魚鰾與驢皮的化學成分及對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠的改善作用

孫皓巖，胡淑曼，魏寶紅,，馬曉青,，楊文哲，劉 佳，楊 雪,,，邱培菊,

（1.中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室，醫(yī)藥學院，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島 266071）

貧血是臨床中常見的疾病之一，患者通常表現(xiàn)為頭暈、乏力、困倦、面色蒼白，由于貧血發(fā)病周期長，發(fā)展緩慢，常常不為人們察覺，這種疾病影響著世界上四分之一以上的人口并且發(fā)病人群廣[1]，對人們的生活質(zhì)量造成一定的影響。在中醫(yī)學中貧血屬于“血虛”“血枯”的范疇，多與氣血不足，臟腑失養(yǎng)相關(guān)[2]，自古針對補血藥材多有記載，其中不乏各種動物膠類如驢皮膠、牛皮膠、龜甲膠等[3-4]，深受人們喜愛。

我國是海洋大國，海洋生物資源豐富，隨著近年對海洋資源的開發(fā)愈加重視，許多海產(chǎn)品受到消費者的關(guān)注，其中海洋膠類逐漸進入大家的視野。魚鰾藥用歷史悠久，味甘、咸，性平，歸腎、肝、脾、胃經(jīng)，具有滋補肝腎，補精益陽，補氣養(yǎng)血，活血止血，解毒斂瘡等功效[5]，其與燕窩、魚翅齊名，為“海洋八珍之一”，素有“海洋人參”之美譽，是一味海洋滋補上品[6-7]。魚鰾不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、少量的脂肪和糖類物質(zhì)，還含有豐富的無機元素、維生素等[8-10]。目前，已上市的魚鰾產(chǎn)品如魚鰾補腎丸、固本延齡丸等中成藥，多以補腎固精功效為主。當前魚鰾主流產(chǎn)品為藥用典籍中記載的黃魚鰾，及非藥用典籍的鳘魚鰾和鱈魚鰾，前期課題組比較了上述3 種魚鰾提取制備的魚鰾膠對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠的改善作用，發(fā)現(xiàn)三種基原的魚鰾膠對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠的紅細胞、血紅蛋白、血小板、網(wǎng)織紅細胞等血液學指標及胸腺、脾臟系數(shù)均有不同程度的改善作用，其中鳘魚鰾膠改善效果最佳。

作為海洋膠類代表的魚鰾，現(xiàn)多是對其營養(yǎng)價值的研究，尚未有關(guān)魚鰾系統(tǒng)的化學成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。因此，本文對鳘魚鰾的總蛋白、氨基酸組成及膠原蛋白等化學成分進行了研究，評價了其對貧血小鼠的血液學指標及臟器系數(shù)的改善作用，并與陸地代表膠類驢皮膠進行比較。通過本文研究，以期為后續(xù)闡明魚鰾藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及開發(fā)具有海洋特色的魚鰾補血類產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳘魚鰾 產(chǎn)地山東省青島市；驢皮 產(chǎn)地山東省聊城市；胃蛋白酶（酶活力≥400 U/mg）、濃縮膠（5%）、分離膠（8%）北京索萊寶科技有限公司；人I 型膠原蛋白（COLI）ELISA 試劑盒 美國Peprotech 公司；氨基酸混合標準品 和光純藥工業(yè)株式會社；溴化鉀（KBr）光譜純，Sigma 公司；葡聚糖系列標準品（相對分子質(zhì)量分別為180、2700、5250、9750、13050、36800、64650、135350 Da）中國食品藥品檢定研究院；環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；無水乙醇、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、冰醋酸、考馬斯亮藍、甲醇、檸檬酸鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；RBC、HGB、PLT、RET 血液學測試試劑包 濟南希森美康醫(yī)用電子有限公司；SPF 級昆明小鼠 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，40 只，體重18～22 g，雄性，生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0003。

K9840 凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；MS 105DU 型電子天平 上海梅特勒-托利多公司；SCIENTZ-18N 凍干機 寧波新芝生物科技股份有限公司；LA8080 型氨基酸自動分析儀 日本株式會社日立高新技術(shù)科技；FA-1004 電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；BR4I 型離心機、Nicolet iS5 傅里葉紅外變換光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific；UV-6000PC 紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；DF-68 15T 型粉末壓片機 武漢鼎福匯聚科技有限公司；Chirascan q CD 圓二色譜儀 英國Applied PhotoPhysics 公司；Aglient 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；VORTEX GENIUS 型渦旋混合器 德國IKA 公司；H1650-W型臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚鰾、驢皮總蛋白分析 參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法凱氏定氮法[11]測定魚鰾、驢皮中總蛋白含量。

1.2.2 魚鰾、驢皮氨基酸組成分析 參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》方法[12]分別對魚鰾、驢皮的氨基酸組成進行分析。

1.2.3 魚鰾膠、驢皮膠分子量分析

1.2.3.1 魚鰾膠、驢皮膠提取制備 分別稱取適量魚鰾、驢皮，剪成小塊，加30 倍量水回流提取4 d，提取液4000 r/min 離心10 min，取上清液，減壓濃縮后冷凍干燥，獲得魚鰾膠、驢皮膠干膏。

1.2.3.2 魚鰾膠、驢皮膠分子量分布考察 采用凝膠色譜法[13]測定魚鰾膠、驢皮膠分子量范圍：分別稱取系列葡聚糖標準品、魚鰾膠、驢皮膠干膏適量，精密稱定，加0.1 mol/L 的Na2SO4溶液溶解，配制成5 mg/mL 的溶液，用0.22 μm 水相微孔濾膜過濾，得對照品溶液及魚鰾膠和驢皮膠供試品溶液。精密吸取上述對照品溶液及供試品溶液各20 μL 液相分析，采用TSKgel GMPWXL（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，以0.1 mol/L 的Na2SO4溶液為流動相，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，示差檢測器（RID）檢測。以保留時間為橫坐標（X），分子量對數(shù)為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程：Y=-0.51X+12.95，R2=0.9937，計算魚鰾膠、驢皮膠峰位分子量及分子量分布。

1.2.4 魚鰾、驢皮膠原蛋白分析

1.2.4.1 魚鰾、驢皮膠原蛋白提取制備 參考文獻[14]的方法分別稱取魚鰾、驢皮各20 g，剪碎加蒸餾水泡發(fā)，按質(zhì)量比1:30 加入預(yù)冷的0.1 mol/L NaOH處理48 h，用來去除非膠原成分，再用冰水沖洗至中性。加入30 倍體積預(yù)冷的pH7.4 的0.5 mol/L EDTA 處理48 h，用來去除礦物質(zhì)，用冰水沖洗至中性；25000 r/min 勻漿10 min 后，將其混懸于150 倍體積含0.1 g/100 mL 胃蛋白酶的0.5 mol/L 冰醋酸中，攪拌提取48 h。提取液10000 r/min 離心30 min，上清液迅速用6 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH7.5，邊攪拌邊向其緩慢加入磨細的NaCl 粉末，至NaCl 終濃度為2.6 mol/L，待NaCl 全部溶解，靜置過夜，10000 r/min離心30 min，沉淀加適量0.5 mol/L 的冰醋酸復溶，10000 r/min 離心30 min，取上清液透析（MD31：0.1～0.5 kDa）除鹽，先用0.1 mol/L 的冰醋酸透析過夜，換去離子水透析72 h，期間換水數(shù)次，獲得的透析液轉(zhuǎn)至凍干盤，冷凍干燥，分別獲得魚鰾、驢皮膠原蛋白。

1.2.4.2 魚鰾、驢皮膠原蛋白含量測定 采用人I 型膠原蛋白（COLI）ELISA 試劑盒測定魚鰾、驢皮膠原蛋白含量。稱取魚鰾、驢皮膠原蛋白配制成質(zhì)量濃度10 mg/mL 的膠原溶液，上樣前稀釋100 倍。收集細胞培養(yǎng)液的上清液進行COLI 的ELISA 檢測，將陰性對照組及待檢測樣品（每個樣品各3 組平行）加入96 孔板，每孔100 μL。繪制標準曲線并在450 nm波長下觀察標準品及魚鰾、驢皮膠原蛋白樣品的吸光度，計算Ⅰ型膠原蛋白的濃度。

1.2.4.3 魚鰾、驢皮膠原蛋白氨基酸組成分析 同1.2.2。

1.2.4.4 魚鰾、驢皮膠原蛋白SDS-PAGE 電泳 參考Laemmli[15]的方法，分別稱取魚鰾、驢皮膠原蛋白適量，精密稱定，加0.5 mol/L 乙酸溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的膠原溶液，用6 mol/L NaOH 中和至pH7.0，10000 r/min 4 ℃離心30 min，取30 μL上清液，加10 μL 4%上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），混勻后，煮沸5 min，冷卻后再次離心，取10 μL 上樣進行SDS-PAGE 電泳。聚丙烯酰胺凝膠由5%濃縮膠（pH6.8），8%分離膠（pH8.8）組成。電泳結(jié)束后將膠條置于三氯乙酸溶液中固定15 min，染色1 h（染色液為0.1%考馬斯亮藍R-250-甲醇-冰醋酸，體積比9:9:2），隨后脫色（脫色液為冰醋酸-甲醇-水，體積比1:1:8）至膠條上的條帶清晰可見即可。

1.2.4.5 魚鰾、驢皮膠原蛋白紫外全波長掃描分析分別稱取魚鰾、驢皮膠原蛋白適量，精密稱定，加0.5 mol/L 乙酸溶解，配制成2 mg/mL 的膠原溶液，于4 ℃下10000 r/min 離心30 min，取上清液作為供試品溶液，以0.5 mol/L 乙酸溶液為空白對照，用紫外分光光度計在200～400 nm 范圍內(nèi)進行紫外掃描。

1.2.4.6 魚鰾、驢皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜分析 分別稱取魚鰾、驢皮膠原蛋白適量，與光譜純KBr 混合放在瑪瑙研缽中研磨成細粉。取適量混合樣品至壓片機中壓片，將樣品置于樣品室。用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在400～4000 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描，分辨率設(shè)置為2 cm-1。

1.2.4.7 魚鰾、驢皮膠原蛋白圓二色譜分析 分別稱取魚鰾、驢皮膠原蛋白適量，精密稱定，加0.5 mol/L乙酸溶解，配制成2 mg/mL 的膠原溶液，于4 ℃下10000 r/min 離心30 min，取上清液作為供試品溶液，以0.5 mol/L 乙酸溶液為空白對照，采用圓二色譜儀于10 ℃進行光譜掃描，比色光程為1 mm，帶寬0.5 nm，掃描波長范圍為190～260 nm。

1.2.5 魚鰾膠、驢皮膠對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠的改善作用

1.2.5.1 造模及給藥方案 依據(jù)小鼠體重隨機進行分組，分為正常對照組（n=10）和環(huán)磷酰胺處理組（n=30）。對環(huán)磷酰胺處理組連續(xù)4 d 腹腔注射80 mg/kg 環(huán)磷酰胺，造貧血模型，正常組腹腔注射等量的生理鹽水。造模完成后，環(huán)磷酰胺處理組依據(jù)小鼠體重隨機分為3 組，分別為模型組，魚鰾膠和驢皮膠給藥組［根據(jù)人用生藥劑量10 g/（60 kg·d），換算成小鼠給藥劑量為魚鰾膠1.52 g/（kg·d）、驢皮膠1.39 g/（kg·d）］。魚鰾膠、驢皮膠給藥組灌胃給藥，每天1 次，共給藥28 d。正常對照組和模型組給予相同體積的純水。

1.2.5.2 指標檢測 實驗期間每周稱量一次小鼠體重。給藥結(jié)束后進行眼球后靜脈叢取血，全自動模塊式血液體液分析儀分析外周血紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）、網(wǎng)織紅細胞（RET）等血液學指標。頸椎脫臼處死小鼠（動物倫理審批號：YTU22WT-P06）解剖取出脾臟和胸腺，剝離周圍脂肪組織、結(jié)締組織，并用濾紙吸去其表面附著的血液，使用精密電子天平稱取脾臟和胸腺的質(zhì)量，按照下列公式計算脾臟和胸腺系數(shù)：臟器系數(shù)（%）=臟器質(zhì)量/體重×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用均值±標準差表示，采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行t檢驗及方差分析。P<0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01 代表差異極顯著，采用GraphPad Prism 8.0 進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚鰾、驢皮總蛋白分析結(jié)果

蛋白質(zhì)是人體重要的組成部分，是生命的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。膠類物質(zhì)含有豐富的蛋白質(zhì)，因此具有較高的營養(yǎng)價值，根據(jù)測定結(jié)果顯示魚鰾、驢皮總蛋白含量分別為98.00%±0.19%和97.60%±0.21%。

2.2 魚鰾、驢皮氨基酸組成分析結(jié)果

魚鰾、驢皮均含有17 種氨基酸，其總量分別為79.97 g/100 g 和77.07 g/100 g（見表1）。魚鰾和驢皮氨基酸組成相似，含有的蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸7 種必需氨基酸含量占總氨基酸含量的比例分別為17.53%和17.44%，與文獻報道中魚鰾[8]和驢皮[16]的總氨基酸含量和必需氨基酸占比基本一致。而且，二者均以甘氨酸含量最高，谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸含量也相對較高。據(jù)報道，甘氨酸是血紅素合成底物之一，有很好的造血功能[17-18]；谷氨酸能夠提高機體免疫功能[19-20]；丙氨酸通過參與白細胞的代謝影響免疫功能[20]；精氨酸具有免疫調(diào)節(jié)作用，也能夠促進生育、生長發(fā)育及創(chuàng)傷愈合[21]；脯氨酸對保護免疫系統(tǒng)細胞有一定的作用[20]。在魚鰾和驢皮中，甘氨酸含量分別為20.60、19.70 g/100 g，谷氨酸含量分別為8.85、8.86 g/100 g，丙氨酸含量分別為10.10、7.66 g/100 g，精氨酸含量分別為7.44、6.73 g/100 g，脯氨酸含量分別為9.91、11.10 g/100 g，5 種氨基酸總含量達54.00 g/100 g 以上。除以上氨基酸外，其他少量氨基酸如天冬氨酸、絲氨酸等能通過不同的途徑發(fā)揮著調(diào)節(jié)機體免疫力的作用[20]，由此推測魚鰾和驢皮可能具有補血和增強免疫的功能。

表1 魚鰾、驢皮的氨基酸組成（g/100 g）Table 1 Amino acid composition of swim bladder and donkey skin (g/100 g)

2.3 魚鰾膠、驢皮膠分子量分布考察結(jié)果

分子量分布考察結(jié)果如圖1 和表2，顯示魚鰾膠分子量范圍在50 Da～205 kDa 之間，峰位分子量約為12 kDa；驢皮膠分子量范圍在50 Da～328 kDa 之間，峰位分子量約為14 kDa；魚鰾膠峰位分子量及分子量范圍均小于驢皮膠，推測魚鰾膠可能比驢皮膠容易被機體吸收。

表2 魚鰾膠、驢皮膠分子量分布結(jié)果Table 2 Molecular weight distribution results of swim bladder glue and donkey skin glue

圖1 魚鰾膠、驢皮膠分子量分布圖Fig.1 Molecular weight distribution of swim bladder glue and donkey skin glue

2.4 魚鰾、驢皮膠原蛋白含量、組成及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.4.1 魚鰾、驢皮膠原蛋白含量 結(jié)果顯示魚鰾、驢皮膠原蛋白提取物得率分別為96.14%、28.80%，采用試劑盒法測定提取物中膠原蛋白含量分別為55.01%±0.12%、28.59%±0.09%，經(jīng)計算魚鰾、驢皮中膠原蛋白含量分別為52.88%±0.12%、8.12%±0.09%，胃蛋白酶輔助提取法更高效率地提取了魚鰾膠原蛋白，魚鰾中膠原蛋白含量約為驢皮中膠原蛋白的6.51 倍。

2.4.2 魚鰾、驢皮膠原蛋白氨基酸組成分析 魚鰾與驢皮膠原蛋白的氨基酸組成如表3 所示，組成差異較小，均以甘氨酸的含量最高，占總氨基酸含量的26%以上，分別為14.70、16.20 g/100 g。甘氨酸對于維持膠原蛋白的超螺旋結(jié)構(gòu)具有重要作用，可存在于超螺旋結(jié)構(gòu)的中心且不會發(fā)生鏈變形，使得α-螺旋緊密堆積在一起，形成具有疏水性的超螺旋結(jié)構(gòu)[22-23]。此外，天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸含量也相對較高，而胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸含量相對較低，以上氨基酸組成結(jié)果符合Ⅰ型膠原蛋白特征。

表3 魚鰾、驢皮膠原蛋白的氨基酸組成（g/100 g）Table 3 Amino acid composition of swim bladder collagen and donkey skin collagen (g/100 g)

2.4.3 魚鰾、驢皮膠原蛋白SDS-PAGE 電泳 魚鰾、驢皮膠原蛋白SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖2，魚鰾、驢皮膠原蛋白中主要含有1 條135 kDa 左右的α-鏈，以及由α-鏈的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)形成的二聚體β鏈和三聚體γ鏈，譜圖特征與報道的Ⅰ膠原蛋白[24-26]特征基本一致，可推斷提取膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。

圖2 魚鰾、驢皮膠原蛋白的SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis pattern of swim bladder collagen and donkey skin collagen

2.4.4 魚鰾、驢皮膠原蛋白紫外全波長掃描結(jié)果分析 蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜是蛋白質(zhì)中紫外生色基團加和導致，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm 處有最大吸收峰[24]，這是由于芳香族氨基酸色氨酸殘基吲哚環(huán)和酪氨酸殘基的酚基引起的[26]，而Ⅰ型膠原蛋白的特征吸收峰一般在230 nm 附近，這主要與膠原多肽鏈中含有-C=O、-COOH、CO-NH2等生色團有關(guān)，由C=O的n→π 躍遷所產(chǎn)生。根據(jù)紫外吸收圖譜（圖3）可知魚鰾、驢皮膠原蛋白紫外最大吸收波長分別在233、232 nm，與楊子帆等[26]測定的魚鰾膠原蛋白和楊霞等[27]提取的驢皮膠原蛋白的紫外最大吸收波長基本一致，符合Ⅰ型膠原蛋白的特征吸收特點，在280 nm附近存在微弱的吸收，推測可能因少量的芳香族氨基酸引起的，以上結(jié)果說明魚鰾、驢皮膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白。

圖3 魚鰾、驢皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectrum of swim bladder collagen and donkey skin collagen

2.4.5 魚鰾、驢皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜結(jié)果分析 根據(jù)傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果（圖4），發(fā)現(xiàn)魚鰾、驢皮膠原蛋白在酰胺A、B 以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶均可觀察到明顯的特征峰：分別在3323.49、3335.09 cm-1有吸收，是由分子中N-H 伸縮振動與氫鍵締合引起，是酰胺A 帶吸收峰，證明了分子中氫鍵的存在；分別在2936.14、2929.76 cm-1處有吸收峰，是由于-CH2-的不對稱伸縮振動引起的，是酰胺B 帶吸收峰；酰胺Ⅰ帶、Ⅱ帶和Ⅲ帶可以直接反映蛋白多肽鏈的構(gòu)象，根據(jù)文獻報道，1600～1700 cm-1之間是由于C=O 伸縮振動引起的酰胺帶的特征吸收峰，是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的特征區(qū)域[28]，而魚鰾、驢皮膠原蛋白均在1653.45 cm-1有特征吸收峰，是酰胺Ⅰ帶的吸收峰，表明膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)較好；魚鰾、驢皮膠原蛋白分別在1557.64、1558.38 cm-1處有吸收峰，是由于C-N 伸縮振動或N-H 彎曲振動所反應(yīng)的吸收帶，是酰胺Ⅱ帶的吸收峰；分別在1238.09、1239.73 cm-1處有吸收峰，是酰胺Ⅲ帶的吸收峰，也是膠原蛋白的紅外光譜特征吸收峰，這是由于膠原蛋白中甘氨酸和亞氨基酸形成的（Gly-Pro-Hyp）結(jié)構(gòu)引起的[29-30]。

圖4 魚鰾、驢皮膠原蛋白的紅外吸收光譜圖Fig.4 FTIR spectrum of swim bladder collagen and donkey skin collagen

2.4.6 魚鰾、驢皮膠原蛋白圓二色譜結(jié)果分析 圓二色譜分析結(jié)果如圖5 所示，魚鰾、驢皮膠原蛋白分別在208、198 nm 附近有明顯的負吸收峰，在221 nm附近有正吸收峰，具有典型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色譜特征峰型；魚鰾膠原蛋白負峰位置在208 nm附近，而驢皮及其他來源的膠原蛋白負峰一般在198 nm 附近[31-32]，可能是由于魚鰾膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)較其他膠原蛋白更緊密[33]。由表4 可知，魚鰾、驢皮膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)差別較大，魚鰾膠原蛋白以α-螺旋為主，驢皮膠原蛋白以β-折疊中的反平行為主。

表4 魚鰾、驢皮膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)分布（%）Table 4 Secondary structure distribution results of swim bladder collagen and donkey skin collagen (%)

圖5 魚鰾、驢皮膠原蛋白的圓二色譜圖Fig.5 Far-UV CD spectra of swim bladder collagen and donkey skin collagen

2.5 魚鰾膠、驢皮膠對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠的改善作用研究結(jié)果

2.5.1 對小鼠體重的影響 實驗觀察期間各組小鼠精神狀態(tài)良好，進食飲水排便正常。與正常對照組比較，各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，體重明顯降低（P<0.01），隨后逐漸恢復并穩(wěn)步增加，各給藥組小鼠體重變化無統(tǒng)計學差異（圖6）。

圖6 魚鰾膠、驢皮膠對小鼠體重的影響Fig.6 Effects of swim bladder glue and donkey skin glue on body weight of mice

2.5.2 對小鼠器官系數(shù)及血液學指標的影響 表5結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠脾臟系數(shù)顯著升高（P<0.01），胸腺系數(shù)顯著降低（P<0.01），提示小鼠在注射環(huán)磷酰胺后產(chǎn)生免疫抑制，胸腺萎縮，免疫功能下降，同時脾臟代償性造血呈現(xiàn)肥大，脾臟體積增大；模型組小鼠RBC、HGB、PLT 顯著降低（P<0.01，P<0.05），代表骨髓抑制后，造血功能被破壞，血液攜氧能力下降；RET 顯著升高（P<0.01），可能因骨髓抑制刺激而提前進入外周血，造成增加異常[34]，綜合臟器系數(shù)和血液學指標的變化說明小鼠貧血造模成功[3]。與模型組相比，魚鰾膠給藥組脾臟系數(shù)顯著降低、胸腺系數(shù)顯著升高（P<0.05），且胸腺系數(shù)接近正常組水平，RBC、HGB、PLT、RET 顯著改善（P<0.05），且HGB、PLT 指標接近正常對照組水平，無統(tǒng)計學差異；與模型組相比，驢皮膠給藥組胸腺系數(shù)顯著升高（P<0.05），趨近于正常對照組水平，RBC、HGB 顯著升高（P<0.05），但略低于正常對照組水平。相比驢皮膠組，魚鰾膠給藥組小鼠血液學指標改善顯著，且胸腺增大和脾臟萎縮癥狀均有所緩解，整體評價魚鰾膠對貧血的改善作用優(yōu)于驢皮膠。

表5 魚鰾膠、驢皮膠對小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、血液學指標的影響Table 5 Effects of swim bladder glue and donkey skin glue on the indexes of spleen,thymus and hematology in mice

3 結(jié)論

本文對魚鰾、驢皮進行了系統(tǒng)的化學成分研究，發(fā)現(xiàn)二者總蛋白含量豐富均達97%以上，氨基酸組成差異較小，均以與補血、免疫相關(guān)的甘氨酸及谷氨酸等為主；魚鰾膠分子量相對較小，推測魚鰾膠更易被機體吸收；魚鰾中膠原蛋白含量豐富，約為驢皮中膠原蛋白的6.51 倍，二者均為Ⅰ型膠原蛋白，但三螺旋結(jié)構(gòu)差異較大，魚鰾膠原蛋白以α-螺旋為主，驢皮膠原蛋白以反平行為主。

本實驗采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建立小鼠貧血模型，給藥28 d 后，與模型組相比，魚鰾膠、驢皮膠組小鼠胸腺系數(shù)均顯著升高（P<0.05），說明二者能夠明顯逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺造成的胸腺萎縮情況，提高機體免疫及造血功能；魚鰾膠組小鼠脾臟系數(shù)顯著降低（P<0.05），說明魚鰾膠對骨髓造血的功能起到了一定程度的改善，脾臟的代償性造血減少，脾臟體積逐步恢復，而驢皮膠組小鼠脾臟系數(shù)改善不顯著；魚鰾膠給藥組血液學指標RBC、HGB、PLT、RET 均得到顯著改善（P<0.05），驢皮膠給藥組RBC、HGB 顯著改善（P<0.05）。以上研究結(jié)果證明魚鰾膠、驢皮膠均可促進環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠造血機能的恢復，且魚鰾膠效果優(yōu)于驢皮膠；結(jié)合化學成分比較，二者的分子量大小、氨基酸、膠原蛋白含量及膠原蛋白結(jié)構(gòu)存在較大的不同，推測可能是二者補血活性差異的主要原因，其補血、免疫功效是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，具體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制還有待深入研究。