維生素K2 單獨及與鈣劑聯合使用對斑馬魚骨骼健康的改善作用及機制研究

孫 怡，夏洪志，牛 堃，李江波，朱宇雷，李古月，尹忠燕

（南通勵成生物工程有限公司，江蘇南通 226010）

骨質疏松是一種常見的骨骼疾病，其特征為骨量下降，骨脆性增加[1]。隨著人口老齡化的加劇，骨質疏松發病率呈逐年上升態勢[2-3]，此外，由其導致的骨折并發炎癥，對中老年人的生活質量、生命安全具有極大的影響[4-5]。現代研究表明，維生素K2可通過激活維生素K 依賴蛋白將無機鈣與有機蛋白結合成骨基質，從而提高骨密度[6-7]。此外，也有研究報道維生素K2對骨質疏松，特別是絕經后骨質疏松具有很好的改善作用，可以減少患者骨量丟失，降低骨折風險[8-11]。現其作為食品添加劑、營養補充劑，已被廣泛用于保健食品、功能食品等。然而，維生素K2及其在與鈣劑聯合用藥時其改善骨質疏松效果及作用機制研究相對較少，缺乏有效的理論支撐。

斑馬魚作為一種脊椎動物，具有胚胎透明易觀察、易飼養、易實現高通量篩選等特點，斑馬魚與哺乳動物在骨發育過程中具有相似的同源性調控因子，如成骨細胞發育涉及Wnt/β-連環蛋白、TGF-β和Hedgehog 信號等關鍵蛋白[12]、參與骨形成的關鍵調控因子包括osterix、runx2a/b、col10a1和骨連接素7 等[13]。因此，由于其基因組和人類基因組的高同源性，且其骨骼發育機制的高度保守性，已成為近年來研究骨骼發育和疾病的重要模式生物[14-15]。

糖皮質激素被廣泛用于骨質疏松動物模型的構建[16-19]，傳統的骨形態觀察方法為化學染色法，常用的染料為茜素紅、鈣黃綠素、阿利新藍等[20-22]，然而，由于其存在操作過程復雜、耗時長、染料穩定性差等問題[23]，對實驗結果的穩定性和真實性具有較大的影響。近年來，隨著基因編輯技術日漸成熟，轉基因品系的實驗動物模型被廣泛用于疾病模型構建，如表達增強綠色熒光蛋白（eGFP）的轉基因斑馬魚Tg（ola.sp7:nlsGFP）已經被研究者用來研究斑馬魚骨骼的發育[19,23]。采用潑尼松龍誘導轉基因品系的斑馬魚骨質疏松模型，可導致斑馬魚細胞外基質、成骨細胞和破骨細胞相關基因表達發生異常，可視化觀察到斑馬魚骨骼熒光面積及熒光光密度的降低，從而實現抗骨質疏松活性成分的高通量快速評價[24-25]。

因此，本文基于潑尼松龍誘導的斑馬魚骨質疏松模型，研究維生素K2單獨使用及與鈣劑聯合使用，對骨質疏松斑馬魚骨骼發育狀態的改善作用，以及其對斑馬魚成骨細胞、破骨細胞、細胞間質等關鍵基因表達水平的影響，為維生素K2及與鈣劑聯合用于抗骨質疏松時的作用機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色熒光標記成骨細胞轉基因斑馬魚Tg（ola.sp7:nlsGFP）幼魚 山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺孵化；維生素K2（純度80%）、D3油（質量濃度25000 μg/mL）、氯化鈣 南通勵成生物工程有限公司自制；潑尼松龍、依替膦酸二鈉 源葉生物科技有限公司；FastPure?cell/tissue total RNA isolation Kit V2、HiScript?II Q RT supermix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ universal SYBR qPCR master mix 試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

DP2-BSW 圖像采集系統 日本Olympus 公司；AXIO ZOOM.V16 體視熒光顯微鏡 德國Carl Zeiss 公司；DS-200 高速組織搗碎機 江蘇江陰科研儀器廠；Centrifuge 5804 R 超低溫離心機 德國Eppendorf 股份有限公司；C1000 TouchPCR 儀 伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；Forma 3111 型水套式CO2培養箱 美國Forma 公司；斑馬魚養殖飼養設備 北京愛生科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚胚胎的獲取 斑馬魚的養殖和繁殖參照Westerfield 法[26]。取卵前一日，雌雄魚分開，定時喂以人工顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲無節幼體（Artemia nauplii）。照明14 h/黑暗10 h 交替進行，第2 d 光照開始前將雌雄魚（1:2 或1:1）并池，光照后獲得受精卵。對受精卵進行消毒和洗滌后移入斑馬魚胚胎培養用水（含5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4）中，28 ℃下控光培養。

1.2.2 維生素K2及與鈣劑聯合使用的抗骨質疏松活性評價 參考 Huang 等[23]報道的方法，并對造模濃度進行了優選，具體評價方法如下：選用健康成骨細胞綠色熒光標記的轉基因斑馬魚（ola.sp7:nlsGFP）作為實驗對象，在胚胎發育至1 dpf 時，使用1.0 mg/mL鏈酶蛋白酶E 溶液脫去卵膜，在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚幼魚，移入24 孔培養板中，設置空白對照組（Control）、模型組（PD）、陽性對照組和各藥物處理組。各實驗組用水均為胚胎培養用水，除空白對照組不加入潑尼松龍處理外，其余各實驗組均加入質量濃度為7.5 μmol/L 的潑尼松龍溶液。陽性對照組（ED）加入質量濃度為100 μg/mL 的依替膦酸二鈉溶液處理，D3和CaCl2聯合處理陽性對照組（D3+CaCl2）加入質量濃度為0.5 μg/mL 的D3溶液以及質量濃度為2 mg/mL 的氯化鈣溶液。維生素K2藥物處理組設置低、中、高三濃度，低濃度處理組（VK-1）維生素K2的濃度為5 μg/mL，中濃度處理組（VK-2）維生素K2的濃度為10 μg/mL，高濃度處理組（VK-3）維生素K2的濃度20 μg/mL。D3、鈣劑和維生素K2聯合處理組也設置低（D3+CaCl2+VK-1）、中（D3+CaCl2+VK-2）、高（D3+CaCl2+VK-3）三濃度，在加入質量濃度為0.5 μg/mL 的D3、2 mg/mL 的氯化鈣的基礎上，分別加入質量濃度為 5、10 和20 μg/mL 維生素K2，每組10 條斑馬魚，同時設置2 個復孔，加培養水至2.0 mL。然后加蓋，分別將各實驗組斑馬魚置于光照培養箱（28 ℃）讓胚胎繼續發育至5 dpf，使用麻醉劑麻醉斑馬魚，顯微鏡下觀察斑馬魚熒光細胞情況并拍照，利用Image-Pro Plus 軟件計算斑馬魚頭部骨骼中成骨細胞熒光面積和熒光密度，利用GraphPad Prism 6.0 軟件對結果進行統計，根據公式（1）計算藥物處理的相對改善骨骼健康能力。

1.2.3 維生素K2及與鈣劑聯合使用的抗骨質疏松作用機制研究 按照1.2.2 中的給藥方案處理斑馬魚后，收集斑馬魚，用PBS 清洗斑馬魚幼魚3 次，去除表面殘留，收集各組斑馬魚幼魚，按照總RNA 提取試劑盒說明書要求，進行總RNA 提取，測定RNA 濃度，采用反轉錄試劑盒，將RNA 逆轉錄為cDNA，隨后進行Real-time PCR 擴增，擴增條件為：95 ℃預變性10 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40 個循環。以β-actin 為內參基因，檢測alp、runx2a、sox9a、bmp2b、bmp4、opg、rank1、trap、ctsk、vdrb、sparc、colla2基因的表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列設計Table 1 Primer sequence list

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析，實驗結果表示為平均值±標準誤差（xˉ±SEM）。組間差異比較采用單因素方差（one-way ANOVA）進行顯著性分析。P<0.05 認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 維生素K2 及與鈣劑聯合使用的抗骨質疏松活性評價

發育5d 的斑馬魚幼魚，頭部骨骼主要由軟骨、腦顱和咽骨架三部分構成[27]，其中麥可爾軟骨（mandible，MD）、鰓條骨（branchiostegal rays，BR）、匙骨（cleithrum，CB）和鰓蓋骨（opercle）為早期骨化評價指標[27]。維生素K2及與鈣劑聯合使用對骨質疏松斑馬魚頭部骨骼發育的影響如圖1 所示，由斑馬魚頭部骨骼表型圖可知，潑尼松龍可抑制斑馬魚頭部骨骼MD、BR、CB 以及opercle 的發育，通過加入維生素K2及與鈣劑復合物，可以直觀觀察到斑馬魚頭部骨骼熒光面積和熒光亮度的變化。D3和CaCl2組合物可加速斑馬魚頭部鰓條骨發育，在實驗濃度條件下，可觀察到4 條鰓條骨，維生素K2在濃度為20 μg/mL 時也有相同的效果，此外，維生素K2與D3和CaCl2聯合使用時，該復合物對鰓條骨以及匙骨發育呈現明顯促進作用，隨著維生素K2濃度的增高，可明顯觀察到斑馬魚鰓條骨數量從三條增加到六條、匙骨熒光亮度明顯增強。

圖1 維生素K2 及與D3 和CaCl2 聯合用藥對斑馬魚骨骼發育的影響Fig.1 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on osteoblast development of zebrafish

通過對斑馬魚頭部骨骼的熒光面積和熒光密度的數據進行統計，可以更加客觀地評價維生素K2及與D3和CaCl2聯合使用的抗骨質疏松活性。藥物對斑馬魚頭部骨骼熒光面積、熒光密度的影響如圖2、圖3 所示，由實驗結果可知，PD 模型組與Control組相比，斑馬魚成骨細胞熒光面積（P<0.0001）和熒光密度明顯減少（P<0.0001），表明由潑尼松龍誘導的骨質疏松模型成功；與模型組相比，陽性對照組依替膦酸二鈉、D3和CaCl2組合物均能顯著提高斑馬魚成骨細胞熒光面積（P<0.05，P<0.0001）和熒光密度（P<0.001），表明模型結果可信。在實驗濃度范圍內，維生素K2及與D3和CaCl2聯合使用能顯著改善由潑尼松龍誘導的斑馬魚成骨細胞熒光面積（P<0.05）和熒光密度減少（P<0.001），且呈現出一定程度的劑量依賴性。此外，維生素K2通過與D3和CaCl2組合物聯合使用，發揮協同效應，使其骨骼細胞熒光面積顯著強于空白對照組（P<0.0001），在維生素K2濃度為20 μg/mL 時，其與D3和CaCl2聯合使用可使斑馬魚成骨細胞熒光強度顯著增強（與空白組相比，P<0.001），結合表型圖結果可知，維生素K2與鈣劑組成的復合物對斑馬魚骨骼熒光面積和熒光密度顯著增強與鰓條骨的快速發育以及匙骨熒光密度增強有關。該現象也出現在淫羊藿素處理的鐵過載誘導的骨質疏松斑馬魚中，其可顯著促進斑馬魚骨骼發育[28]。淫羊藿素為臨床上常用于骨質疏松疾病治療的淫羊藿的有效成分，結果表明，維生素K2與D3和CaCl2聯合使用表現出極強的抗骨質疏松活性。

圖2 維生素K2 及與D3 和CaCl2 聯合用藥對斑馬魚成骨細胞熒光面積影響的統計結果Fig.2 Statistical results of the effect of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on fluorescence area of zebrafish osteoblasts

圖3 維生素K2 及與D3 和CaCl2 聯合用藥對斑馬魚成骨細胞熒光密度影響的統計結果Fig.3 Statistical results of the effect of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on fluorescence density of zebrafish osteoblasts

各實驗組的相對改善骨骼健康能力的測定結果如圖4 所示，在實驗濃度范圍內，維生素K2單獨處理可使骨質疏松斑馬魚骨骼狀態恢復到與正常斑馬魚發育狀態的60%～87%左右，D3和CaCl2組合物對斑馬魚骨骼狀態的改善能力約是空白組的2 倍，維生素K2與D3和CaCl2聯合使用可顯著提升改善骨骼健康的能力，約是空白組的4 倍左右，結果進一步證明維生素K2與D3和CaCl2聯合使用可充分發揮協同效果。

圖4 各給藥組的相對改善骨骼健康能力統計結果Fig.4 Statistical results of relative ability to improve bone health in each administration group

2.2 維生素K2 及與鈣劑聯合使用的抗骨質疏松作用機制研究

以成骨細胞發育相關的基因alp、runx2a、sox9a、bmp2b、bmp4為檢測因子，測定各藥物組對斑馬魚成骨生成相關基因表達水平的影響，結果如圖5 所示，由實驗結果可知，在實驗周期內，造模藥潑尼松龍可以顯著下調斑馬魚機體內alp、bmp2a和bmp4基因的表達（P<0.01），顯著提升runx2a和sox9a基因的表達（P<0.0001），可能的原因為機體對潑尼松龍導致的runx2a和sox9a基因過度抑制從而產生的一種補償效果。D3和CaCl2組合物可以顯著改善潑尼松龍對alp和bmp2a基因抑制效果（P<0.001），顯著抑制潑尼松龍導致的runx2a和sox9a基因上調（P<0.0001）。維生素K2以及維生素K2與D3和CaCl2聯合使用，在實驗濃度范圍內可以顯著改善潑尼松龍對alp和bmp2a基因抑制效果（維生素K2濃度為20 μg/mL 組除外）（P<0.05），顯著抑制潑尼松龍導致的runx2a和sox9a基因上調（P<0.0001）。此外，維生素K2在5～10 μg/mL 時，可以顯著提升潑尼松龍導致的bmp4基因的下調（P<0.05）。ALP 活性的高表達是成骨細胞分化成熟的早期標志[20]，bmp2a和bmp4為成骨細胞分化過程中關鍵因子[29]，因此，維生素K2通過逆轉潑尼松龍導致的成骨細胞生成相關的alp、bmp2a和bmp4基因下調，從而改善骨形成狀態。

圖5 維生素K2 及與D3 和CaCl2 聯合用藥對斑馬魚成骨發育相關基因的影響Fig.5 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on genes related to osteogenesis in zebrafish

以斑馬魚破骨生成相關基因opg、rank1、trap、ctsk為評價指標，測定維生素K2及與鈣劑聯合處理對其表達水平的影響，結果如圖6 所示，由實驗結果可知，在實驗周期內，造模藥潑尼松龍可以顯著促進斑馬魚機體內opg、rank1、trap和ctsk基因的表達（P<0.01），D3和CaCl2組合物可以顯著抑制潑尼松龍對opg和ctsk基因上調效果（P<0.0001）。在實驗濃度范圍內，維生素K2及與D3和CaCl2聯合用藥可顯著改善潑尼松龍對rank1基因上調效果（P<0.01），維生素K2單獨給藥可顯著改善潑尼松龍對ctsk基因上調效果（P<0.01），在維生素K2及與D3和CaCl2聯合用藥濃度為20 μg/mL 才能顯著改善潑尼松龍對ctsk基因上調效果（P<0.0001）；維生素K2在濃度為5 μg/mL 時可顯著改善潑尼松龍對opg基因上調效果（P<0.0001），當維生素K2及與D3和CaCl2聯合用藥時，其在藥物濃度為5 μg/mL 時表現出更強的下調opg基因表達水平的能力（P<0.0001）。此外，維生素K2通過與D3和CaCl2聯合用藥，在低濃度組處理時（5 μg/mL）可以顯著改善潑尼松龍導致的trap基因的上調（P<0.01）。破骨細胞是維持骨穩態的重要指標[24]，TRAP 是鑒定破骨細胞的關鍵因子[20]，潑尼松龍可誘導破骨細胞分化激活，從而導致上調opg、rank1、trap、ctsk基因表達，從而導致骨質疏松。因此，維生素K2通過抑制破骨細胞激活相關基因的表達，從而調節骨吸收狀態。

圖6 維生素K2 及與D3 和CaCl2 聯合用藥對斑馬魚破骨發育相關基因的影響Fig.6 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on genes related to osteoclast development in zebrafish

以斑馬魚細胞外基質中骨鈣化相關基因vdrb、sparc、colla2為檢測指標，各基因表達水平結果如圖7 所示，由實驗結果可知，在實驗周期內，造模藥潑尼松龍可以顯著抑制斑馬魚機體內vdrb、sparc和colla2基因的表達（P<0.0001），D3和CaCl2組合物可以顯著改善潑尼松龍對vdrb基因下調效果（P<0.05）。在實驗濃度范圍內，維生素K2可顯著提升vdrb（維生素K2濃度為20 μg/mL 組除外）、sparc和colla2基因表達水平（P<0.01），維生素K2及與D3和CaCl2聯合用藥后在低濃度時就可顯著改善潑尼松龍導致的colla2基因表達下調（P<0.0001），然而，聯合用藥后，僅在中濃度組可促進vdrb基因表達上調（P<0.05），在低濃度組可促進sparc基因表達上調（P<0.01）。vdrb是一種維生素D 受體轉錄因子，能調節體內鈣或磷酸鹽的吸收，sparc和colla2基因不僅參與骨形成，還能夠促進游離鈣離子結合能力，恢復和維持骨骼礦化，加快骨重建[16,24]，因此，維生素K2抗骨質疏松活性的發揮離不開其上調細胞外基質中骨鈣化相關基因vdrb、sparc、colla2表達的能力。

圖7 維生素K2 及與D3 和CaCl2 聯合用藥對斑馬魚細胞外基質骨鈣化相關基因的影響Fig.7 Effects of vitamin K2 alone and in combination with D3 and CaCl2 on genes related to bone calcification in extracellular matrix of zebrafish

綜上，維生素K2及與D3和CaCl2聯合使用，通過調節骨形成、骨吸收、細胞外基質間轉錄因子的動態平衡，發揮抗骨質疏松作用。

3 結論

本文通過對不同濃度維生素K2及其與鈣劑聯合處理下，骨質疏松斑馬魚的成骨細胞熒光面積、熒光密度以及成骨細胞生成、破骨細胞生成、抑制細胞外基質中骨鈣化相關基因表達水平的變化，進行分析比較，明確維生素K2在5～20 μg/mL 安全濃度范圍內，能顯著改善由潑尼松龍誘導的斑馬魚成骨細胞熒光面積和熒光密度的降低，其與D3和CaCl2聯合使用時，發揮協同作用，顯著促進斑馬魚成骨細胞熒光面積的增多。維生素K2可通過促進成骨細胞生成相關的alp、bmp2a和bmp4基因的表達、抑制破骨細胞生成相關的opg、rank1、trap、ctsk基因的表達以及促進細胞外基質中骨鈣化相關基因vdrb、sparc、colla2表達從而發揮抗骨質疏松活性。

維生素K2與骨組織代謝息息相關，其不僅對骨形成具有促進作用，還可以對骨吸收起到抑制作用，還能調節細胞外基質因子，從而維持骨發育動態平衡，其單獨或是與其他鈣劑聯合使用，對潑尼松龍誘導的骨質疏松具有很好的改善效果。當前后疫情時代，國民健康意識顯著提升，健康預防理念更加深入人心，此外，隨著人口老齡化的加劇，骨健康類產品需求將呈現上升態勢，因此，維生素K2作為一種安全的食品添加劑和功能原料，單獨使用或是與鈣劑聯合使用，作為抗骨質疏松和改善骨骼健康的保健食品、功能食品的功能因子，將有廣闊的市場前景，本文研究結果將為促進骨骼生產健康產品的研發提供理論基礎。