4種乳菇屬真菌的形態學與rDNA-ITS鑒定

田慧敏 李江

摘? ? 要：為明確內蒙古赤峰地區常見有毒乳菇種類，準確、快速地識別有毒乳菇，將采集的4個乳菇屬Lactarius真菌標本采用傳統形態學分類方法進行鑒定，同時提取子實體DNA，使用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增，用Blast對擴增產物純化測序所得的序列進行比對，采用MEGA5.1軟件構建系統發育樹確定屬和種。結果表明，2種方法鑒定結果一致，標本CFSZ10167為毛頭乳菇[Lactarius torminosus （Schaeff.）Pers.]，標本CFSZ10216為絨邊乳菇[Lactarius pubescens（Fr. ex Kronbh.）Fr.]，標本CFSZ13021為灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.）Fr.]，3種均為胃腸炎型毒菌，CFSZ10044為皺乳菇（Lactarius ruginosus? ?Romagn），為中國新記錄種，主要特點是菌蓋棕褐色、淺褐色，有絨質感，蓋緣呈齒狀，孢子球形具小刺，食毒不明。對4個種的形態學特征進行了詳細描述，并附有生境圖片和顯微圖像，研究結果為乳菇屬物種鑒定和資源分布提供了重要補充，并為常見毒菌識別提供了理論依據。

關鍵詞：乳菇屬；毒菌；形態學；rDNA-ITS測序鑒定；系統發育樹

中圖分類號：Q939.5 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-056-08

Morphologal and rDNA-ITS identification of four fungi in Lactarius

TIAN Huimin， LI Jiang

（College of Chemical and Life Science， Chifeng University， Chifeng 024000， Inner Mongolia， China ）

Abstract： Four unkown poisonous mushrooms of Lactarius from the city of Chifeng in Inner Mongolia were collected and identified by morphology classification to identify the genera and species， the fungal DNA were extracted from the fruiting bodies， amplified by PCR using fungal universal primers ITS1/ITS4， the sequences obtained from purification and sequencing of amplification products were compared by blast， a phylogenetic tree was constructed using MEGA5.1 software to identify the genera and species as auxiliary mean. The results of the two methods are consistent， Specimen CFSZ 10167， CFSZ10216 and CFSZ13021 are? Lactarius torminosus（Schaeff.） Pers.， Lactarius pubescens（Fr. Ex Kronbh.）Fr. and Lactarius pyrogalus（Bull.） Fr. respectively， which are all gastroenteritis poisonous mushrooms， CFSZ10044 is Lactarius ruginosus Romagn， new to China. The main features include that the cap is tan or light brown， with a velvety texture and toothed margin， the spores are spherical with small spines， edible or poisonous unkown. The morphological characteristics of the four species were described in detail， and the habitat picture and micrograph were attached， and the result provided an important supplement to the species identification and resource distribution of Lactarius and a theoretical basis for the identification of common poisonous fungus.

Key words： Species of Lactarius; Poisonous fungi; Morphology; rDNA-ITS sequencing; Phylogenetic tree

毒菌亦稱毒蕈、毒蘑菇，是指大型真菌的子實體食用后對人或畜禽產生中毒反應的物種，絕大部分屬于傘菌，少部分為子囊菌[1]。有些毒菌與野生食用菌的外形特征極其相似，因此很容易混淆被誤食而引起人畜中毒。據2014年統計，我國毒菌有435種[2]，分布在全國各地；每年都會發生毒菌引起的中毒事件，其中23個省份報道過此類事件，毒菌中毒是我國食物中毒致死事件的主因，致死率較高[3]。乳菇屬（Lactarius）是常見的毒菌類群之一，該屬的許多種真菌含有胃腸道毒素，引起腸胃炎反應[4-5]。而且有的種能富集重金屬如鉻、銅、銫、鉛，易引起重金屬中毒[6-7]。乳菇屬主要的識別特征是子實體肉質，菌蓋半球形，中央下凹、有時呈漏斗狀，顏色多樣，表面具絨毛或無，具同心環紋或無；菌褶新鮮受傷時往往有乳汁流出；擔孢子在顯微鏡下無色至淡黃色，通常為球形至寬橢圓形，有小疣或小刺，常具有囊狀體，許多種具有油囊體或乳汁管 [8]。菌蓋、菌柄和菌褶的菌肉組織具球狀細胞。該屬真菌通常生于白樺林、蒙古櫟、楊樹林等闊葉林和油松、樟子松等針葉林內，與植物形成共生菌根，分布范圍廣，海拔低，是當地村民經常采集的一類真菌。乳菇屬真菌的鑒定主要靠形態學特征，但是在地理環境、氣候和營養條件的影響下，子實體顏色和大小都有一定的變化，給鑒定帶來一定的困難。

近些年來基于核糖體DNA基因轉錄間隔區（rDNA-ITS）的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增測序技術如內轉錄間隔區序列（ITS）、核糖體大亞基序列測序（nLSU）和核糖體大亞基序列測序（SSU）[9]、線粒體基因組、全基因組[10-12]等多種分子技術應用于乳菇屬真菌鑒定和親緣關系分析研究，大大提升了該科真菌的鑒定效率和準確度。然而，DNA證據并不總是與形態證據吻合，這又為食用菌和毒菌的識別和名稱的使用帶來了困擾和不便[13]。筆者在傳統的形態鑒定基礎上，利用rDNA-ITS對幾種常見的乳菇屬真菌進行鑒定，并附彩色圖片，為毒菌的準確識別鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

標本CFSZ10044、CFSZ10167和CFSZ10216于2013年8月12日采自內蒙古自治區赤峰市巴林右旗賽罕烏拉國家級自然保護區。CFSZ13021標本于2016年8月11日采集于內蒙古自治區赤峰市松山區城子鄉盔甲山。所有標本拍攝生境照片后，測量子實體菌蓋直徑、菌柄長度和直徑；觀察新鮮子實體菌蓋、菌柄顏色、附屬物，菌褶顏色、乳汁顏色；采集、編號、曬干、裝袋，帶回實驗室，經-80 ℃超低溫冰箱（906GP-ULTS，塞默飛世爾科技有限公司）冷凍2周后，室溫保存于赤峰學院化學與生命科學學院菌物標本室（CFSZ）。于2014年6月10日進行標本CFSZ10044、CFSZ10167和CFSZ10216的形態學鑒定，2015年2月15日進行分子鑒定。于2016年11月1日進行CFSZ13021標本的形態學鑒定，2017年4月27日進行分子鑒定。

1.2 形態鑒定

采用宏觀特征、顯微結構與化學試劑反應相結合的鑒定方法。顏色的判斷主要依據采集時拍攝的彩色照片，選1～5個新鮮子實體，用游標卡尺測量其大小，觀察顏色、形狀、附屬物等，菌褶顏色及變化、著生方式，菌肉顏色和氣味等特征，顯微觀察在光學顯微鏡40倍鏡下（奧特B203LED，愛迪泰克科技有限公司）完成，通常取小塊菌褶、菌蓋和菌柄表皮以4%～5%氫氧化鉀作浮載劑制成徒手切片，擔孢子以隨機測量30個為準，菌絲、囊狀體、擔子等測量15～20個，測量長和寬范圍，寬度測量以最寬處為準。孢子、菌絲、囊狀體、擔子等淀粉質反應是將梅爾澤試劑（Melzer’s reagent）加入到浮載劑中顯色來判斷，具體鑒定方法參照田慧敏等[14]的報道。

1.3 rDNA-ITS測序鑒定及系統發育樹的構建

取子實體干品一小部分菌蓋（含菌褶）用研缽研磨成粉末狀，稱取30 mg粉末，用DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）提取基因組DNA。參照White等 [15]以ITS1/ITS4為正反向引物進行PCR擴增反應，將已測得的ITS序列提交至NCBI的GenBank（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢索相似序列，用MEGA5.1軟件中的Alignment程序對檢索的相似序列和標本序列進行多重對位排比，并采用Analysis程序Kimura 2-parameter模式計算遺傳距離，Bootstrap循環1000次，采用最大似然法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 形態結構特征

2.1.1 毛頭乳菇[Lactarius torminosus（Schaeff.）Pers.] 子實體中等大，菌蓋直徑3～6 cm，漏斗形，表面淺肉桂色，中央呈深褐色，具紅棕色同心環紋，表面具平伏狀絨毛，邊緣內卷具粗毛或刺毛（圖1-A～B）；菌肉白色，厚，傷不變色；菌褶乳白色或米色，干后米黃色，等長，較密，從蓋緣發出短菌褶，傷后流出白色乳汁，后變褐色，味道辣；菌柄大小（5.2～8.4） cm×（1.2～1.5） cm，圓柱形，基部較細，中空，色同菌蓋呈肉桂色，基部白色。

擔孢子大小為（7.2～9.7） μm×（6.5～8.6） μm，無色，寬橢圓形，有小刺（圖1-C）； 擔子大小為（34.0～57.6） μm×（7.5～12.0） μm，棒狀、具4個小梗、無色（圖1-D）；褶側囊體少，（52.0～70.0） μm×（9.0～12.0） μm，披針形，充滿黃色內含物（圖1-E）；乳汁管淡黃色（圖1-F），菌蓋表皮由雜亂菌絲組成，菌絲無色，頂端淡黃色，稍膨大，直徑4.0～7.0 μm（圖1-G）；菌柄表皮由排列整齊的菌絲和囊狀細胞組成，菌絲直徑5.0～9.6 μm，囊泡狀細胞大小（18.0～33.6） μm×（12.0～32.0） μm，無色。

2.1.2 絨邊乳菇（Lactarius pubescens Fr.） 子實體中等大，菌蓋直徑4.4～7.5 cm，起初半球形，后中部下凹呈漏斗狀，邊緣內卷且有絮狀長絨毛，表面米白色或污白色，中間色深呈淺橙色至肉桂色，中間具稀疏的黃色絨毛（圖2-A～B）；菌肉白色，厚，傷不變色；菌褶污白色，密，不等長，有從蓋緣發出的短菌褶，乳汁白色，不變色；菌柄大小（2.7～4.0） cm×（1.5～2.0） cm，松軟，圓柱形，污白色，有時具粉色色調。

擔孢子大小為（6.0～8.1） μm×（4.4～6.5） μm，淡黃色，寬橢圓形表面具小疣（圖2-C）； 擔子大小為（28.8～43.4） μm×（7.2～9.6） μm，短棒狀，無色（圖2-D）； 褶側囊體大小為（31.2～60.0） μm×（7.2～9.6） μm，披尖形，少，無色，有內含物（圖2-E）。菌褶有膠狀菌絲，直徑4.3～5.8 μm，菌蓋表皮由菌絲和囊狀細胞組成，菌絲直徑3.2～6.5 μm，囊狀細胞大小為（19.6～35.0） μm×（12.0～20.0） μm（圖2-F），菌柄表皮菌絲無色，頂端稍窄，直徑9.6～16.8 μm。

2.1.3 灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.） Fr.] 子實體中等大，菌蓋直徑4.2～8.2 cm，扁半球形、中間下凹、邊緣內卷、土黃褐色、黃棕色或棕褐色，表面光滑、濕時稍黏（圖3-A～B）；菌褶離生，白色或米白色、干后色深呈棕色、乳汁白色；菌肉白色、干后米黃色、有辣味、無特殊氣味；菌柄大小（2.5～6.0） cm×（0.6～1.4） cm，松軟，圓柱形，污白色，傷變淺赭色。

擔孢子大小（6.0～7.6） μm×（5.0～6.2） μm，近球形，表面有小刺和條狀脊，淀粉質，在Melzer’s試劑中表現為藍色（圖3-C）；擔子大小（28.8～46.4） μm×（7.2～9.6） μm，棒狀，具4個小梗，無色，有黃色內含物（圖3-D）；褶側囊體大小（33.6～62.4） μm×（7.2～10.0） μm，梭形，有金黃色內含物（圖1-E）；菌蓋表皮菌絲薄壁，頂端鈍圓，直徑3.5～8.0 μm；菌柄表皮由排列整齊的菌絲組成，有內含物（圖3-F）。

2.1.4 皺乳菇（Lactarius ruginosus Romagn） 子實體中等偏小，菌蓋直徑3.6～4.5 cm，扁半球形，后期平展，土黃色至棕灰色、邊緣色淺、表面不黏、有短絨毛或呈絨質、表皮有皺紋，蓋緣有齒狀（圖 4-A～B）；菌肉白色或淡黃色、無特殊氣味；菌褶米白色、等長、密、干后邊緣米黃色、有腥味；菌柄大小（6.0～8.0） cm×（0.7～1.2） cm，頂端較細、向下漸粗、疏松，后期中空，表面白色，光滑。

擔孢子大小（6.5～8.8） μm×（4.8～7.2） μm，球形、具小刺、無色、長約2 μm、淀粉質（圖4-C）；擔子大小（40～60） μm×（10～15） μm，棒狀、無色、有內含物（圖4-D）；囊狀體大小（33.6～62.4） μm×（7.2～10） μm，披尖形，有時頂端有小乳突，（圖4-E）；菌蓋表皮由無色菌絲和橢圓形細胞組成，菌絲頂端不膨大，有隔膜，頂端細胞大小（30.0～50.0） μm×（5.0～7.2） μm，下部細胞大小（20.0～35.0） μm×（15.0～20.0） μm（圖4-F）；菌柄表皮由無色菌絲和橢圓形細胞組成，菌絲頂端不膨大，有隔膜，頂端細胞大小（30.0～50.0） μm×（5.0～7.2） μm，下部細胞大小（15.0～25.0） μm×（12.0～18.0） μm（圖4-G）。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定

2.2.1 測序樣品比對結果 通過NCBI的GenBank數據庫對4份標本的ITS序列進行BLAST檢索，獲得了與供試樣品具有較高相似性的53個序列，其物種名稱、登錄號和來源見表1。

2.2.2 樣品系統發育樹 以毒紅菇（R. emetica）為外群，對4個樣本CFSZ10044、CFSZ10167、CFSZ10186和CFSZ13021的ITS序列及其相似序列（47個序列）構建系統發育樹，結果表明，根據ITS序列聚類結果分為紅菇屬（Russula）和乳菇屬（Lactarius），其中乳菇屬分為兩大支；第一分支為辣味乳菇亞屬（Subg. Piperites）和憂郁乳菇亞屬（Subg. Tristes）；第二分支為變紅乳菇亞屬（Subg. Plinthogalus）；CFSZ 10216和CFSZ10167位于第一分支的第一側支，屬于辣味乳菇亞屬（Subg. Piperites）；CFSZ10216與絨邊乳菇（L. pubescens）聚在一起；CFSZ10167與毛頭乳菇（L. torminosus）聚在一起；CFSZ13021位于第一分支的第二側支，屬于憂郁乳菇亞屬（Subg. Tristes），與暗褐乳菇（L. pyrogalus）聚在一起；CFSZ10044位于第二分支，屬于變紅乳菇亞屬（Subg. Plinthogalus），與皺乳菇（L. ruginosus）聚在一起（圖5）。

3 討論與結論

毛頭乳菇（L. torminosus）在外形上易與絨邊乳菇（L. pubescens）混淆，二者相比，毛頭乳菇孢子較大，為（7.2～10.3） μm×（6.5～8.6） μm，菌蓋表面大多為肉桂色并具肉桂色同心輪紋[16-17]；絨邊乳菇具明顯較小的孢子（6.0～8.1） μm×（4.4～6.5） μm，且菌蓋表面色為米白色或污白色。毛頭乳菇含有胃腸道反應毒素和毒蠅堿等，中毒后會出現惡心、嘔吐、腹瀉等類似腸胃炎癥狀和抽搐、幻覺等神經精神性癥狀[1-2]。

分子鑒定中絨邊乳菇與蘇格蘭乳菇（L. scoticus）和荒漠乳菇（L. tesquorum）相似度較高，但是本研究中標本菌蓋顏色較深，且表面絨毛較長，尤其是菌蓋邊緣絨毛密度更大，而蘇格蘭乳菇菌蓋表面絨毛很少，有似絨毛狀紋理[18]，二者的區別需要細致的觀察和研究，同時荒漠乳菇孢子較大（6～9 μm），外形不具以上特征[19]。絨邊乳菇絨毛和菌褶中含有多種重金屬和稀有金屬，如銅、鉻、鈷，對人體可能不利[20]。

灰褐乳菇[Lactarius pyrogalus（Bull.）Fr.]為憂郁乳菇亞屬（Subg. Tristes）憂郁組（Section Tristes），與暗褐乳菇（L. fuliginosus）和皺蓋乳菇（L. corrugis）外形特征相似，但是暗褐乳菇菌蓋表面具放射狀皺紋，且有絨毛，孢子略大（7.4～8.3） μm×（6.3～7.5） μm[17]；皺蓋乳菇菌蓋顏色深，栗褐色，表面不黏，孢子較大（6.9～9.1） μm×（6.4～7.3） μm[16]。而灰褐乳菇表面不具絨毛、光滑、濕時黏、黃棕色或淺棕褐色，孢子較小（6.0～8.5） μm×（5.0～6.2） μm[21-22]，與以上兩種形態上有明顯區別。灰褐乳菇有輕微毒性，中毒后會出現惡心、嘔吐、腹瀉等類似腸胃炎癥狀，僅分布于吉林和內蒙古兩地[2，17]。

皺乳菇（Lactarius ruginosus Romagn.）最明顯的特征是菌蓋棕褐色至淺褐色，有絨質感，蓋緣呈齒狀，孢子球形具小刺[16-18]。與該種相似的變紅乳菇亞屬（Subg. Plinthogalus）的種有翅孢乳菇（Lactarius pterosporus）、暗褐乳菇（Lactarius fuliginosus）、Lactarius azonites和羅邁尼乳菇（Lactarius romagnesii）等，但是都與該種有明顯區別，如翅孢乳菇菌蓋表面往往皺縮，邊緣顏色較深，孢子的脊呈條斑形，似具翅，刺長2.5 μm，孢子也略小（7～8） μm×（5～7） μm[18-19]；暗褐乳菇菌蓋表面光滑，肉粉色，或粉紅色，或淺咖啡色，菌柄色深，孢子較大平均10 μm×8 μm，具明顯的脊[17，22]；L. azonites菌蓋淺黃色至煙灰色至酒紅色，孢子明顯偏大（8.0～9.0） μm×（7.5～8.5） μm，具完整的脊，羅邁尼乳菇孢子大小（7.3～9.8） μm×（6.3～8.3） μm，具網狀脊，菌柄圓柱形或向下漸變細，具縱溝紋，菌肉溫和，微苦[23-24]，特征與該種不同；分子證據顯示本研究中的標本CFSZ10044與白灰乳菇（L. albidocinereus）親緣關系較近，但是白灰乳菇菌蓋顏色為灰白色或灰褐色，有時褪為白色，而該標本為赭色，區別很明顯，該種在我國尚未發現分布記錄，為中國新記錄種。皺乳菇屬于陰沉乳菇亞屬Subg. Plinthogalus，該亞屬的種在我國分布較少，如黑乳菇（L. lignyotus）、暗褐乳菇和瀝青色乳菇，因此，應當謹慎食用。

筆者采用形態學與ITS測序相結合的方法對乳菇屬真菌進行鑒定，結果可靠，方法簡便、成本低廉，該法也可用于其他屬大型真菌的準確鑒定和推廣使用。為當地乳菇類有毒真菌的識別提供方便，為菌物資源的鑒定及安全開發提供依據。但是研究中存在很多不足之處，首先，筆者的研究僅對部分地區有毒乳菇分布進行調查，范圍不夠廣泛，不能全面代表赤峰地區有毒乳菇種類，下一步應該擴大調查范圍，在分子鑒定時進一步采用多種基因標記技術相結合作為輔助手段，以期鑒定更加準確；其次，由于條件所限和筆者水平有限，對顯微結構如孢子的脊線和小疣等特征沒有清晰的展示，后期研究過程中根據實際情況進行手繪或電鏡拍照或染色處理；再次，顯微結構的數據來源于干標本，制作徒手切片時孢子、囊狀體、擔子等結構遇水會膨脹，與實際情況會有誤差，筆者在本研究中采用4%～5%KOH做載浮劑，較大程度地減少了誤差。國內較多文獻都采用5% KOH和10% KOH兩種載浮劑用于紅菇科真菌的研究。Wang等[25]采用5%KOH作為乳菇屬載浮劑，而李國杰等[26]將5% KOH和10% KOH兩種配合使用，大部分標本采用5%KOH載浮劑，對5% KOH溶液恢復效果不佳的極少數標本改用 10%KOH 處理，并將裝片在酒精燈上略微加熱，以加速并改善顯微結構恢復效果。因此，本研究中標本采集時間與形態學鑒定時間間隔短，采用5% KOH載浮劑相對合理。

乳菇屬真菌種類多、分類復雜，形態、顏色、大小較為相似，如果沒有長期采集和分類鑒定經驗很難區分，尤其是該屬有些毒菌具有致命毒素，不少種也含有腸胃炎毒素，同時有些毒種往往與食用菌混生，如白楊乳菇（L. controversus）、絨白乳菇（L. vellereus）、紅汁乳菇（L. hatsudake）等食用野生菌與毛頭乳菇、絨邊乳菇等毒菌經常生于海拔較低的楊樹林、油松林，而這些地方都是村民采食野味的必經之地，被采食的概率極高，存在潛在的危險。建議當地有關部門采取建立當地名錄、印制毒菌圖冊、制作毒菌展板等方式，加大宣傳力度，增強群眾的防范意識和對毒菌的識別能力。

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