基于網絡藥理學和分子對接預測桃紅四物湯治療黃褐斑的機制

謝雨莎 張鵬程 田黎明1,,4* 柯 丹

（1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢，430065；2.華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中西醫結合醫院皮膚科，湖北 武漢，430022；3.武漢市第一醫院皮膚感染和免疫湖北省重點實驗室，湖北 武漢,430022；4.湖北中醫藥大學老年醫學研究所，湖北 武漢,430065；5.重慶市中醫院皮膚科，重慶，400000）

黃褐斑是一種發生于皮膚光暴露部位的慢性色素沉著性疾病，目前認為遺傳易感性、光暴露、性激素水平變化等是最主要的致病因素，但其具體發病機制尚不明確，仍需進一步探索[1]。黃褐斑的治療以減少黑色素生成、消除炎性反應、抑制血管增生、修復皮膚屏障、抗光老化為指導原則[2]。由于單一治療療效欠佳，目前常采用多手段聯合治療，其中加用中藥口服治療療效可觀[3-5]。桃紅四物湯是活血化瘀代表方，具有擴張血管、抗感染、降脂、補充微量元素等作用[6]。目前已有研究證明，桃紅四物湯可以改善患者黃褐斑皮損狀況，但其具體作用機制還需要進一步研究[7]。生物信息學分析相較于基礎實驗更加簡便易行，是臨床研究中常用的分析手段，本研究擬采取網絡藥理學方法構建藥物活性成分互作網絡，應用分子對接技術預測藥物主要活性成分與疾病核心靶點之間的結合強度，以期尋找桃紅四物湯治療黃褐斑的核心靶點及相關通路，初步揭示桃紅四物湯治療黃褐斑的潛在分子機制，為中藥復方治療黃褐斑的臨床應用提供一定的理論依據。

1 方法

1.1 桃紅四物湯活性成分及靶點篩選

利用中醫藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索桃紅四物湯中有效成分，以“桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎”為檢索詞。根據藥代動力學原理，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為標準篩選出藥物有效成分并收集對應靶點。以下五個數據庫用于收集活性化合物的靶標：TCMSP 數據庫，Swiss Target Prediction 數據庫，SymMap 數據庫，GeneCards 數據庫，STITCH 數據庫，比較毒理基因組學數據庫（CTD）。利用UniProt 數據庫將靶點轉換為對應的靶基因，查詢不到的靶點通過PubChem 數據庫查詢SMILES 號后進行預測，最后刪除最終仍無對應基因名的靶蛋白。

1.2 疾病靶點篩選

以“melasma”“chloasma”為關鍵詞，通過Drugbank數據庫、GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、TTD 數據庫、DisGeNET 數據庫篩選黃褐斑相關疾病基因靶點，匯總并刪除重復基因。

1.3 蛋白互作網絡（PPI）構建

將桃紅四物湯靶基因和黃褐斑靶基因導入微生信平臺，繪制韋恩圖。將兩者交集靶點導入STRING 數據庫進行靶基因間蛋白互作分析，物種限定為Homo sapiens，設定置信度＞0.4 代表兩個蛋白間有互作關系，構建PPI 網絡圖。導入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用工具CytoNCA 分析各靶點之間的作用關系，以網絡中各靶基因的節點連接度值（Degree）為指標，篩選出網絡中的關鍵蛋白。

1.4 構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡

基于桃紅四物湯活性成分與黃褐斑靶點之間的相互作用關系，通過Cytoscape 3.9.1 軟件構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡。以網絡中各靶基因的節點連接度值（Degree）為指標，篩選出前10 位中藥活性成分。

1.5 GO 分析與KEGG 富集分析

使用Metascape 數據庫對交集基因進行GO 富集分析和KEGG 富集分析。按P 值升序排序，對GO 分析中的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）均取前10 個條目，KEGG 富集結果選擇前20 個條目，制作成氣泡圖做可視化處理。

1.6 分子對接

從PDB 數據庫下載PPI 網絡中核心蛋白的pdb 格式文件，再從PubChem 數據庫下載網絡圖中Degree 值前10 的藥效分子的sdf 格式文件。利用AutoDockTools 1.5.7 軟件進行格式轉化后進行分子對接模擬，再用PyMol 2.5.4 對接結果進行可視化處理。

2 實驗結果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點篩選

通過TCMSP 數據庫檢索到桃紅四物湯中成分730 個，其中桃仁66 個，紅花189 個，熟地黃76 個，白芍85 個，當歸125 個，川芎189 個，以“OB≥30%和DL≥0.18”為條件篩選并剔除無對應靶點的成分后，得到桃紅四物湯有效成分共58 個，見表1。從TCMSP 數據庫、Swiss Target Prediction 數據庫、SymMap 數據庫、GeneCards 數據庫、STITCH 數據庫、CTD數據庫中篩選出作用靶點，去重后經UniProt 數據庫查詢簡化得到桃紅四物湯靶點基因11 139 個。

表1 桃紅四物湯有效成分及編號

2.2 疾病靶點篩選

在Drugbank 數據庫、GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、TTD 數據庫、DisGeNET 數據庫以“Melasma”“Chloasma”為關鍵詞，篩選并去重后收集到黃褐斑靶點基因55 個。

2.3 蛋白互作網絡（PPI）構建

將桃紅四物湯的11 139 個靶點和黃褐斑的55 個靶點輸入微生信平臺，繪制韋恩圖，兩者交集為桃紅四物湯活性成分與黃褐斑的共同靶點，共53 個，見圖1。圖中粉色代表桃紅四物湯活性成分靶基因，綠色代表黃褐斑靶基因，二者交集為桃紅四物湯活性成分-黃褐斑共同靶基因。將篩選出的交集靶點基因導入STRING 數據庫進行蛋白互作分析，構建PPI 網絡圖，見圖2。PPI 網絡圖中節點表示蛋白質靶點，每條邊則表示蛋白質與蛋白質之間的相互作用關系，網絡中共53 個節點，191 條邊，節點平均度為7.21。通過Cytoscape 3.9.1 軟件繪制桃紅四物湯-黃褐斑核心靶基因PPI 網絡圖，見圖3，其中ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 是桃紅四物湯作用于黃褐斑的核心靶點。

圖1 桃紅四物湯-黃褐斑交集靶點韋恩圖

圖2 PPI 網絡圖

圖3 Cytoscape PPI 網絡圖

2.4 構建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡

網絡圖共包括115 個節點，485 條相互作用關系，見圖4。圖中紅色代表疾病，綠色代表中藥，藍色代表藥物有效成分，黃色代表共有靶點。根據Degree 值篩選出關鍵活性成分主要為葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、（+）-兒茶素、木脂素、膽固醇、黃芩苷、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚。

圖4 “桃紅四物湯-活性成分-靶點-黃褐斑”網絡圖

2.5 GO 分析與KEGG 富集分析

GO 分析結果顯示，53 個交集靶點基因在509 個生物過程（BP）、32 個細胞組成（CC）和47 個分子功能（MF）中顯著富集，共588 個條目（P＜0.01）。治療靶點集中于黑素小體、黑素顆粒、囊泡、轉錄調節復合物等區域，主要針對信號受體配體結合、轉錄因子結合、酶結合等過程發揮作用。每個模塊分別根據P 值升序排序取前10 位繪制氣泡圖，見圖5。KEGG 通路富集分析共得到68 條信號通路，篩選升序排名前20 條條目繪制氣泡圖，見圖6，提示治療黃褐斑主要通過黑色素生成、雌激素信號通路、癌癥與其糖蛋白、甲狀腺激素信號通路、內分泌抵抗、Rap1 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等途徑。

圖5 GO 分析

圖6 KEGG 富集分析

2.6 分子對接

將關鍵活性成分與核心靶基因進行分子對接，結果見表2。結合能＜0 表明配體和受體可以在沒有外力的情況下自發結合，一般認為結合能＜-5 kcal/mol 表明配體與受體易于相互作用。本研究發現，活性成分與核心靶蛋白對接結果均小于該值，顯示出良好的結合力和穩定性，取對接結果最佳的前三位做可視化處理，結合模式見圖7。

圖7 部分藥物活性成分與靶點對接示意圖

表2 分子對接結合能（kcal/mol）

3 討論

黃褐斑是一種常見的獲得性色素沉著性疾病，多由暴露于外部因素、激素水平異常、遺傳易感性以及皮膚炎性反應引起[8]。其病理表現為黑素細胞活化、纖維變性、基底膜帶改變、血管化增加以及肥大細胞計數增加[9-10]。這提示黃褐斑不僅是一種局限于黑素細胞的疾病，更是一種光老化疾病[11]。桃紅四物湯已被發現具有抗炎鎮痛、抗氧化、調節免疫、調節血管微循環等作用[7]。目前用于多種皮膚病的臨床治療當中，但其治療黃褐斑的機制尚未明確。

本研究通過網絡藥理學挖掘出桃紅四物湯活性成分58個，對應桃紅四物湯靶基因11 139 個，發掘黃褐斑疾病靶點55 個，兩者取交集得到53 個交集靶點。其中桃紅四物湯的核心成分為葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、（+）-兒茶素、木脂素、膽固醇、黃芩苷、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚。核心藥物活性成分主要可以分為以下幾類：①多酚類：槲皮素、（+）-兒茶素、木脂素、黃芩苷、木犀草素、山奈酚；②固醇類：膽固醇、β-谷甾醇；③萜類：β-胡蘿卜素；④維生素類：葉酸。多酚具有消除炎性反應、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、免疫調節、降糖降脂等多種作用，可以通過調控PKA/CREB/MITF 通路和ROS 的產生來抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，還能調節腸道屏障功能，通過腸腦軸對代謝、神經、內分泌和免疫產生影響[12-13]。研究表明，固醇類化合物與抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗菌和免疫調節等多種作用有關，其中β-谷甾醇可以抑制腸道對膽固醇的吸收，膽固醇參與囊泡的合成與釋放，能調節細胞信號交流和分泌功能[14-15]。萜類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗病毒、抗癌、抗感染、保肝等[16]。類胡蘿卜素是膚色的影響因素之一，作為抗氧化劑抑制ROS起到光保護作用，還具有預防皮膚老化和皮膚癌的作用[17-18]。葉酸又稱維生素B9，參與光生物學過程，研究發現其可抑制ALB 的糖基化，減少氧化應激和細胞炎癥的發生，調節黑色素的生物合成[19-20]。

本研究通過富集分析與分子對接技術推測，桃紅四物湯可能通過調控ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 等靶點，來干預黑色素生成、內分泌抵抗、Rap1 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等生物過程，最終實現對黃褐斑的治療作用。ALB 負責調節人體生理功能，是人體血漿抗氧化能力的主力軍，已被廣泛用作血管內皮生長因子、干擾素、白介素、抗體分子等的穩定劑[21]。VEGFA 參與許多血管生成依賴性疾病的發生及其進展，有研究報道，通過ATM-SerRS 通路介導可以控制紫外線暴露時VEGFA 的表達，從而達到預防紫外線造成的血管生成相關病理變化的目的，如皮膚老化、皮膚腫瘤形成等[22]。此外，VEGF 還受ROS 水平的影響，ROS 導致的線粒體DNA 損傷會抑制VEGF 的上調，導致血管生成受損[23]。ESR1 參與雌激素分泌、內分泌抵抗、乳腺癌等多個信號通路，驅動內分泌抵抗和腫瘤進展，突變后能促進內質網轉錄活性[24]。CD4 位于T 細胞表面，與免疫密切相關，已有研究發現光暴露導致的皮膚病變上的炎性浸潤主要由CD4+T 細胞、CD68+巨噬細胞和肥大細胞組成，這些細胞通過增強促炎介質的合成，可以進一步激活酪氨酸酶，從而促進黑色素生成[25]。分子對接中CREB1 與藥物活性成分對接結果最優，CREB1 是黑色素生成通路中的關鍵蛋白，通過促進MITF 的表達激活酪氨酸酶，從而導致黑色素生成[26]。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術，分析了桃紅四物湯作用于黃褐斑的相關靶點及通路，推斷桃紅四物湯活性成分葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、（+）-兒茶素、木脂素等可通過調節ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 等相關靶點達到抗凝血、抗黑素、抗感染、抗氧化和抗凋亡的作用，進而實現對黃褐斑的治療作用。本研究為黃褐斑的中藥治療遣方用藥提供了借鑒，為課題組后續實驗提供了理論依據。但本研究的結果受數據庫更新情況、數據庫間信息差異、疾病研究進展等問題的限制，可能存在一定的偏倚，仍需要通過進一步的臨床和實驗研究加以驗證。