鵝源大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

李正興，徐景峨，潘 永，李 婷，吳 仙，沈如勇，李茂錦，楊 莉，韓 雪

1.貴州省畢節市納雍縣農業農村局,貴州納雍 553399；2.貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所,貴州貴陽 550005；3.貴州錦屏生態鵝業發展有限公司,貴州錦屏 556700

為了解錦屏縣某規模化鵝場致病菌的流行狀況和耐藥規律，采集15 只病死雛鵝的不同組織樣本，進行細菌分離培養、PCR 檢測、藥敏試驗和耐藥基因篩查。結果分離得到13 株大腸桿菌、6株沙門氏菌、4 株鴨疫里默氏桿菌；12 株大腸桿菌和6 株沙門氏菌為多重耐藥菌，對頭孢噻肟、頭孢唑啉等14 種抗生素耐藥；鴨疫里默氏桿菌對克林霉素、紅霉素、多粘菌素B、環丙沙星的耐藥率均為100%；floR 基因檢出率，大腸桿菌為76.92%，沙門氏菌和鴨疫里默氏桿菌為100%；大腸桿菌blaCTX-M-1G 基因檢出率為61.53%，沙門氏菌blaCTX-M-9G 基因檢出率為83.33%。綜上所述，這些鵝源分離菌株大多為多重耐藥菌。

近年來，隨著養鵝業規模的不斷擴大，危害鵝的疾病逐漸增多。其中，鵝常見細菌病如鵝出血性敗血癥、鵝沙門氏菌病、鵝漿膜炎等對養鵝業造成較大經濟損失[1]。鵝細菌病的治療使得抗生素被大量使用，進而導致許多致病菌菌株產生多重耐藥，常見的大腸桿菌、沙門菌等的耐藥最為嚴重[2]。本研究對錦屏縣某規模化鵝場分離的大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里默氏桿菌進行耐藥性分析和耐藥基因檢測初步研究，探明了該鵝場細菌的耐藥情況，并為該鵝場臨床合理用藥提供了科學指導。

1 材料與方法

1.1 樣品

2023 年4 月，來源于錦屏縣某規模化鵝場的15 只病死雛鵝。大腸桿菌ATCC 25922 株保存于本實驗室。

1.2 主要試劑及引物

主要試劑包括藥敏紙片、麥康凱瓊脂培養基、DL2000 DNA marker、Taq DNA 聚合酶。

引物設計參照GeneBank 中相關耐藥基因序列，利用軟件設計耐藥基因引物。以大腸桿菌Pho A 基因、沙門氏菌Inv A 基因和鴨疫里氏桿菌ompA 基因為模板，設計特異性鑒定引物。引物序列送至上海生工生物有限公司合成。

1.3 細菌的分離純化

無菌條件下將病死鵝的肝、腦組織接種于10%犢牛血清瓊脂平板，37℃有氧和燭缸條件下培養16 ～24h。觀察菌落形態特征，并挑取優勢菌落進行純化。對疑似大腸桿菌的菌落進行麥康凱瓊脂平板接種，并對分離菌株進行革蘭氏染色鑒定。

1.4 菌株的分子鑒定

提取細菌的基因組DNA，置于-20℃保存備用。分別利用大腸桿菌pho A 基因、沙門氏菌inv A 基因和鴨疫里氏桿菌ompA 基因特異性引物鑒定所分離菌株。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠顯像分析技術分析拍照，將陽性樣品送往生工生物有限公司測序。

1.5 藥敏試驗

以K-B 法開展菌株的藥物敏感性試驗。將經鑒定的大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌接種于相應培養基進行活化，以0.5 麥氏濁度的純培養物涂布于培養基上，等待數分鐘后將藥敏紙片貼上，經過18h 的培養后測量抑菌圈尺寸，并以大腸桿菌ATCC25922 作質控菌株。根據NCCLS藥敏試驗標準判定菌株對應藥物的敏感度。

1.6 檢測耐藥基因

通過PCR 試驗檢測分離菌株的耐藥基因。擴增體系(25μL)為: DNA 模板1μL，上、下游引物各1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，無菌水補足至25μL。擴增程序為:95℃預變性3min；94℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30 個循環；72℃再延伸5min。取PCR 擴增產物6 μL，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀上觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 細菌生長情況

在10%犢牛血清瓊脂平板上共分離到來源于病死雛鵝肝和腦且形態不同的3 種菌株共23 株，其中：13 株來源于鵝肝的菌株在瓊脂平板上長出圓形、光滑濕潤、邊緣整齊、隆起、直徑為 1 ～3mm的灰白色菌落，麥康凱瓊脂平板上呈紅色或粉紅色菌落。6 株來源于鵝肝的菌株呈乳白色、圓形、隆起且光滑，直徑達2mm。4 株來源于鵝腦的菌株在燭缸條件下培養獲得，平板上呈表面光滑、濕潤、透明、露珠狀小的菌落。革蘭氏染色結果顯示，23 株分離菌株均為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 菌株的分子鑒定結果

分離的23 株菌株經基因特異性PCR 擴增及測序后，擴增及測序結果中，13 株菌的目的條帶大小及測序結果與大腸桿菌Pho A 基因相符，6 株菌的目的條帶大小及測序結果與沙門氏菌Inv A 基因相符，4 株菌的目的條帶大小及測序結果與鴨疫里氏桿菌ompA 基因基因相符。結果共分離鑒定大腸桿菌13 株，沙門氏菌6 株，鴨疫里氏桿菌4 株。

2.3 藥敏試驗結果

如表1 所示，13 株大腸桿菌對四環素、克林霉素、多黏菌素B、紅霉素、慶大霉素、強力霉素的耐藥率均達到了100%。6 株沙門氏菌除頭孢西丁和四環素外，對其余13 種抗生素耐藥率均達100%。4 株鴨疫里默氏桿菌對克林霉素、多黏菌素B、紅霉素的耐藥率均達到了100%。該規模化鵝場分離出的23 株菌對所檢測15 種抗生素無一株完全敏感，其中大腸桿菌和沙門氏菌對β-內酰胺類具有普遍的耐藥性，臨床上應減少使用，僅對頭孢西丁具有較強敏感性。此次分離的大腸桿菌和沙門氏菌菌株的多重耐藥性較高，應引起養殖場的重視。

表1 23 株雛鵝細菌分離株對不同藥物的敏感性比例

2.4 耐藥基因的PCR 擴增

通過普通PCR 試驗檢測23 株臨床分離菌株所攜帶的耐藥基因。如表2 所示，13 株大腸桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(76.92%)，其次是β-內酰胺酶類的blaCTX-M-1G 基因（61.53%）。6 株沙門氏菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是β-內酰胺酶類的blaCTX-M-9G 基因，氨基糖苷類的aadA1 基因和氯霉素類的cmlA、cmlB 基因，檢出率均為83.33%。4 株鴨疫里默氏桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是氨基糖苷類的aadA11 基因和喹諾酮類的qnrS基因，檢出率均為25%。與藥敏試驗表型對比發現，攜帶floR 基因的10 株大腸桿菌全部對氯霉素具有耐藥性；攜帶blaCTX-M-1G 基因的8 株大腸桿菌對頭孢菌素類藥物具有耐藥性。攜帶floR基因的6 株沙門菌全部對氯霉素具有耐藥性；攜帶blaCTX-M-9G 基因的5 株沙門菌全部對頭孢菌素類藥物具有耐藥性；攜帶aadA1 基因的5 株沙門菌全部對氨基糖苷類藥物具有耐藥性；攜帶cmlA、cmlB 基因的5 株沙門菌全部對氯霉素類藥物具有耐藥性。攜帶floR 基因的4 株鴨疫里默氏桿菌僅有1 株對氯霉素具有耐藥性；攜帶aadA1基因和qnrS 基因的1 株鴨疫里默氏桿菌對氨基糖苷類和喹諾酮類藥物無耐藥性。以上結果表明，這些耐藥基因與菌株抗生素耐藥表型相關，但值得注意的是鴨疫里默氏桿菌中出現攜帶耐藥基因與耐藥表型不一致的現象，鴨疫里默氏桿菌中的這些耐藥基因是否存在獨特的調控機制，需要進一步探究。

表2 23 株雛鵝細菌分離株耐藥基因檢出率

3 討論

當前，超級細菌的出現威脅著全球公共衛生安全，每年因細菌耐藥而死亡的人數均很高。而抗生素濫用是造成這一問題的主要原因。有相關報道表明，過去養殖業普遍在飼料當中添加抗生素，目的是促進生長并抵御細菌病的侵襲，盡管目前國內外均出臺了減抗替抗相關政策，但細菌耐藥的問題在短時間內可能難以解決，解析耐藥機制對未來耐藥菌的防治策略的制定具有積極意義。細菌有多種不同的耐藥機制，其攜帶的耐藥基因發揮重要作用。因此，本試驗根據藥敏試驗結果檢測了部分耐藥基因，結果顯示，13 株大腸桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(76.92%)，其次是β-內酰胺酶類的blaCTX-M-1G 基因（61.53%）。6 株沙門氏菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是β-內酰胺酶類的blaCTX-M-9G 基因，氨基糖苷類的aadA1 基因和氯霉素類的cmlA、cmlB 基因，檢出率均為83.33%。4 株鴨疫里默氏桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是氨基糖苷類的aadA11 基因和喹諾酮類的qnrS 基因，檢出率均為25%。另外，鴨疫里默氏桿菌中耐藥基因陽性菌株與藥敏試驗表型不一致，提示可能存在未知的鴨疫里默氏桿菌中耐藥基因調控機制。

本研究揭示了該鵝場大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌抗生素耐藥情況，分離菌對常用藥物耐藥突出，呈現多重耐藥性特點，為鵝場細菌病的預防與治療用藥提供了參考依據。