基于兩次發酵法遵義特色泡辣椒游離氨基酸組成的主成分分析及綜合評價

許九紅，王修俊,3, ，聶黔麗，李佳敏，胡榮念，張 露

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州大學辣椒產業技術研究院，貴州貴陽 550025）

辣椒（Capsium annumL.）是一種全球種植和消費的辛香蔬菜作物[1]，富含辣椒素、維生素C、多酚等營養成分[2-4]，具有抗菌、除濕、祛寒等功效[5]，鑒于全球對辣椒的高商業需求，辣椒的加工方式也越來越多樣化，可發酵、炒制、干燥等[6]，其中泡辣椒作為西南地區特有的調味佳品[7]，以其獨特的風味、鮮嫩的味道和增食欲、助消化的功效深受廣大消費者的喜愛。

游離氨基酸（free amino acids，FAAs）作為主要的味覺活性化合物之一，不僅是一種重要的營養物質，同時也是重要的呈香物質，表現出鮮、甜、酸、苦及澀等味感，這些味感形成了食物豐富的味覺層次[8-11]。因此，明確泡辣椒中游離氨基酸種類、含量以及呈味特性，對提高泡辣椒加工制品的營養與品質具有重要意義。近年來，已有學者對泡辣椒中的風味成分變化[12-14]、發酵菌劑制備[15]、發酵技術進行了大量研究[16-17]，但由于泡辣椒是地方特色食品，作坊式生產居多，目前大多以傳統自然一次發酵法為主，發酵周期長，發酵過程不穩定，導致產品品質差異大[18]，從而制約了泡辣椒的工業化生產。而遵義特色泡辣椒是首先通過傳統自然一次發酵的高鹽環境解決泡辣椒半成品的脆度、色澤等問題，使首次發酵工藝可控化且能達到更好的保鮮效果，進一步通過接菌二次強化發酵明顯縮短發酵周期，提升泡辣椒半成品的品質和風味，從而有效解決了遵義泡辣椒傳統自然一次發酵加工技術中泡辣椒品質不穩定，風味不足以及潛在的食品安全問題。但是目前對于兩次發酵遵義特色泡辣椒風味品質的文獻報道甚少，對于進一步推動兩次發酵技術廣泛應用于辣椒加工行業缺乏足夠的數據和理論支撐。

為此本研究以遵義新鮮紅辣椒為原料，以本團隊前期研究得到的特色泡辣椒最佳兩次發酵工藝為基礎，比較分析遵義特色泡辣椒發酵過程中脆度、色澤、氨基酸態氮及游離氨基酸的綜合變化，并運用主成分分析兩次發酵泡辣椒中游離氨基酸的品質，以期為兩次發酵技術實際應用提供更全面的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

遵義新鮮紅辣椒 花溪區農貿市場；食鹽、蔗糖食品級，花溪區沃爾瑪超市；氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀 食品級，連云港景悅食品配料有限公司；氨基酸混合標準品日本和光藥業株式會社；濃鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、磺基水楊酸（均為分析純）、鈣標準溶液、甲醛（36%～38%）天津科密歐化學試劑有限公司；戊糖乳桿菌Lps5106、植物乳桿菌Lpm5122、發酵乳桿菌LF-8002[19]發酵菌種均選自本研究團隊前期分離保存的優勢菌株。

FA2002B 型電子精密天平 上海越平科學儀器有限公司；S-433D 氨基酸自動分析儀 日本日立公司；Allegra X Centrifuge 冷凍離心機 Beckman Coulter；CT310K 物性測定儀 北京盈盛恒泰科技責任有限公司；全自動HP-2136 便攜式色差儀 上海臨嘉科教儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡辣椒的制備 操作要點：將遵義新鮮紅辣椒（CG）清洗晾干后進行傳統自然一次發酵（料液比1:1.5，17%食鹽、0.5%氯化鈣、0.01% D-異抗壞血酸鈉）得到傳統自然一次發酵30 d 泡辣椒半成品（SF-1）；在此基礎上分別進行處理，沿用上述工藝發酵得到傳統自然一次發酵150 d 泡辣椒（SF-2）；另進行脫鹽處理，使泡辣椒半成品品質在較好可接受度的基礎上，控制其鹽含量在7%～8%后進行二次強化發酵，控制戊糖乳桿菌Lps 5106、植物乳桿菌Lpm 5122、發酵乳桿菌LF-8002 配比為2:1:1，接種量6%，發酵溫度為30 ℃，強化發酵64 h 得到遵義特色發酵泡辣椒（EF）。工藝流程如圖1 所示。

圖1 遵義特色泡辣椒的制備工藝流程Fig.1 Preparation process of Zunyi characteristic bubble pepper

1.2.2 脆度測定 參照張甫生等[20]的方法，并稍作改動，采用物性測定儀測定，用硬度表征樣品脆度，將辣椒切分成2 cm×2 cm 左右大小，選用TA41 探頭，操作模式選擇壓縮返回模式，預測試速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測試后速度1 mm/s，壓縮比25%，壓縮力5 g。平行測定8 次，取其平均值作為樣品脆度。

1.2.3 色澤測定 使用基于CIEL*、a*、b*均勻色系統的全自動便攜式色差儀對泡辣椒進行色澤的測定，平行測定10 次，取其平均值。△E為色差，表示所測樣品與新鮮紅辣椒樣品之間的色澤的差值，△E值越小則泡辣椒色澤損失越小。

式中：L、a、b：分別為新鮮紅辣椒樣品的亮度值、紅綠度值、黃藍度值；L*、a*、b*：分別為樣品亮度值、紅綠度值、黃藍度值。

1.2.4 氨基酸態氮測定 參考GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》測定。

1.2.5 游離氨基酸的測定 參考何春霞等[21]的方法，取一定量的辣椒樣品勻漿，然后準確稱取1.00 g左右樣品，用50 mL 0.01 mol/L 鹽酸超聲浸提30 min；然后將其搖勻后過濾，準確吸取濾清液2 mL 于離心管中，加入2 mL 8%磺基水楊酸將其混勻靜置15 min后離心（10000 r/min，10 min），將離心后的上清液過0.45 μm 濾膜后上機氨基酸自動分析儀檢測，每組實驗做3 個平行，計算平均值和標準偏差。

1.3 數據處理

利用Excel 2010、SPSS 26.0 軟件對數據分析，Origin 2018 對圖形進行繪制，在相同條件下對每個指標的測定次數不少于3 次，數據記錄方式為平均數±標準差（mean±SD），用不同小寫字母表示P<0.05 的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 泡辣椒中的基本理化指標含量測定分析

脆度、色澤及氨基酸態氮含量與氨基酸雖無直接關系，但是可以衡量泡辣椒發酵情況，是反映發酵產品品質的重要特征指標之一，結果如表1 所示。

表1 泡辣椒中的基本理化指標Table 1 Physicochemical indicators of pickled pepper

由表1 可知，泡辣椒在發酵過程中脆度逐漸降低，首次發酵150 d 后泡辣椒脆度降至2509.00±0.13 g，較新鮮辣椒降低6.09%，而兩次發酵泡辣椒脆度為2578.00±0.04 g，降低3.51%，減少了泡辣椒組織在發酵過程中由于食鹽高滲作用易發生過度軟化的現象，從而保證了泡辣椒的脆性口感。?E值在發酵過程中逐漸增加，首次發酵30 d 后泡辣椒半成品?E值為1.67±0.061，150 d 后?E值增加至1.84±0.043，較30 d 色澤損失9.24%，兩次發酵特色泡辣椒?E值為1.76±0.251，較30 d 色澤損失5.39%，表明兩次發酵泡辣椒的顏色變化不如其他樣品明顯，色澤能較好地保持鮮紅。氨基酸態氮在一定程度上可以反映辣椒原料中蛋白質分解程度，能反映泡辣椒中氨基酸和小分子肽的總體水平，是體現泡辣椒中鮮味物質的重要指標[22]。其中傳統自然一次發酵150 d 泡辣椒中的氨基酸態氮含量在傳統自然發酵一次發酵30 d 的基礎上僅增加0.01 g/100 g，主要原因是處于高鹽環境會抑制微生物的生長，同時也會抑制水解酶的水解反應[23]。而遵義特色泡辣椒中氨基酸態氮含量達到0.24 g/100 g，較新鮮辣椒和傳統自然一次發酵30 d分別增加0.19、0.07 g/100 g，主要是因為脫鹽處理解除了高鹽環境的抑制作用，在乳酸菌的作用下乳酸菌分泌的蛋白水解酶會促進水解蛋白的生成，而發酵環境的酸化會導致水解蛋白水解成多肽和氨基酸，進而提高氨基酸態氮含量的增加[24]，說明二次強化發酵可顯著提高泡辣椒中鮮味物質含量。

2.2 泡辣椒中的游離氨基酸組成及含量變化分析

游離氨基酸的組成、含量及呈味特性對泡辣椒色、香、味的形成具有重要作用。對4 種樣品中游離氨基酸的種類及含量進行檢測分析，結果如表2 所示。

表2 自然與兩次發酵特色泡辣椒中游離氨基酸組成Table 2 Free amino acid composition of characteristic pickled pepper with natural and two-fermentation

由表2 可知，傳統自然一次及兩次發酵遵義特色泡辣椒中共檢測出天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）等16 種游離氨基酸，與尹小慶等[25]報道結果一致。在4 種辣椒中分別檢測到13、15、16、15 種氨基酸，其中包括Thr、Val、Met、Ile、Leu、Lys 6 種必需氨基酸，與Chen 等[11]的檢測結果相類似。從表2 可以看出，不同泡辣椒中游離氨基酸的種類及含量存在較明顯差異，在發酵過程中TAA 變化范圍為7.98～26.50 mg/g，其中兩次發酵特色泡辣椒中游離氨基酸的種類為16 種，TAA 含量達到最高為26.5 mg/g，且Cys 僅在兩次發酵特色泡辣椒中檢測出；傳統自然一次發酵30、150 d 泡辣椒的TAA含量次之，分別為19.58、14.23 mg/g；新鮮辣椒中游離氨基酸的含量最低為7.98 mg/g。相對于新鮮辣椒，自然及兩次強化發酵特色泡辣椒中游離氨基酸的種類及含量均顯著增加（P<0.05），與之前對發酵糖菜的研究相似[26]，本研究中His 含量在發酵前期增加，在自然發酵30 d 后逐漸下降，鑒于游離氨基酸是乳酸菌生長的必要組成部分，發酵后期His 含量的降低可能是由于乳酸菌的作用[11]。

2.3 呈味氨基酸分析

泡辣椒口感清脆鮮爽，與其所含豐富的呈味游離氨基酸有關。由圖2 可知，各泡辣椒的呈味氨基酸組成輪廓相似，其中貢獻最大的是鮮味氨基酸（flavor amino acid，FLA），其次為甜味氨基酸（sweet amino acid，SAA），苦味氨基酸（bitter amino acid，BAA）最低，與張婷等[27]的研究報道一致。兩次發酵特色泡辣椒的模式圖面積最大，說明所含呈味氨基酸普遍高于其他樣品。FLA 相對含量為3.45～16.91 mg/g，兩次發酵特色泡辣椒含量最高，可達16.91 mg/g，占TAA 總量的63.81%，其中Asp 及Glu 兩類鮮味氨基酸閾值較低，Glu 的含量明顯高于其他氨基酸，其在泡辣椒中的主要呈味特點是鮮爽帶甜[28]，能在一定程度上緩解苦澀味，對兩次發酵特色泡辣椒良好滋味的形成具有明顯的提升作用。SAA 相對含量為1.21～5.56 mg/g，其中兩次發酵特色泡辣椒最高，可達5.56 mg/g，占總量的20.98%，Thr、Ser 主要表現為鮮爽甘甜的滋味特征。傳統自然一次發酵30 d 泡辣椒中BAA 含量最高，可達3.04 mg/g，占總量的15.53%。由表2 及圖2 可知，兩次發酵特色泡辣椒中的TAA、EAA、FLA 及SAA 含量均最高，這是由于在二次強化發酵過程中除了蛋白質分解作用產生氨基酸外，還可通過乳酸菌將泡辣椒中的可溶性物質轉化為氨基酸，從而使泡辣椒氨基酸總量升高[26]。

圖2 自然與兩次發酵特色泡辣椒的呈味氨基酸組成模式圖（mg/g）Fig.2 Pattern diagram of flavored amino acid composition of natural and two-fermented characteristic pickled pepper (mg/g)

2.4 滋味活性值（taste activity value，TAV）分析

由圖2 可知，各呈味氨基酸在不同泡辣椒中的含量存在差異，但是各種游離氨基酸所具有不同的呈味特征與其味覺感知閾值有直接關系，高含量的氨基酸對食品風味貢獻不一定大，因此根據各游離氨基酸閾值計算TAV 對泡辣椒呈味氨基酸進行評價[29-30]，TAV 越大，表示其對呈味貢獻越大，當TAV<1 時，該呈味氨基酸對呈味貢獻不大，呈味作用不顯著[31]。傳統自然一次發酵及兩次發酵特色泡辣椒中氨基酸的TAV 見表3。

表3 自然及兩次發酵特色泡辣椒中游離氨基酸TAV Table 3 Free amino acid TAV of natural and two-fermented characteristic pickled pepper

由表3 可知，在4 個樣品中TAV>1 的氨基酸組成成分基本相同，在發酵泡辣椒中Asp、Glu、Ala、Val、His、Arg 的TAV 均大于1，對滋味的貢獻最大，其中Glu 對泡辣椒風味的影響最大，TAV 值在9.67～45.67 之間，是最主要的呈鮮物質，具有增加泡辣椒的鮮美口味、緩解酸與苦澀等味道的特殊功效[32-33]。呈味氨基酸中Ser、Ala 等表現出令人愉悅的甜味，其中Ser 僅在兩次強化發酵特色泡辣椒中TAV 大于1，Ala 和His 的TAV 在發酵泡辣椒中均大于1，對滋味貢獻很大，能有效降低苦味，去除食物中令人不快的口味[34]。在呈味氨基酸中苦味氨基酸的種類最多，但因僅Val、Arg 的TAV 值在泡辣椒中大于1，可在一定程度上增加呈味的復雜性和輔助提升鮮度，同時當苦味氨基酸含量低于閾值時，可有效增強其他呈味氨基酸的呈味效果[35]。總體來看，不同泡辣椒中氨基酸的組成對其風味影響存在差異，表現為Thr、Gly、Met、Leu、Tyr 和Pro 對泡辣椒的整體風味貢獻程度較小，其余各氨基酸Glu、His、Asp、Val、Arg、Ala、Ser、Cys、Ile、Lys 對泡辣椒風味均有不同程度的影響。

2.5 泡辣椒中游離氨基酸主成分分析

2.5.1 主成分分析 通過主成分分析對泡辣椒樣品中游離氨基酸進行綜合評價。利用降維原理，以16 種游離氨基酸指標作為初始自變量，然后將Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、His、Lys、Arg、Pro 數據標準化后依次編號為X1、X2、X3……X15、X16進行主成分分析，結果如表4～表5 所示。

表4 成分特征值、方差貢獻率及累計貢獻率Table 4 Component eigenvalues,variance contribution rate and cumulative contribution rate

表5 主成分特征向量與載荷矩陣Table 5 Eigenvectors and loading matrix of principal components

由表4 可知，經主成分分析共提取了3 個主成分，其中第1 主成分的方差貢獻率最大為54.328%，表明第1 主成分對泡辣椒游離氨基酸品質的影響最大；第2 主成分的方差貢獻率次之為37.660%；第3 主成分的方差貢獻率為6.596%。前3 個主成分的成分特征值均大于1，且累積貢獻率高達98.584%，結合圖3 說明前3 個主成分可解釋絕大部分變量信息，因此選用前3 個主成分已經足夠描述游離氨基酸總體水平。

圖3 主成分分析碎石圖Fig.3 Principal component analysis gravel diagram

主成分載荷系數可以反映出泡辣椒中各氨基酸指標對相應主成分的影響程度和方向，載荷系數絕對值越大則表示該物質對主成分的貢獻越大，當主成分越大時，所包含的這些氨基酸含量就越高，正負代表各變量對相應主成分的影響方向[36]。由表4 及圖4可知，Thr、Glu、Val、Met、Ile、His、Arg 對主成分1 的貢獻最大，其中Glu、Thr、Val、Met、His、Arg 的載荷值均大于0.9 且有正向影響，Ile 有負向影響；Gly、Cys、Leu、Tyr 對主成分2 的貢獻最大，其中Gly、Leu 以及Tyr 的載荷值均大于0.9 且正向影響，Cys 有負向影響；Pro 對主成分3 的貢獻最大，但是其載荷值小于0.8。因此，可認為以上11 種游離氨基酸是各樣品的主要游離氨基酸，對泡辣椒的風味有主要的貢獻作用。

圖4 泡辣椒樣品游離氨基酸的PCA 載荷圖Fig.4 PCA load diagram of free amino acids in pickled pepper

2.5.2 基于泡辣椒游離氨基酸主成分分析的綜合評價 根據表4、表5 以3 個主成分代表16 種游離氨基酸所表達的信息，建立游離氨基酸品質的評價模型，得到線性關系方程表達式如下，其中F1、F2、F3表示各個主成分的綜合得分。

以每個主成分對應方差貢獻率作為權重，對3個主成分得分進行加權求和，由評價函數F=0.543F1+0.377F2+0.660F3計算各樣品的綜合評分，綜合得分高低反映樣品游離氨基酸綜合品質的高低，通過計算得到結果見表6。

表6 泡辣椒各主成分得分及綜合得分Table 6 Principal component scores and comprehensive scores of pickled pepper

由表6 可知，第1、2、3 主成分中得分最高的分別為樣品3、樣品3、樣品2，說明這三個成分對兩次發酵特色泡辣椒的影響最大。根據綜合得分F 值可以看出各樣品的品質差異較大，綜合得分最高為兩次發酵特色泡辣椒，其次是首次發酵30 d 泡辣椒半成品，然后是傳統自然一次發酵150 d 泡辣椒，新鮮辣椒得分最低。因此可認為兩次發酵特色泡辣椒游離氨基酸綜合品質更好。

3 結論

本文研究了兩次發酵遵義特色泡辣椒的品質評價指標及游離氨基酸含量、組分和呈味特性分析，結果表明兩次發酵遵義特色泡辣椒在發酵過程中脆度逐漸降低，?E值逐漸增加，氨基酸態氮含量較其他辣椒高，傳統自然一次發酵及兩次發酵特色泡辣椒中游離氨基酸組成存在顯著差異（P<0.05），TAA 含量為7.98～26.5 mg/g，兩次發酵特色泡辣椒中呈味氨基酸普遍高于其他樣品，其中鮮味氨基酸占TAA 總量的63.81%，進一步通過主成分分析得到谷氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸對泡辣椒滋味影響程度大，并由各個主成分的綜合得分得到遵義特色泡辣椒綜合得分最高，綜合評價分析可得兩次發酵遵義特色泡辣椒相較于新鮮與傳統自然一次發酵泡辣椒中游離氨基酸的綜合品質更好。研究結果可為后續利用兩次發酵技術，基于泡辣椒氨基酸含量開發辣椒制品以及為研究泡辣椒營養與特征風味研究等提供理論依據。