人參葉通過抑制細胞活性氧的積累延緩皮膚衰老

張慧娥，杜連云，初孟瑤，宋欣宏，葉 萍，王恩鵬,

（1.長春中醫藥大學，吉林長春 130117；2.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091）

皮膚衰老是一個復雜過程，取決于各種內在和外在因素。衰老最基礎的內在因素包括性別、種族和遺傳變異[1]。外在因素包括紫外線輻射和空氣污染，一些慢性疾病以及生活方式選擇等[2]。太陽輻射是導致皮膚老化和皮膚疾病的最關鍵的外在因素，超過80%的面部皮膚老化是由于輕度慢性紫外線暴露所致，其主要特征表現為特征包括粗糙皺紋、面色蠟黃并伴有斑駁色素沉著以及皮膚失去彈性[3]。引起皮膚老化的機制主要包括活性氧（ROS）、mtDNA 遺傳物質突變、染色體的端粒縮短以及內分泌激素變化的作用[4]。其中皮膚衰老的關鍵因素之一是活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累誘發的氧化應激造成細胞衰老[5]。此外，UVB 輻射可引起皮膚中ROS 的增加，導致皮膚老化[6]。目前，抗衰老已成為現代生命科學研究領域的一個重要課題，研究表明，人參可多方面調節老化的分子機制，達到延緩老化的作用。

人參作為人參屬（五加科）植物根的多年生植物，幾千年來被廣泛用作特色中藥[7]。人參皂苷作為核心的藥理成分，具有多種藥理活性，例如鎮痛，抗氧化，抗腫瘤和抗老化等性質[8]。人參葉作為人參加工副產物，往往在收獲過程中被廢棄，將人參葉作為化妝品原材料是因為人參葉中活性成分與人參根部成分相似，部分成分甚至高于人參根，其萃取物具有較強的抗衰老、抗輻射、抗皺活性，該部分的有效應用，將極大地增加企業經濟收入，擴大人參的應用范圍，降低企業生產成本。大量文獻發現人參葉中含有大量的人參皂苷，具有抗衰老作用[9]，但作用機制尚不清楚。本研究基于網絡藥理學分析藥物的分子機理，通過分子對接預測目標靶點結構和結合位點，結合細胞實驗對氧化損傷指標測定和主要分子機制驗證，挖掘人參葉治療皮膚衰老的主要成分、作用靶點和相關通路，旨在為人參葉的合理利用和后續的相關護膚產品的研究與開發奠定基礎，提供科學依據。研究步驟見圖1。

圖1 研究步驟流程圖Fig.1 Flow chart of steps in the study

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人皮膚永生角質形成細胞（HaCaT 細胞）中南大學湘雅醫學院中心實驗室提供；人參葉 吉林省撫松縣萬良鎮購買；HaCaT 專用培養基（含10% FBS）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（T1300-100 mL）北京索萊寶科技有限公司；磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、RPMI1640 培養基、二甲基亞砜（DMSO）、青霉素-鏈霉素混合液 美國Gibco 公司；增強型細胞活力檢測試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8）、ROS 熒光法試劑盒、總蛋白定量測試盒（BCA 法）、細胞ROS 檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；RIPA 細胞裂解液、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、環氧合酶-2（COX-2）試劑盒、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）試劑盒 南京建成生物工程研究所；一抗（ERK/JNK/PERK/P-JNK）、二抗（種屬兔）武漢三鷹生物技術有限公司。

YJ-875 無菌超凈工作臺 江蘇凈化設備廠；CO2培養箱 新加坡ESCO 公司；UVB 光療儀（峰值312 nm）荷蘭PHILIPS 公司；5804R 高速離心機 德國Eppendorf 公司；BT25S 天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SLK-O3000-S 搖床 東方化玻（北京）科技有限公司；TRACE 1310 GCTriple Quadrupole MS 型氣相色譜串聯質譜儀（GCMS）美國Thermo Fisher 公司；A11B S025 粉碎機德國IKA 儀器設備有限公司；Infnite M200 PRO酶標儀 瑞士Tecan 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參葉樣品的制備 人參葉45 ℃烘干粉碎過100 目篩，取粉末100 g，依次以95%乙醇、70%乙醇及水超聲提取，料液比1:20，超聲40 min，超聲功率350 W，濾液離心過濾后合并，減壓濃縮濾液至適量，冷凍干燥得粗提物[10]。經GC-MS 方法對其化學成分進行分析，與NIST 11 標準圖庫比對，根據相關研究設置待測樣品備用[11]。

1.2.2 數據庫數據篩選

1.2.2.1 人參葉活性成分與靶點篩選 按照類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 且口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%的篩選條件從TCMSP 數據庫中鑒定人參葉活性物質[12]。將有效物質的作用靶點輸入UniProtKB 數據庫中相應的基因名稱，并篩選人類基因（Homo sapiens）（圖2）。

圖2 實驗中的數據庫和軟件信息Fig.2 Database and software information in the experiment

1.2.2.2 人參葉治療皮膚衰老潛在靶點的獲取 利用GeneCards 和OMIM 數據庫[13]，檢索“skin aging”關鍵詞，消除重復靶點，藥物的活性成分與疾病靶點相匹配。使用在線繪圖軟件繪制維恩圖以根據人參葉的活性成分確定潛在的抗衰靶點。

1.2.2.3 PPI 網絡分析與關鍵靶點獲取 將得到的常見抗衰靶點以基因的形式導入STRING 數據庫，分析蛋白質之間的相互作用，得到人參葉治療皮膚衰老核心靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖。物種選擇為“Homo sapiens”，選擇最小相互作用值>0.4 的PPI。隱藏自由點，下載PPI 圖形，并另存為“tsv”格式[14]。

1.2.2.4 構建藥物-成分-靶點-疾病-通路網絡 應用Cytoscape 軟件（3.7.0 版）構建藥物和疾病靶點的網絡圖，顯示人參葉與各種衰老靶點的關系，探討人參葉的抗衰老作用機制。

1.2.2.5 GO 功能富集和KEGG 通路分析 將有效物質與衰老相關共同靶點輸入DAVID 數據庫，進行GO 和KEGG 富集分析，將數據按P值由小至大，依次排序[15]。ImageGP 在線繪制柱狀圖和氣泡圖。

1.2.3 分子對接 從蛋白質數據庫獲得目標蛋白質的晶體結構。對篩選后的關鍵活性成分和核心靶標進行分子對接驗證。通過PyMOL 軟件優化蛋白受體，對接前去除連接的配體、雜原子和水分子。所得分子配體和蛋白受體通過AutoDock（版本1.5.6）軟件進行對接和可視化，并記錄每個組分的單獨對接能量值[16]。

1.2.4 實驗分組與造模 將人皮膚永生角質形成細胞分為空白組（Control）、UVB 光損傷模型組（Model）、人參葉組和陽性對照Vitamin A 組。采用UVB 光療儀造模。HaCaT 細胞以1.0×104個/孔接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養24 h，將原有的HaCaT 細胞培養液棄掉，加入200 μL PBS 緩沖液。UVB 照射組采用UVB 光療儀照射，UVB 光療儀平行放置于細胞上方，與細胞距離10 cm，照射前預熱30 min，照射劑量分別為0、96、240、480、720、960、1440、1920 mJ/cm2，每個劑量設置6 個復孔。照射結束后將PBS 更換為無血清1640 培養基繼續培養24 h 后每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃，5% CO2孵育1 h，450 nm 處測定HaCaT 細胞存活率，將細胞存活率為正常細胞存活率50%的UVB 劑量作為后續實驗照射劑量[17]。

1.2.5 HaCaT 細胞培養

1.2.5.1 細胞衰老模型建立 將HaCaT 細胞置于含有10%胎牛血清和青鏈霉素各100 U/mL 的RPMI 1640 培養液中，10 cm2無菌培養皿培養，37 ℃、5%CO2條件下在細胞培養箱中進行細胞培養，UVB 光療儀進行HaCaT 細胞光損傷模型建立，照射時間分別選定0、20、50、100、120、150、200、300、400 s。照射后各孔吸除PBS 緩沖液，加入200 μL 新鮮培養液，置于培養箱內24 h 后，每孔添加20 μL CCK-8溶液，培養箱中孵育4 h，37 ℃振蕩10 min，在570 nm處測定吸光值（A），計算不同UVB 輻射劑量下的細胞生存率。選擇細胞生存率為50%左右的藥物濃度和UVB 輻射劑量進行后續實驗[18]。

1.2.5.2 CCK-8 法檢測細胞活力 實驗分別分為空白組和給藥組（此處的細胞均為正常細胞培養后實驗，未給予UVB 光療儀治療）（人參葉0～500 mg/L），給藥組分別用不同濃度的人參葉孵育細胞，24 h 后，除去原培養基，加入10 μL 含CCK-8 的培養基，繼續培養1 h，用酶標儀測定450 nm 吸收光度，重復三次[19]。

1.2.5.3 抗氧化能力指標檢測 參考文獻[20]并加以修改，將HaCaT 細胞每孔約1×106個接種于6 孔板上，設空白組、UVB 照射組及不同濃度藥物組（12.5、25、50 mg/L）、維生素A 為陽性對照，每組3 個平行。培養24 h 后各組分別棄掉舊培養液，加入2 mL PBS 緩沖液，UVB 照射后（照射劑量0.72 J/cm2），各孔吸除PBS 緩沖液，分別加入2 mL不同濃度含藥培養液（空白組加入新鮮培養液），置于5% CO2、37 ℃條件下培養24 h 后，吸除上清液，用PBS 沖洗2 次，重新用300 μL PBS 緩沖液懸浮，于液氮和室溫反復凍融3 次，待細胞破碎完全，用刮刀將細胞刮下，移至EP 管中，10000 r/min 離心15 min，收集細胞上清液分裝，立即檢測或-80 ℃冰箱保存。將收集好的細胞上清液分別按照SOD、MDA、COX-2、MMP-9ELISA 試劑盒的操作步驟嚴格進行測定。

1.2.5.4 活性氧含量測定 HaCaT 細胞培養、不同濃度人參葉孵育及UVB 模型組處理同1.2.5.1，用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（2',7'-dichlorofuorescin diacetate，DCFH-DA）熒光探針檢測細胞內的ROS水平。參考試劑盒用緩沖液按1:1000 稀釋DCFHDA，棄去無血清RPMI1640 培養基，用PBS 洗滌3 次，加入1 mL DCFH-DA，采用熒光酶標儀于488/525 nm 處測定熒光強度或者在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度差異。

1.2.5.5 免疫印跡驗證 收集細胞樣品，按照細胞數目加入適量RIPA 裂解液，放置于冰上裂解15 min，4 ℃條件下，10000 r/min 離心15 min，收集細胞上清液，以BCA 法檢測上清液中蛋白濃度。樣品中與適量SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫后用移液器加入到10% SDSPAGE 凝膠的上樣孔內，80 V 電壓下電泳15 min，后調至130 V，繼續電泳約90 min，轉印至PVDF 膜上。轉膜完畢后，封閉液室溫下封閉1 h。加入（抗兔）一抗（1:2000），搖床震蕩約20 min，4 ℃孵育過夜，次日，回收一抗，TBST 沖洗3 次，每次10 min。加入適量（抗兔）二抗（1:5000），常溫下搖床震蕩1 h，TBST 沖洗3 次，每次10 min。ECL 法顯色，GIS 凝膠圖像分析系統照相，Image J 圖像分析軟件分析[21]。

1.3 數據處理

采用SPSS 21.0 軟件和GraphPad Prism 7 進行統計分析，其中多組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和t檢驗，數據以平均值±標準差（X±SD）表示，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 人參葉活性成分的篩選

按照OB≥30%和DL≥0.18 的標準，從TCMSP數據庫中篩選出人參葉中9 個有效成分，見表1。

表1 活性成分Table 1 Active components

2.2 成分靶點與疾病靶點的預測

從TCMSP、Drugbank 數據庫檢索到162 個中藥有效成分靶點，并通過OMIM、GeneCards 數據庫獲取848 個與衰老相關的基因。通過韋恩圖在線繪圖對藥物與疾病靶點進行交叉分析，獲得了人參葉中94 個治療衰老的潛在有效靶點，見圖3。

圖3 藥物-疾病交集靶點Venn 圖Fig.3 Venn diagram of drug-disease common targets

2.3 構建PPI 網絡與獲取核心蛋白

通過STRING 數據庫獲得了人參葉治療皮膚衰老潛在作用靶點的相互作用關系，將其導入Cytoscape 3.7.0 進行可視化分析，見圖4。該網絡包含94 個功能蛋白，具有1732 種相互作用關系，以節點度值為評價標準，數值越高，說明在網絡中扮演著越重要的角色。其中degree 排名前5 的核心靶點分別為AKT1、JUN、TP53、TNF、EGFR。

圖4 基于人參葉抗衰老作用靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡Fig.4 Protein-protein interaction（PPI）network based on targets of ginseng folium on anti-aging

2.4 藥物-成分-靶點-疾病-通路網絡構建

將篩選的4 個有效組分及94 個共有靶點輸入Cytoscape 3.7.0 軟件，構建藥物-成分-靶點的相互作用網絡圖，圖中共有136 個節點，589 條邊，紫色是中藥人參葉，綠色是其活性物質，橙色為通路，淺藍色為藥物與疾病的共有靶點，連線是藥物與活性物質、作用目標、疾病之間的相互影響關系。節點的大小代表degree 的大小，節點越大代表該節點在網絡中處于核心的位置（圖5）。根據度值選取谷甾醇、槲皮素、人參皂苷Rh2、山萘黃素作為人參葉關鍵抗衰老化合物進行后續分析。

圖5 “藥物-成分-靶點-疾病”的相互作用網絡Fig.5 “Drug-active component-target-disease” interaction network

2.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

使用DAVID 進行GO 和KEGG 分析，GO 富集分析結果見圖6，生物過程主要涉及到基因表達的正調控、RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、信號轉導等方面；細胞組分主要涉及到細胞外空間、質膜、細胞溶質等位置；分子功能主要涉及到蛋白結合、酶結合、蛋白質同源二聚化活性、蛋白激酶結合等過程。以P<0.05 作為篩選條件，KEGG 通路分析篩選出前10 條通路（圖7），由圖7 可知，94 個共有靶點主要富集在MAPK 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、P53 信號通路、叉頭轉錄因子（FoxO）信號通路、細胞衰老信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、癌癥等多種疾病通路上。KEGG 通路結果表明人參葉可以調控多方面通路，從不同角度來干預機體衰老過程，其主要通路包括MAPK 信號通路、PI3K-AKT信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路等相關通路。

圖6 GO 功能富集分析Fig.6 GO functions enrichment analysis

圖7 KEGG 通路富集分析氣泡圖和圈圖Fig.7 Bubble plot and cycle diagram of the KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接分析

綜觀文獻發現，以結合能（-5.0 kcal/mol）作為指標來判斷結合情況，其中能量越低，配體和受體的構象越穩定。通過分子對接發現，有效成分與核心靶點結合能力的絕對值小于10 kcal/mol。結果表明，人參葉和衰老疾病靶點結合良好，人參葉的活性成分可作用于核心靶點，從而發揮抗氧化、抗炎、調節免疫等多種藥理作用，以達到抗衰老的效果（表2 和圖8）。

圖8 核心靶點與化合物分子對接結果Fig.8 Molecular docking results of core targets and compounds

2.7 CCK-8 檢測細胞活性

如圖9A，在0～500 mg/mL 濃度的細胞活性測定中，其中0～100 mg/L 范圍內，HaCaT 細胞無明顯的細胞毒性（細胞存活率均>90%），在該濃度范圍內藥物對細胞是安全的。圖9B 中細胞存活率隨 UVB輻射劑量的增加呈遞減趨勢，因此后續實驗選取細胞活力抑制50%時的照射劑量0.72 J/cm2。圖9C 在安全范圍內選取人參葉（12.5、25、50 mg/L）3 個濃度進行實驗，結果顯示UVB 照射處理細胞后引起細胞存活率的明顯降低（P<0.01），人參葉（12.5 mg/L 除外）及陽性藥維生素A 能夠提高HaCaT 細胞存活率（P<0.01），不同濃度人參葉可從不同程度上減少UVB照射對細胞的損傷。

圖9 不同濃度人參葉對HaCaT 細胞存活率的影響Fig.9 Effects of different concentrations of ginseng folium on cell viability of HaCaT cells

2.8 人參葉對細胞抗氧化指標的影響

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（COX-2）等酶類抗氧化劑和幾種過氧化物酶可降低植物的氧化損傷[22]。本研究用UVB 光療儀造成HaCaT 細胞衰老模型后給予人參葉治療后，與空白組比較，UVB模型組的SOD 含量顯著降低（P<0.05），MDA 水平顯著上升（P<0.01）；而與UVB 模型組比較，給藥組及陽性對照組的SOD 含量明顯增高，MDA 含量明顯下降，結果表明給藥組可提高細胞中抗氧化酶活力，抑制脂質過氧化物產生達到保護HaCaT 細胞（圖10A～B）。與空白組細胞對比，UVB 模型組的COX-2、MMP-9 水平顯著升高（P<0.05）；而與UVB模型組比較，給藥組及陽性藥Vitamin A 處理后細胞中COX-2、MMP-9 總體水平顯著降低（P<0.05），表明給藥組能通過降低細胞內環氧合酶-2 及基質金屬蛋白酶-9 的活性來保護HaCaT 細胞（圖10C～D）。圖11 證明了UVB 可以增加細胞內活性氧的水平，增加了細胞的氧化應激，而不同濃度的人參葉則可以不同程度的降低細胞內總活性氧的含量，對細胞起到保護作用。

圖10 不同濃度人參葉對UVB 照射HaCaT 細胞內SOD（A）、MDA（B）、COX-2（C）和MMP-9（D）的影響Fig.10 Effects of different concentrations of ginseng folium on SOD (A),MDA (B),COX-2 (C) and MMP-9 (D) in HaCaT cells irradiated by UVB

圖11 人參葉抑制UVB 誘導的HaCaT 細胞氧化損傷Fig.11 Ginseng folium inhibits UVB-induced oxidative damage in HaCaT cells

2.9 通路預測靶點的免疫印跡驗證

AKT1、JUN、TP53、TNF、EGFR 等基因與MAPK信號通路有著密切的聯系，它們都是MAPK 信號通路中的關鍵調節分子或作用靶點[23]。ERK 和JNK均為MAPK 信號通路中的重要分支，與MAPK 信號通路有緊密聯系[24]。AKT1 與ERK 信號通路能夠相互作用，AKT1 可以直接磷酸化激活ERK，從而參與調節細胞增殖、代謝、存活等生物學過程。JUN是JNK 的靶基因，JNK 可以通過磷酸化激活JUN，并調控其轉錄活性，從而影響細胞凋亡、分化等過程[25]。TP53 和ERK/JNK 信號通路之間的關系則比較復雜，一方面，TP53 可以抑制細胞增殖，通過抑制ERK/JNK 等MAPK 信號通路的激活，防止細胞惡性增殖；另一方面，TP53 還可以參與調節ERK/JNK等分支的激活，從而調節基因表達，進而影響細胞生長、分化和凋亡等生物學過程[26]。TNF 是JNK 分支的上游調節因子，可以通過激活JNK 分支參與調節免疫應答、發炎反應等生物學過程。同時，TNF 也可以引發ERK 分支的激活，從而參與調節細胞增殖和存活等生物學過程[27]。EGFR 則是ERK 信號通路的靶基因，EGFR 的激活能夠引發ERK 分支的激活，參與調節細胞增殖、分化等生物學過程[28]。與空白組比較，模型組p-ERK、ERK、p-JNK、JNK 相對表達水平升高（P<0.05），而給藥組均可降低模型組p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 的蛋白表達水平（P<0.01），這說明人參葉可抑制MAPK 信號通路的激活，從而起到抗衰老作用（圖12）。

圖12 p-ERK/ERK 和p-JNK/JNK 蛋白表達Fig.12 Protein expression of p-ERK/ERK and p-JNK/JNK

3 討論與結論

本研究結合網絡藥理學、分子對接和實驗驗證，系統分析了人參葉抗衰老的潛在機制，構建了“藥物-成分-靶點-疾病”關系網絡，預測了主要有效物質、潛在靶點和信號通路。另外，山柰酚能夠調節Ca2+代謝平衡，提高線粒體膜電位等方式最終抑制凋亡[29]。槲皮素處理可以顯著增強線粒體生物發生和氧化磷酸化，并抑制與線粒體有關的細胞凋亡[30]。谷甾醇和人參皂苷具有免疫調節、抗輻射、抗衰老、清除自由基等作用，能有效地保護皮膚免受日光的傷害，具有良好的延緩皮膚衰老作用[31-32]。人參皂苷Rh2 可以通過保護細胞、抑制衰老基因表達、改善線粒體功能、控制炎癥反應等方式延緩人體的衰老進程[33]。活性氧與衰老之間的關系備受關注，許多研究表明，細胞內活性氧水平的增加與衰老有關。活性氧的過量生成會導致細胞結構和功能損傷，從而促進衰老進程[34]。本研究中，人參葉的作用可以減少細胞內活性氧產生，從而延緩細胞衰老。

綜上所述，人參葉可以間接有效地調控谷甾醇、槲皮素、山奈酚、人參皂甙Rh2 等抗衰老活性成分作用AKT1、JUN、TNF、TP53、EGFR 等相關通路上的靶點，調控機體的抗氧化活性。細胞體外驗證發現人參葉可以改善細胞抗氧化水平，抑制細胞內活性氧（ROS）的產生，有效抑制UVB 引發的紫外線損傷，發揮抗衰老的藥理作用，這為以人參葉為原料的抗衰老類護膚品方面的應用提供了一定的理論依據。