阿爾茨海默病患者神經(jīng)絲輕鏈蛋白水平與臨床特點相關(guān)性分析

王露露， 周 敏， 嚴 旺， 陳才敬

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以含β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）的細胞外斑塊和含tau 的細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)為特征的神經(jīng)退行性疾病［1］。過往阿爾茨海默病的診斷往往依賴于臨床的認知障礙特征，在病理檢查之前無法明確作出AD的診斷。隨著神經(jīng)影像學(xué)和腦脊液生物標(biāo)記物的出現(xiàn)，臨床醫(yī)生對于AD 的診斷能力得到了極大的提升。臨床研究發(fā)現(xiàn)AD 患者腦脊液Aβ42減少，總tau蛋白和磷酸化tau 蛋白升高。但由于腰椎穿刺術(shù)采集腦脊液檢查屬于有創(chuàng)操作，因此常規(guī)使用腦脊液診斷AD的方法并未被廣泛采用［2］。

能夠有效反映腦脊液生物標(biāo)記物的血液阿爾茨海默病生物標(biāo)志物正在成為現(xiàn)實［3］。薈萃分析結(jié)果顯示，除了核心病理生物標(biāo)志物（如Aβ 和磷酸化tau）之外，神經(jīng)變性的血液標(biāo)志物神經(jīng)絲輕鏈蛋白具有很高的應(yīng)用潛力［4］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)絲輕鏈蛋白在AD 和輕度認知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）患者中血漿中表達升高［5］，血清NfL 濃度與主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦脊液中NfL 濃度呈中度至強相關(guān)性，血清NfL與腦脊液NfL水平呈高度相關(guān)，這提示血清NfL 水平能準確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的NfL釋放，即血清NfL濃度可以反應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中NfL 濃度的高低［6］。這個生物標(biāo)志物在腦脊液和血漿中同步異常，使之具有潛力成為臨床實踐和試驗中早期和精確診斷、預(yù)后或監(jiān)測疾病進展和治療效果的有力工具［3］。

目前的很多研究都顯示NfL 在AD 患者中表達升高，但是對于NfL 升高的機制缺乏進一步明確。我們的研究想探討阿爾茨海默病患者外周血漿神經(jīng)絲輕鏈蛋白（NfL）水平與臨床特點相關(guān)性，以此探尋NfL 在AD 疾病進展中的影響部分，為日后研究NfL 在AD 中的病理生理機制提供啟發(fā)和方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以2020 年6 月—2022 年12 月寧波市第二醫(yī)院收治的58 例阿爾茨海默病患者的臨床資料為研究對象，均符合AT（N）框架的認知障礙診斷標(biāo)準［11］；排除標(biāo)準：（1）腦外傷、腦血管疾病及精神疾病史，患有影響認知的全身或系統(tǒng)性疾病，如慢性傳染病、糖尿病或其他代謝、內(nèi)分泌或自身免疫性疾病、甲狀腺功能不全、營養(yǎng)不良、惡性腫瘤等；有嚴重焦慮、抑郁和精神分裂癥；（2）在納入前4 周內(nèi)服用膽堿酯酶抑制劑，抗膽堿能抗抑郁藥，神經(jīng)抑制劑，抗帕金森藥物，慢性抗焦慮藥，鎮(zhèn)靜劑，利尿劑，或經(jīng)常使用麻醉劑；（3）MRI常規(guī)掃描發(fā)現(xiàn)有局灶性或彌漫性腦內(nèi)病灶者；由于其他原因（如體內(nèi)金屬異物、幽閉恐懼癥等）不能完成MRI檢查者；（4）有精神類藥物服用史。

1.2 血漿NfL 測定 所有研究對象均采集外周靜脈分離凝膠-促凝血標(biāo)本3 ml。4 h 內(nèi)處理血液樣本，送至實驗室離心（5 000g，10 min），取上清液分裝后直接放入-80 ℃冰箱冷藏保存，進行生物學(xué)標(biāo)記物NfL的測定。

1.3 認知評定 認知測試采用MMSE 和HDS來評估認知水平。

1.4 神經(jīng)影像學(xué)檢查 依據(jù)2020 阿爾茨海默病MR 檢查規(guī)范中國專家共識中的標(biāo)準［12］，對AD 患者采集海馬MR 圖像：斜軸面成像定位線平行海馬長軸，在冠狀面上調(diào)整角度，定位線平行兩側(cè)顳葉連線。斜冠狀面成像定位采用雙定位方法，在矢狀面上定位線垂直于海馬長軸，在橫斷面上調(diào)整角度，使定位線垂直于大腦中線。分別采集T1WI、T2WI、T2FLAIR 等圖像。掃描參數(shù)設(shè)置：適用場強1.5T 的MR 掃描儀，采用2D掃描序列，在斜冠狀面和斜橫斷面上采集T1WI和T2WI序列圖像，同時采集斜冠狀面的T2FLAIR 序列以綜合顯示海馬。FOV 20 cm × 20 cm～24 cm×24 cm，層厚2 mm～ 3 mm，間距0.5 ～ 1.0 mm，矩陣均大于256 mm× 224 mm。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用S-W 檢驗對計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用（）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距），計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用方差分析或獨立樣本t檢驗表示；采用Pearson 相關(guān)系數(shù)檢驗符合正態(tài)分布的兩變量的相關(guān)性，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 本組58 例AD 患者中男性24 例，女性34 例，年齡42～85 歲，平均（69±11）歲；中位病程1.25（1，2）年。其中文盲7 人（12.0%），小學(xué)14 人（24.1%），初中14 人（24.1%），高中4 人（6.9%），中專7 人（12.0%），大專5 人（8.6%），大學(xué)7人（12.0%）。

性別與NfL表達的相關(guān)性（見表1）。58例AD患者中男性24 例，女性34 例。男性患者NfL 表達量為（28.14±17.98）pg/ml，女性為（24.93±17.07）pg/ml。采用獨立樣本t檢驗去研究性別對于NfL 表達的差異性，兩組樣本P＞0.05，不同性別對于NfL水平不會表現(xiàn)出顯著性差異。

表1 性別與NfL表達水平比較（）

表1 性別與NfL表達水平比較（）

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文化程度與NfL 表達的相關(guān)性（見表2、圖1）。利用單因素方差分析研究文化程度對于NfL 表達的差異性，從下表可以看出不同文化程度對于NfL 表達水平均不會表現(xiàn)出顯著性（P＞0.05），意味著不同文化程度樣本對于NfL 全部表現(xiàn)出一致性，并沒有差異性，文化程度對于NfL表達水平無影響。

一句殘酷的話也許會毀掉生命，一句鼓勵的話也許會點燃希望。陳樹清老師就像一個加油站，每天都會以各種智慧的語言來激勵與警醒我們保持夢想，并為之砥礪前行。他也常以自己的經(jīng)歷來告訴我們要倍加珍惜現(xiàn)在的學(xué)習(xí)機會，努力實現(xiàn)自己人生價值。

圖1 文化程度與NfL水平（平均值）比較柱狀圖

表2 文化程度與NfL表達水平比較（）

表2 文化程度與NfL表達水平比較（）

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2.2 年齡、病程、海馬分級、ADL 分值、MMSE分值、HDS分值與NfL表達的分析（見表3、圖2） 利用相關(guān)分析去研究NfL 分別和年齡、病程、海馬分級，ADL分值，MMSE分值，HDS分值共6項之間的相關(guān)關(guān)系，使用Pearson 相關(guān)系數(shù)去表示相關(guān)關(guān)系的強弱情況。具體分析可知：NfL和年齡之間的相關(guān)系數(shù)值為0.448，并且呈現(xiàn)出0.01 水平的顯著性，因而說明NfL 和年齡之間有著顯著的正相關(guān)關(guān)系。NfL 和病程之間的相關(guān)系數(shù)值為0.045，接近于0，并且P值為0.737＞0.05，說明NfL 和病程之間并沒有相關(guān)關(guān)系。NfL 和海馬分級之間的相關(guān)系數(shù)值為0.345，并且呈現(xiàn)出0.01 水平的顯著性，因而說明NfL 和海馬分級之間有著顯著的正相關(guān)關(guān)系。NfL/和ADL 分值之間的相關(guān)系數(shù)值為0.242，接近于0，并且P值為0.067＞0.05說明NfL和ADL分值之間并沒有相關(guān)關(guān)系。NfL和MMSE分值之間的相關(guān)系數(shù)值為-0.099，接近于0，并且P值為0.458＞0.05，說明NfL 和MMSE 分值之間并沒有相關(guān)關(guān)系。NfL 和HDS 分值之間的相關(guān)系數(shù)值為-0.096，接近于0，P值為0.475＞0.05，說明NfL和HDS分值之間并沒有相關(guān)關(guān)系。

圖2 年齡、病程、海馬分級、臨床評估量表分值與NfL表達的線性相關(guān)圖

表3 年齡、 病程、海馬分級、ADL 分值、MMSE 分值、HDS 分值與NfL表達的相關(guān)性分析（）

表3 年齡、 病程、海馬分級、ADL 分值、MMSE 分值、HDS 分值與NfL表達的相關(guān)性分析（）

注：*P＜0.05；**P＜0.01。

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3 討 論

我們的研究發(fā)現(xiàn)NfL 水平與年齡呈正相關(guān)，但與教育程度和性別無關(guān)，這與Mattsson 等［13］對AD 患者進行的NfL 水平研究結(jié)果相同。這項納入了327例癡呆患者的縱向研究顯示AD 患者血漿NfL 水平隨病程進展逐漸升高，NfL 水平升高越快，腦萎縮和低代謝率越快，整體認知惡化越快。因此血漿NfL可作為與AD 患者神經(jīng)退行性變相關(guān)的非侵入性生物標(biāo)志物。Wenjun等［14］發(fā)現(xiàn)血漿NfL水平與年齡呈正相關(guān)。另外的研究發(fā)現(xiàn)，在40 歲以下人群中，NfL水平與年齡增長無明顯相關(guān)，但是在40 歲以上人群中，NfL 水平隨著年齡的增長而顯著升高。NfL 水平在40～59 歲組是20～39 組的2 倍，在60～79 組更是20～39 歲組的4 倍［15］。人體隨年齡增長的最大表現(xiàn)是衰老，而正常的衰老與神經(jīng)退行性過程有關(guān)［8］。NfL隨年齡增大而上升的現(xiàn)象可能提示慢性、持續(xù)性的軸索損傷，也可能是由隨年齡增大腦脊液逐漸減少的生理現(xiàn)象引起［14］。

我們用ADL 分值、MMSE 分值、HDS 分值這3 種量表評分量化患者智能損害的嚴重程度。上述3種量表的結(jié)果一致，癡呆量表的分值與NfL 水平無相關(guān)。本研究中血漿NfL水平無法有效反映AD患者認知損害程度，可能是由于我們納入的患者年齡偏大，導(dǎo)致NfL 基線水平升高，未能消除年齡對NfL 水平的影響引起。另外，我們?nèi)虢M的AD患者癡呆癥狀相對較輕，病重者就診少，偏離真實世界，亦可能為原因之一。

阿爾茨海默病的病理特征是錯誤折疊的Aβ 和磷酸化的tau （p-tau）蛋白分別在大腦皮質(zhì)形成細胞外老年斑和顳葉內(nèi)側(cè)形成神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，隨后出現(xiàn)在顳葉外側(cè)、頂葉等皮質(zhì)區(qū)域［16］。海馬萎縮與認知功能下降相關(guān)［17］。目前的觀點認為阿爾茨海默病的進行性海馬萎縮最主要的原因是海馬神經(jīng)元丟失的嚴重程度，而不是tau 蛋白的沉積［18］。研究發(fā)現(xiàn)，NfL水平與磁共振海馬分級呈正相關(guān)。海馬萎縮代表了AD患者在顱腦結(jié)構(gòu)中的損害程度，因此我們認為血漿NfL 水平的高低可能更大程度上體現(xiàn)了癡呆患者在結(jié)構(gòu)病理上的損害，即海馬萎縮越嚴重，神經(jīng)變性越嚴重，NfL 水平更高。在163 例AD患者的研究中發(fā)現(xiàn)海馬萎縮主要有4 種模式：（1）59%的患者為典型的海馬和皮質(zhì)雙萎縮；（2）19%的患者僅表現(xiàn)為海馬萎縮；（3）12%的患者僅表現(xiàn)為皮質(zhì)萎縮；（4）10%的患者表現(xiàn)為海馬及皮質(zhì)均不萎縮［19］。因此，并非所有AD 患者均出現(xiàn)海馬萎縮，海馬萎縮僅是AD結(jié)構(gòu)病變的一方面。AD被視為突觸穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元或神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)完整性的喪失［1］。我們的研究未進行皮質(zhì)萎縮的測量，但我們推測NfL 作為一種軸突蛋白或許與皮質(zhì)萎縮、突觸穩(wěn)態(tài)異常有很大聯(lián)系。

我們的研究存在一些局限性：首先是由于在既往的許多研究中都證實AD 患者血漿NfL 水平明顯高于正常對照，因此我們并未設(shè)置對照組，而是進行了組內(nèi)的比較。疾病組的規(guī)模有限，納入的AD患者數(shù)量相對較少。因此，我們沒有根據(jù)疾病嚴重程度對患者進行分層，應(yīng)當(dāng)在大型的隊列研究中進一步驗證結(jié)果。

其次，我們只對AD 患者進行了2 項整體認知測試（MMSE、HDS）和一項日常生活能力測試（ADL），缺乏對認知功能對記憶、語言、執(zhí)行功能、視空間能力和注意力的逐一詳細評估。再者我們進行的是橫斷面研究，如果可以進行縱向的研究，繼續(xù)跟蹤隨訪每位患者，進一步探討隨著時間延長病情加重，個體AD患者的血漿NfL水平變化，將會對證實NfL的應(yīng)用價值提供更多有效的信息。AD患者血漿NfL水平較正常健康者升高［13］。目前的觀點認為血漿NfL 可能是一種有效的生物標(biāo)志物，用于篩選表現(xiàn)出神經(jīng)精神癥狀的個體，并且可作為單一的生物標(biāo)志物明確區(qū)分神經(jīng)退行性癡呆與健康個體，但血漿NfL不能準確區(qū)分進行性核上性麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、AD和路易體癡呆［20］。總之，我們希望發(fā)現(xiàn)一種可以有效識別、量化神經(jīng)退行性變性的生物標(biāo)記物，這對于神經(jīng)退行性疾病的診斷和預(yù)后判斷有著重大幫助。

倫理學(xué)聲明：本研究方案經(jīng)由寧波市第二醫(yī)院人體研究倫理委員會審批（批號：PJ-NBEY-KY-2021-049-01）。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王露露負責(zé)設(shè)計論文框架、起草論文；周敏負責(zé)實驗操作、研究過程的實施；王露露負責(zé)數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計學(xué)分析、繪制圖表；嚴旺負責(zé)論文修改；陳才敬負責(zé)擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。