不同溫度對離土浙貝母貯藏品質及酶活性的影響

林旭東，董翼飛，凌建剛，朱 麟,

（1.寧波市農科院農產品加工研究所，浙江寧波 315000；2.國家蔬菜加工技術研發專業中心，浙江寧波 315000；3.寧波市農產品保鮮工程重點實驗室，浙江寧波 315000；4.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866）

浙貝母（Fritillaria thunbergiiMiq）系百合科、貝母屬中一種多年生草本植物，原產于浙江寧波象山，主產地在浙江且在浙江省的種植面積占全國總面積的90%，產值近9 億元[1]。浙貝母中主要含有生物堿、多糖、皂苷和揮發性成分[2]，具有鎮痛止咳[3-4]、抗炎抑菌抗氧化和抗癌抗腫瘤等功效[2,5-6]，它不僅作為傳統中藥，還用做功能性食品[7]，如浙貝母含有20%的直鏈淀粉，在加工過程中極易轉化成對人體有益的抗性淀粉，對人體腸道有益。

浙貝母采收季節通常在每年的5 月份，此季節多陰雨天氣且室內外溫度較高，而且采后其鱗莖水分含量較高，酶活性較強并且生理代謝旺盛，當被采收離開土地后其貯藏期會變得非常短暫，很容易發霉變質。經查閱文獻發現，目前還沒有關于采后浙貝母貯藏方式的研究。傳統上，大多采用將浙貝母種鱗莖留地或土埋的方法進行貯藏，以防止貯藏期間其鱗莖發生腐爛。但該方法操作繁瑣、受氣候和儲藏環境影響較大，容易造成浙貝母鱗莖的品質損失。研究表明，低溫貯藏可以有效延長采后農產品的貯藏期[8-9]。其中，貯藏溫度是農產品保持良好品質的重要條件，不當的貯藏溫度會對農產品的品質和貨架期產生不良的影響[10-11]。低溫貯藏一直是延緩果蔬成熟和腐爛的有效技術，其在秋葵[12]以及杏鮑菇[13]等農產品中應用廣泛。但是，目前還沒有關于離土浙貝母低溫貯藏的報道。果蔬類農產品對溫度敏感，貯藏溫度過高保鮮效果不明顯，而溫度過低會對果蔬產生冷害并引起生理紊亂，確定適宜的貯藏溫度對保持離土浙貝母的品質和減少采后損失具有重要的意義。

因此，本文以成熟的浙貝母鱗莖為材料，采用0、5、10、20 ℃四個貯藏溫度，來比較在不同貯藏溫度條件下浙貝母的理化品質如失重、色澤、硬度、總生物堿含量、總多糖含量、過氧化物酶（POD）活性、多酚氧化酶（PPO）活性以及超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化，以選擇出浙貝母的最佳貯藏溫度解決其離土貯藏困難的問題，為下一步浙貝母的貯藏保鮮奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

浙貝母鮮鱗莖 取自寧波市海曙區章水鎮浙貝母種植基地，取樣時間為2022 年5 月，室外溫度30 ℃，采購后運回實驗室進行貯藏實驗；總生物堿含量試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）試劑盒 均購自蘇州格銳思生物科技有限公司；甲醇、無水乙醇 分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；三氯甲烷 分析純，杭州高晶精細化工有限公司；木瓜蛋白酶（100000 U/g）

食品級，東恒華道生物科技有限公司；苯酚 分析純，上海克林生化科技有限公司。

ReadMax 1900/1900Pus 型酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；Spectrumlab 紫外可見分光光度計 上海力申科學儀器有限公司；125D-1CN 型十萬分之一電子分析天平 德國Sartorius 公司；VS10-300C 型超聲波清洗器 沃信儀器制造有限公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；TA.XT plus 質構儀 北京鑫奧依克光電技術有限公司；Frontier? 5000 型微量高速離心機 美國Ohaus；X-Rite CI60 色差儀 愛色麗（上海）色科技有限公司。

1.2 實驗方法

將浙貝母分為12 組，每組30 個，分別放置在0、5、10 和20 ℃條件下貯藏，貯藏前對其硬度、色澤、總生物堿含量、總多糖含量、MDA 含量、POD、PPO 以及SOD 的活性進行測定。之后每15 d 從四個溫度梯度中各隨機挑選30 個浙貝母對其理化性質進行測定，測定周期為90 d。

1.2.1 失重率測定 采用差量法計算。按照下式計算失重率[14]。

式中：m1—貯藏前樣品質量，g，m2—貯藏后樣品質量，g。

1.2.2 感官評價 取樣后，對浙貝母進行感官評定。評定時，品評人員對浙貝母的色澤、氣味、組織飽滿度以及霉變程度4 個方面進行評價，最后通過統計總分進行分析。各項指標分別為好、較好、一般、較差和差5 個等級，分值分別為10、8、6、4、2 分，滿分40 分。分數在32～40 表示產品質量較好；分數在24～32，表示產品質量良好，無明顯變化；感觀評分低于16 分產品品質發生明顯變化，達到貨架期終點。由20 名品評人員（男女各半）作為感官評價小組，對浙貝母進行感官評價，具體標準見表1。

表1 浙貝母感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Fritillaria thunbergii Miq

1.2.3 色澤分析 從每組樣品中隨機選取10 個浙貝母，然后將其切開，使用X-Rite CI60 色差儀對其果皮的六個部位（上、下、前、后、左和右）的色差進行測定，每個部位測定三次，其中L*值表示明度，L*值越大，表示亮度越大；a*值正數代表紅色，負數代表綠色；b*值正數代表黃色，負數代表藍色，色澤測定選在相同自然燈光下進行。

在農業供給側結構性改革背景下和“三農”問題的進一步推進下，農村市場主體多樣化生產經營模式對于金融產品和服務的需求增大，當前的農村金融無法滿足改革發展的需要，需要加快農村金融創新，將農村金融創新發展作為一項系統工程，構建現代化的金融體系，滿足農村多樣化的金融需求，解決農村金融供給不足及效率不高的問題。

1.2.4 硬度分析 采用TA.XT 質構儀測定各處理組浙貝母硬度。樣品前處理：隨機挑選10 個直徑為5 cm 左右的無損浙貝母，洗凈晾干，分別在頭部、中部和尾部選取平整處進行測試。探頭選擇：選用直徑2 mm 的P/2 圓柱形探頭。參數設定：設置參數為測試前速度1 mm/s，測試速度5 mm/s，測試后速度5 mm/s，位移10 mm。每個樣品進行6 次重復，取平均值。

1.2.5 總多糖含量測定 總多糖含量的測定根據汪少華等[15]的方法并稍加修改。

標準曲線繪制：準確稱取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖標準品10.00 mg 于100 mL 容量瓶中。分別吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 葡萄糖標準溶液，用蒸餾水補至1.00 mL，先后加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 濃硫酸，搖勻冷卻，室溫放置20 min 后于490 nm 波長測定其吸光度值。以吸光度值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程y=0.85824x+0.04438，決定系數R2=0.9981。

總多糖含量的測定：吸取多糖溶液1.00 mL，然后依次加入1.00 mL 的5%的苯酚溶液、5.00 mL 的濃硫酸，搖勻冷卻，室溫放置20 min 后于490 nm 波長測定其吸光度值。根據標準曲線計算多糖含量。

1.2.6 總生物堿含量、丙二醛（MDA）含量、多酚氧化酶（PPO）活性、過氧化物酶（POD）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 測定時將浙貝母組織切碎，稱取約0.20 g 組織于5 mL 試管中，加入2 mL提取液冰浴勻漿，4 ℃下離心（10000 r/min）10 min，保留上清液，然后根據試劑盒說明進行操作。分別測定其SOD 活性、POD 活性、PPO 活性、總生物堿含量和MDA 含量，每個樣品重復3 次，結果取平均值。

1.3 數據處理

采用Origin 2021 軟件進行數據計算和作圖，使用SPSS 17.0 軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度對浙貝母失重率的影響

失重率是衡量浙貝母貯藏品質的重要指標，失重主要是由于浙貝母水分的蒸騰作用以及呼吸作用消耗體內營養物質造成的。失重率達到一定程度時，會導致浙貝母萎蔫，影響其藥用價值[16]。貯藏期間浙貝母失重率變化見圖1。

圖1 不同貯藏溫度下浙貝母失重率變化Fig.1 Changes of weight loss of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.2 不同貯藏溫度對浙貝母感官評分的影響

果皮色澤、氣味、組織飽滿度以及霉變程度能反映出貯藏期間浙貝母品質的變化。浙貝母在不同貯藏條件下感官評分變化如圖2 所示。從圖中可以看出，浙貝母在20 ℃條件下可以貯藏45 d，10 ℃條件可以貯藏60 d，而0 和5 ℃條件下貯藏90 d 其品質依然飽滿無變質。不同貯藏條件下的浙貝母感官評分均隨貯藏時間的延長而降低，然而四個貯藏條件下浙貝母感官品質變化存在著明顯差異，與5、10和20 ℃相比，0 ℃下的浙貝母感官變化相對較平穩。貯藏至75 d 時，20 ℃條件下的浙貝母感官評分已經低于14 分，而且表皮已經發生嚴重的霉變，可見其品質已經嚴重劣變，喪失了藥用和經濟價值。而貯藏至90 d 時，0 ℃的感官評分為28 分，其品質狀態良好。方差分析表明，在貯藏過程中，0 ℃與5、10 和20 ℃具有顯著性差異（P<0.05）。可見0 ℃條件可以更好地保持浙貝母的感官品質，從而延長其貨架期。

圖2 不同貯藏溫度下浙貝母感官評分變化Fig.2 Changes in sensory scores of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.3 不同貯藏溫度對浙貝母色澤的影響

如圖3 所示，三個圖（a、b、c）展示了不同貯藏溫度下浙貝母色澤L*、a*、b*的變化趨勢，從圖中可以看出三個指標的變化趨勢有所差異。其中L*值呈現下降的趨勢，貯藏前浙貝母皮的L*值為54.60，在前45 d 四個溫度下浙貝母的L*值下降較快，后期L*值變化緩慢。其中10 和20 ℃下貯藏的浙貝母果皮亮度變化明顯。方差分析表明，0 ℃與5 ℃有顯著性差異（P<0.05），與10 和20 ℃具有極顯著性差異（P<0.01）。圖3b 中，四種條件下的浙貝母a*值呈上升趨勢，與貯藏時間成正相關。貯藏15 d 后，10 和20 ℃條件下的a*值明顯高于0 和5 ℃。表明貯藏溫度越高，浙貝母果皮顏色向紅方向變化越快。方差分析顯示，0 ℃與5 ℃的a*值變化基本無顯著性差異（P>0.05），與10 和20 ℃具有顯著性差異（P<0.05）。圖3c顯示，四個貯藏溫度下的浙貝母的b*值均呈下降趨勢。浙貝母常年生長在泥土里，貯藏前其果皮呈現黃色或淡黃色，而隨著貯藏時間的不斷延長，浙貝母水分喪失愈加嚴重并且出現不同程度的霉變，導致浙貝母的表皮顏色變黑變暗，黃色逐漸衰退，因此b*值不斷下降。其中10 和20 ℃變化較0 和5 ℃明顯（P<0.05），說明溫度越高，浙貝母水分損失越大，浙貝母細胞壁遭受破壞嚴重，增加了果皮的自身色素的氧化分解，從而導致b*值下降[17]。由此可知，0 ℃貯藏可以有效抑制浙貝母色澤的變化從而具有良好的保鮮效果。

圖3 不同貯藏溫度下浙貝母色澤變化Fig.3 Changes in color of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.4 不同貯藏溫度對浙貝母硬度的影響

硬度是評價果蔬品質的重要指標，可以客觀反映果蔬的成熟狀態和品質狀態。不同貯藏溫度下浙貝母的硬度變化見圖4。如圖4 所示，貯藏過程中，浙貝母硬度呈不斷下降的趨勢。貯藏前15 d，0 和5 ℃條件下浙貝母硬度與貯藏前相比無明顯變化，而10 和20 ℃條件下變化較為明顯，可能是因為低溫環境抑制其呼吸作用，降低其新陳代謝，從而更好地維持了浙貝母的硬度。在整個貯藏過程中，0 ℃條件下浙貝母的硬度始終大于其它貯藏條件。方差分析表明，貯藏過程中，0 ℃與5、10 和20 ℃具有顯著性差異（P<0.05），原因可能是低溫環境抑制了浙貝母機體水分的流失，以及蛋白質、多糖等大分子成分的降解，更好地抑制了機體的萎蔫軟化并且更好地保持細胞壁的張力，從而更有利于其硬度的保持。

圖4 不同貯藏溫度下浙貝母硬度變化Fig.4 Changes in hardness of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.5 不同貯藏溫度對浙貝母總多糖含量的影響

多糖是浙貝母中公認的有效成分之一，浙貝母多糖有良好的清除體外自由基的作用，具有較好的抗氧化功效[1-2]，是中草藥研究的重點。如圖5 示，浙貝母多糖含量呈現先增加后減少的趨勢，前30 d，隨著貯藏時間的增加多糖含量呈增加的趨勢，貯藏至30 d 時，四種溫度下的浙貝母多糖含量比貯藏前分別增加了39.70%、40.44%、26.97%和36.41%。可能原因是浙貝母從室外高溫環境轉入室內后，其相對較低的溫度有助于解除浙貝母的休眠[18]，從而促進了多糖的合成。在貯藏30 d 后，多糖含量隨之減少且貯藏溫度越高多糖含量減少越多，并且貯藏至90 d時，在10 和20 ℃下貯藏的浙貝母多糖含量低于貯藏前。可能因為浙貝母在10 和20 ℃條件下呼吸作用強；另外，由感官評價可知，貯藏溫度高更有利于霉菌等微生物的滋生，其在生長過程中以多糖作為營養物質，從而導致多糖含量下降[19]。

圖5 不同貯藏溫度下浙貝母多糖含量變化Fig.5 Changes in polysaccharide content of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.6 不同貯藏對浙貝母總生物堿含量的影響

生物堿是存在于生物體內的含氮有機化合物，大多數存在于植物中。浙貝母中的生物堿，如貝母素甲、貝母素乙、西貝素苷以及蒲貝酮堿等甾體生物堿能夠鎮痛止咳，而且貝母素甲和貝母素乙還具有抗腫瘤功效[20-21]。不同貯藏溫度條件下浙貝母的總生物堿含量變化見表2。

表2 不同貯藏溫度下浙貝母總生物堿含量變化Table 2 Changes in total alkaloid content of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

如表2 所示，隨著貯藏時間的不斷增加，浙貝母總生物堿含量整體上呈不斷增加的趨勢，不同貯藏時間和貯藏溫度下的生物堿含量具有顯著性差異（P<0.05）。與貯藏前相比，在0、5、10 和20 ℃條件下貯藏90 d，浙貝母總生物堿含量分別增加了12.36、7.82、7.08 和6.14 倍。浙貝母在貯藏期間總生物堿含量呈不斷上升的趨勢，可能原因是低溫環境促進了浙貝母休眠期的解除，使其活性恢復[18]。浙貝母適宜的生長溫度是20～25 ℃[22]，貯藏在20 ℃條件下的浙貝母在貯藏15 d 后有芽體產生，其總生物堿含量顯著高于0、5 和10 ℃貯藏條件下的浙貝母（P<0.05）。低溫環境抑制了浙貝母的活性，貯藏在10 和20 ℃條件下浙貝母優先發芽，因此在貯藏前期總生物堿含量較高。在貯藏后期，0 和5 ℃條件下的總生物堿顯著高于10 和20 ℃條件下的總生物堿含量（P<0.05），因為10 和20 ℃貯藏條件下溫度相對較高，浙貝母在此貯藏條件下長時間貯藏，過多的失重和不同程度的發霉變質導致浙貝母生理活性減弱，總生物堿含量不斷下降。

2.7 不同貯藏溫度對浙貝母丙二醛含量的影響

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是由于生物體感官衰老或逆環境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質發生過氧化反應而產生的，是細胞衰老的一種表現[23]。如圖6 可知，貯藏前15 d 浙貝母MDA 含量變化不明顯，其中20 ℃含量最高，達到了2.47 nmol/g，比貯藏前增加了0.75 nmol/g。貯藏到90 d 時，10和20 ℃的浙貝母MDA 值分別是貯藏前的3.15 和3.78 倍。隨著貯藏時間增加浙貝母MDA 含量不斷增加，且表現為溫度越高增加的越多，主要原因是在貯藏過程中浙貝母組織腐爛變質從而導致MDA 含量升高，并且貯藏溫度越高加劇了浙貝母膜脂過氧化[24]。MDA 作為膜脂過氧化的最終產物，其含量的增加能夠抑制細胞保護酶活性和降低抗氧化物的含量，加劇膜脂的過氧化，從而加速浙貝母組織的衰老進程[24]。方差分析表明，0 ℃與10 和20 ℃具有極顯著性差異（P<0.01），與5 ℃有顯著性差異（P<0.05），在整個貯藏過程中0 ℃貯藏條件下浙貝母的MDA含量最低、且變化較為平穩，表明0 ℃貯藏條件有效延緩浙貝母組織的衰老進程，有利于新鮮狀態的保持。

圖6 不同貯藏溫度下浙貝母丙二醛（MDA）含量變化Fig.6 Changes in malondialdehyde content of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

2.8 不同貯藏溫度對浙貝母多酚氧化酶和過氧化物酶活性影響

PPO 是一種含銅氧化酶，能夠催化酚類與O2氧化成醌類，使組織形成褐變，是引起浙貝母褐變的主要原因之一[25]。如圖7a 所示，不同貯藏溫度下的浙貝母PPO 活性呈現先下降后上升的趨勢，且低溫環境明顯抑制了多酚氧化酶活性。在貯藏前15 d，PPO活性呈略微的下降趨勢，原因可能是浙貝母從室外高溫的環境轉移到低溫環境條件下，機體受到低溫刺激而產生應激反應，該趨勢與徐莉等[26]研究的在不同溫度條件下枇杷的PPO 活性變化趨勢相一致。而從貯藏15 d 到90 d PPO 活性不斷升高，貯藏溫度愈高PPO 活性也越高，可能是因為高溫脅迫造成浙貝母組織結構和功能喪失，使結合態PPO 轉變為游離態，從而使其活性增大[27]。方差分析表明，0 和5 ℃無顯著性差異（P>0.05），但0 ℃條件下PPO 活性保持得更低。由此可知，0 ℃較好地抑制了浙貝母的PPO 活性，有利于浙貝母的貯藏保鮮。

圖7 不同貯藏溫度下浙貝母多酚氧化酶（a）和過氧化物酶酶（b）活性變化Fig.7 Changes in polyphenol oxidase activity (a) and peroxidase activity (b) of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

POD 活性與果蔬等的成熟和衰老密切相關，其活性增加代表著果蔬進入衰老階段，成熟度增加，褐變增加[28]。如圖7b 所示，浙貝母的POD 變化呈先降低后增加的趨勢，該趨勢與楊光等[29]的研究結果相一致。貯藏前15 d 可能是浙貝母受到低溫的刺激而導致POD 活性有所下降。15～30 d POD 活性迅速增加。貯藏到60 d 時10 和20 ℃條件下浙貝母POD活性達到最大值，其中20 ℃的POD 活性最高，是貯藏前的2.49 倍。

2.9 不同貯藏溫度對超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶是一類金屬酶,它可以清除組織中活性氧，維持活性氧的代謝平衡，防止細胞遭受超氧陰離子自由基的毒害，保護細胞膜結構的完整和正常生理功能[30]。由圖8 可知，浙貝母的SOD 活性呈先上升后下降的趨勢，該變化趨勢與李志剛等[13]的研究相一致。貯藏前期（45 d），四個貯藏溫度下的浙貝母SOD 活性不斷增大，其活性分別比貯藏前提高了15.35%、11.31%、14.03%和15.82%，而且在此時10 和20 ℃下的浙貝母SOD 活性以達到最大值，這在保護細胞以及延緩細胞衰老發揮了重要作用。上升原因可能是浙貝母從室外高溫被轉移到室內低溫條件下進行貯藏，環境條件的改變使SOD 被激活以抵御外界環境對浙貝母品質的破壞[31]。達到峰值之后，SOD 活性開始下降，可能是在貯藏期間細胞內的活性氧含量不斷升高，細胞內自由基清除系統被破壞，從而導致SOD 活性下降[32]。與5、10 和20 ℃相比，0 ℃條件下的浙貝母SOD 活性保持得更高且變化較為平穩。可見，低溫可以較好地保持SOD 活性，減少超氧陰離子自由基對組織和細胞的破壞。

圖8 不同貯藏溫度下浙貝母超氧化物歧化酶活性變化Fig.8 Changes in superoxide dismutase activity of Fritillaria thunbergii Miq under different storage temperatures

3 結論

從實驗結果可知，不同的貯藏溫度對浙貝母的感官品質、酶活性、多糖含量以及總生物堿含量有顯著的影響，并且在0 ℃條件下浙貝母的各項生理生化指標保持的更加穩定。0 ℃有效抑制了脂膜氧化產物丙二醛含量以及多酚氧化酶和過氧化物酶酶活性的上升，從而延緩了浙貝母的衰老和腐敗進程。與10 和20 ℃相比，0 ℃可以顯著減少貯藏過程中的浙貝母的失重（P<0.05），更好地保持浙貝母的色澤和硬度，從而使其在貯藏過程中保持有更好的感官和質地。在貯藏過程中，四個貯藏溫度下的浙貝母超氧化物歧化酶活性和總多糖含量均呈先上升后下降的趨勢，但是與其他貯藏條件相比，0 ℃更好地保持了SOD 的活性，從而使浙貝母在貯藏期間保持較穩定的氧自由基清除能力從而抑制其脂膜氧化進程，并且有效抑制了總多糖含量的降低從而減少浙貝母的藥用成分的損失。

綜上，適宜的低溫環境可以有效地提高浙貝母的保鮮效果，延長浙貝母的貯藏期。本實驗為解決浙貝母離土貯藏困難的問題，以及下一步浙貝母的貯藏保鮮研究奠定基礎。