

2.2 樣品前處理

本研究選用QuEChERS 方法[31-32]對果蔬樣品進行前處理，該方法具有簡單、快速、高效等特點，廣泛應用于農藥殘留分析的樣品前處理。果蔬樣品用乙腈提取，采用檸檬酸鹽緩沖體系鹽析分相，離心取上清液經PSA 和GCB 分散固相萃取凈化，去除樣品提取溶液中的部分基質組分如有機酸、脂肪酸、糖類以及色素等。凈化后樣品溶液中仍存在其他類型的基質組分，導致顯著的基質效應，由表3 和圖1可知，使用C18柱分離時，三唑酮、滅菌唑和氟環唑有明顯的基質效應，且回收率偏低。同時，由圖2 空白橙子樣品的全掃描色譜圖可知，凈化后的樣品溶液中仍有多種基質組分。因而需要通過高效的色譜分離過程進一步將基質組分和目標分析物分離，減少共洗脫，從而有效降低基質效應。

圖2 空白橙子樣品在不同色譜柱上的全掃描色譜圖Fig.2 Full-scan chromatograms of blank orange sample separated on different LC columns

表3 21 種三唑殺菌劑的保留時間和在橙子樣品中的基質效應Table 3 Retention time and matrix effect for 21 triazole fungicides in orange

2.3 親脂性匹配色譜分離

大多數農藥是非極性或低極性的，通常使用反相烷基鍵合相色譜柱進行分離，而農藥在烷基鍵合相色譜柱上的保留與其親脂性密切相關。本研究中21 種三唑殺菌劑的正辛醇-水分配系數log P 值為2.3～4.9[33]，依據親脂性匹配色譜分離，本研究選擇與三唑殺菌劑具有相近親脂性的C8色譜柱進行分離，C8色譜柱鍵合的辛烷基的log P 值為4.32（辛烷）[34]，與三唑殺菌劑相近。21 種三唑殺菌劑的基質效應和回收率結果如表3 和圖1 所示，所有21 種三唑殺菌劑的基質效應為-8.3%～4.7%，全部處于-10%～10%范圍內，基質效應不顯著。采用溶劑標準工作曲線外標法進行定量，測定的回收率結果（圖1）表明，21 種三唑殺菌劑的平均回收率為91.8%～107.0%，具有良好的回收率。基質效應和回收率測定結果表明，該方法能夠有效降低三唑殺菌劑UPLC-MS/MS 分析中的基質效應，采用溶劑標準工作曲線進行定量即可獲得滿意的回收率。

為進一步證實親脂性匹配色譜分離在提高農藥殘留色譜分離效率中的作用，本研究采用農藥殘留分析中最常使用的C18色譜柱作為對照，C18柱是高度親脂的，其鍵合的十八烷基的log P 值為9.18（十八烷）[35]，遠高于21 種三唑殺菌劑。以0.05%甲酸水溶液和甲醇為流動相，梯度洗脫，采用溶劑標準工作曲線外標法進行定量，評價三唑殺菌劑的基質效應和回收率。結果表明（表3），三唑酮、滅菌唑和氟環唑均表現為基質抑制效應，其中僅52.4%（11 種）三唑殺菌劑的基質效應處于-5%～5%范圍內，而對于C8色譜柱，95.2%（20 種）三唑殺菌劑的基質效應處于-5%～5%范圍內。此外，回收率測定結果表明（圖1），對于C18色譜柱，三唑殺菌劑的平均回收率為81.3%～111.9%。

基質效應和回收率測定結果表明，相較于高度親脂的C18色譜柱，與三唑殺菌劑具有相近親脂性的C8色譜柱能夠更好地降低基質效應，改善回收率，表明C8色譜柱具有更高的色譜分離效率，能夠有效分離三唑殺菌劑和基質組分，減少目標分析物和基質組分的共洗脫，降低基質效應。

此外，本研究還通過空白橙子樣品的全掃描色譜圖進一步研究不同親脂性烷基鍵合相色譜柱對三唑殺菌劑和基質組分的分離效果。空白橙子樣品按1.2.2 方法進行前處理，隨后分別使用C8和C18色譜柱進行分離測定其全掃描色譜圖，結果如圖2 所示。由圖可知，對于C18柱，位于7.17 min 和7.73 min的基質組分的色譜峰分別與三唑酮（7.18 min）和滅菌唑（7.68 min）、氟環唑（7.77 min）非常接近，這些基質組分和分析物從C18柱上共洗脫，導致明顯的基質效應，這與表3 的結果相一致，表明C18柱無法將這些分析物和基質組分有效分離，可能是由于這些基質組分和分析物與高度親脂的十八烷基固定相之間的疏水作用大小非常接近，導致其色譜保留時間非常接近。而對于C8柱，位于6.73 min 和7.20 min 的基質組分的色譜峰與各分析物的保留時間有顯著差別，因而各分析物沒有明顯的基質效應，表明C8色譜柱能夠顯著改善三唑殺菌劑和基質組分的色譜分離，降低基質效應，這可能是由于C8柱鍵合的辛烷基與三唑殺菌劑具有相近的親脂性，基質組分和分析物與固定相之間的疏水作用大小不同，導致其色譜保留時間有顯著差別。

對于戊唑醇，使用C18柱分離時，其基質效應ME%為-2.4%，而平均回收率為111.9%，其基質效應和回收率之間不一致。由戊唑醇的提取離子色譜圖可知，空白樣品基質在8.58 min 存在明顯的干擾峰（圖3A），與戊唑醇色譜峰（8.63 min）重疊（圖3B），C18柱無法將該干擾物和戊唑醇分離，導致定量結果偏高，從而引起回收率偏高。同時，該干擾物可能對戊唑醇的離子化效率沒有明顯影響，使戊唑醇沒有明顯的基質效應。當使用C8柱分離時，該干擾物和戊唑醇的保留時間分別為8.00 min 和8.31 min（圖3C和3D），二者得到有效分離。這些結果也表明，C8柱具有更高的色譜分離效率，能夠有效分離戊唑醇和干擾物。

圖3 戊唑醇的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of tebuconazole

上述結果證實了與三唑殺菌劑具有相近親脂性的C8色譜柱具有更高的色譜分離效率，能夠有效分離三唑殺菌劑和基質組分，將分散固相萃取和C8色譜柱分離相結合，能夠有效降低果蔬中三唑殺菌劑UPLC-MS/MS 測定時的基質效應，使用溶劑標準工作曲線外標法進行定量即可獲得滿意的回收率，顯著提高了檢測效率。因此，所述親脂性匹配色譜分離是一種簡單、有效的液相色譜分離策略，能夠提高農藥殘留的色譜分離效率，降低基質效應。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法線性范圍和定量限 將混合標準中間液用乙腈進行稀釋，配制成濃度為5、10、20、50、100、250 μg/L 的混合標準工作液，以各分析物的質量濃度（x，μg/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標（y），繪制溶劑標準工作曲線，評價方法的線性。以定量離子信噪比（S/N）為10 確定方法的定量限（Limit of quantification，LOQ）[36-37]。各分析物的溶劑校準曲線和空白橙子基質匹配校準曲線線性方程、定量限和線性范圍見表4。21 種三唑殺菌劑在5～250 μg/L 濃度范圍內線性關系良好，決定系數R2≥0.999，滿足實際樣品分析需要，采用10 倍信噪比法確定了各分析物的定量限為0.5～3.5 μg/kg。

表4 21 種三唑殺菌劑的線性范圍、定量限（LOQ）、線性方程和決定系數（R2）Table 4 Liner ranges,LOQ,regression equation and determination coefficient (R2) for 21 triazole fungicides

2.4.2 準確度和精密度 通過橙子樣品的加標回收實驗評價該方法的準確度和精密度，目標分析物加標水平分別為10、50、200 μg/kg，每個加標水平設置5 個平行樣，連續測定3 d，分別計算加標回收率以及日內、日間相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD），結果如表5 所示。21 種殺菌劑在三個加標水平的平均回收率為91.4%～108.1%，日內和日間精密度分別為0.7%～5.2%和1.7%～6.0%，說明該方法具有良好的準確度和精密度。

表5 21 種三唑殺菌劑的回收率和精密度Table 5 Recovery and precision for 21 triazole fungicides

2.5 其它果蔬樣品的分析

為了驗證該方法的實用性和普適性，采用本研究建立的方法對其他果蔬樣品蘋果、香蕉和黃瓜進行分析，分別評價其回收率和基質效應。結果顯示（表6），三種果蔬樣品的基質效應為-8.9%～9.7%，平均回收率分別是95.6%～108.9%（蘋果）、102.4%～109.3%（香蕉）以及98.6%～106.8%（黃瓜），基質效應不顯著，回收率良好，說明該方法對于不同果蔬樣品具有普適性。

表6 21 種三唑殺菌劑在不同果蔬基質中的基質效應和加標回收率Table 6 Matrix effect and recoveries for 21 triazole fungicides in different fruits and vegetables

3 結論

本研究基于親脂性匹配色譜分離和分散固相萃取，建立了果蔬中21 種三唑類殺菌劑的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。樣品經乙腈提取，分散固相萃取凈化，選用與三唑殺菌劑具有相近親脂性的C8柱進行色譜分離。結果表明，所述親脂性匹配色譜分離能夠提高色譜分離效率，改善三唑殺菌劑和基質組分的色譜分離，與分散固相萃取相結合，有效降低了果蔬中三唑殺菌劑UPLC-MS/MS 測定時的基質效應，使用溶劑校準工作曲線即可獲得滿意的回收率，顯著提高了檢測效率。21 種三唑殺菌劑的基質效應在-8.3%～4.7%，在5～250 μg/L 質量濃度范圍內線性關系良好，平均回收率為91.4%～108.1%，日內和日間RSD 分別為0.7%～5.2%和1.7%～6.0%，定量限為0.5～3.5 μg/kg。該方法操作簡單、結果準確、靈敏度高，適用于果蔬中三唑殺菌劑的分析檢測，為果蔬中農藥殘留UPLC-MS/MS 分析中提供了方法參考。所述親脂性匹配色譜分離是一種簡單、有效的液相色譜分離策略，對于提高農藥殘留色譜分離效率，降低基質效應具有重要意義。