IL-33促進非小細胞肺癌EMT的研究

許姣 湯建磊 孫慧元 張憲

據GLOBOCAN的數據顯示,全球新發肺癌患者約210萬例,死亡180萬例,分別占全球癌癥發病率和死亡率的11.4%和18%[1]。2020年,我國新增肺癌82萬例,71.5萬與肺癌相關的死亡病例[2]。可見,肺癌是發病率和病死率極高的惡性腫瘤。隨著靶向治療、免疫治療的應用,肺癌預后顯著改善,但轉移仍是死亡的主要原因。上皮細胞-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition ,EMT)是指上皮細胞轉化成間充質細胞的過程,可以松解細胞-細胞粘附并賦予細胞遷移和侵襲特性[3]。有研究證明乳腺癌、結直腸癌、頭頸癌等腫瘤EMT轉錄組特征與腫瘤預后差高度相關[4-6]。

2005年,Schmitz等發現了IL-1家族細胞因子IL-33,其組成性表達于內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等[7]。因此,本文將進一步探索白介素家族成員IL-33通過EMT參與NSCLC的過程。

資料與方法

一、研究對象

本研究已獲得武進人民醫院倫理委員會批準(【2017】90號文件),選取醫院病理組織學確診為NSCLC的50名患者為研究對象,選擇癌旁組織作為對照。

二、材料和試劑

A549、SK-MES-1細胞株購自上海中科院細胞庫,重組人 IL-33 (R&D) ,GAPDH 兔抗人單克隆抗體(BioBMW)、IL-33抗人多克隆抗體(R&D)、 ST2/IL-33R 多克隆抗體(R&D)、E-cadherin 兔抗人多克隆抗體(BD)、Vimentin 兔抗人多克隆抗體(CST)、594偶聯驢抗山羊IgG(Jackson)、488偶聯驢抗小鼠IgG(Jackson)、辣根過氧化物酶 HRP 結合的羊抗兔 IgG 抗體(BioBMW)、辣根過氧化物酶 HRP結合的羊抗鼠 IgG 抗體(BioBMW)、CCK8 試劑盒(碧云天)。

三、方法

1. 通過funrich軟件分析IL-33在非小細胞肺癌中的生物學行為。

2. https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/網站下載非小細胞肺癌芯片GSE5843和GSE102287進行生存分析。

3. 免疫組織化學及免疫熒光染色評估非小細胞肺癌組織中IL-33、ST2、E-cadherin、Vimentin的定位和分布。

免疫組織化學染色：常規步驟包括組織切片二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,抗原高溫高壓法修復(pH9 EDTA),5%BSA封閉后滴加一抗4℃孵育過夜,PBS充分沖洗滴加二抗室溫封閉1h,蘇木素復染細胞核,光鏡觀察。

免疫熒光染色：采用間接免疫熒光雙標法(不同種屬來源的兩種抗體的熒光染色),常規步驟包括組織切片二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,抗原高溫高壓修復(pH9 EDTA),5%BSA封閉后分別滴加一抗混合A液、B液(IL-33和Vimentin混合液A和IL-33和E-cad混合液B)4℃孵育過夜,PBS充分沖洗后將對應的熒光二抗(Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG及Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Goat IgG)混合后滴加室溫孵育1h,封片熒光顯微鏡觀察。

4. CCK-8法確定IL-33最佳刺激濃度

用0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的 IL-33刺激A549、SK-MES-1細胞,探索IL-33最佳刺激濃度。將對數生長期的 A549、SK-MES-1細胞(4×104/mL)接種于96孔板,每組設3個復孔。培養24 h后棄原培養液,每孔加入含10%CCK-8的培養基 37℃孵育 4 h;棄培養液,每孔加150μL DMSO 振蕩振勻,檢測 490 nm 波長處的吸光值(OD)。 分組培養細胞：人肺泡上皮細胞(HPAEpiC)組、A549組、SK-MES-1組、A549+最佳濃度IL-33組、SK-MES-1+最佳濃度IL-33組。在96孔板中接種細胞懸液,設3個復孔。培養0h、24h和48h后換液為含10μL CCK8不含血清的培養基,孵育2h。使用SoftMax Pro軟件在450 nm波長下分別測定0h、24h和48h的吸光值(OD)。

5. 免疫印跡法檢測ST2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin的表達

分組培養細胞：HPAEpiC組、A549組、SK-MES-1組、A549+最佳濃度IL-33組、SK-MES-1+最佳濃度IL-33組。PBS沖洗6孔板的 A549、SK-MES-1細胞,加入蛋白裂解液、酶抑制劑,離心、收集細胞蛋白。制膠—上樣—電泳—轉膜—5%脫脂奶粉中封閉—孵一抗過夜(ST2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin抗體)—孵二抗—ECL顯影。Image J 軟件進行分析蛋白。

6. 劃痕實驗和Transwell實驗

劃痕實驗：將細胞接種在6孔板內,待細胞密度達到90%后,使用移液器吸頭輕輕地在水平線劃一條劃痕,垂直線劃三條劃痕。 PBS沖洗后換無血清培養基后培養48h。在0h、48h,取同樣的位置進行拍照。重復3次。

Transwell實驗：將細胞接種在6孔板內,當細胞密度達到90%時,消化細胞并計數,用無血清培養基重懸。向基質膠包被的小室上室加入200uL細胞懸液,下室加入800uL完全培養基。 培養24h,取出小室,PBS洗滌后甲醇固定30min,再用結晶紫染色2h,用棉棒擦去上室面細胞,于顯微鏡下觀察拍照并計數。重復3次。

四、統計學處理

Graphpad Prism 9.0軟件進行統計分析作圖。符合正態分布的計量數據以均數±標準差表示,多組樣本比較采用ANOVA,組間比較采用LSD-t檢驗。計數資料用頻數和%表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 認為差異有統計學意義。

結 果

一、 IL-33在非小細胞肺癌中的生物學行為

我們通過TCGA數據庫分析非小細胞肺癌中與IL-33共表達基因(按cor>0.3,P<0.05),輸入funrich軟件進行富集分析,發現IL-33不僅通過TCR信號、IL12、淋巴細胞與非淋巴細胞免疫相互作用等免疫調節途徑而且還可通過EMT參與NSCLC的進展和轉移(見圖1)。

圖1 IL-33在NSCLC中的生物學作用

IL-33通過TCR信號、CXCR4信號、GPCR信號、IL12信號、淋巴細胞與非淋巴細胞免疫相互作用、EMT等直接和間接促進NSCLC的進展和轉移

二、生存分析IL-33與非小細胞肺癌預后

LOGpc在線數據庫(https：//bioinfo.henu.edu.cn/DatabaseList.jsp)分析非小細胞肺癌芯片(芯片號：GSE5843和GSE102287),結果提示IL-33的表達與NSCLC預后密切相關;在NSCLC中,IL-33表達越低,患者生存時間越長,IL-33表達越高,患者生存時間越短(見圖2)。

圖2 IL-33與非小細胞肺癌預后

三、免疫組化及免疫熒光分析蛋白表達

免疫組化分析與癌旁組織相比,肺腺癌、鱗癌組織中IL-33、ST2在腫瘤細胞中的表達情況(見圖3A)。免疫熒光顯示與癌旁組織相比,高表達IL-33的癌細胞E-cadherin表達下降,Vimentin明顯增多(見圖3B、3C)。光學顯微鏡下按染色程度(0分陰性著色,1分淡黃色,2分淺褐色,3分深褐色),0-1分計為陰性,2-3分計為陽性。綠色免疫熒光表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱(+)=1,中(++)=2,強(+++)=3。紅色免疫熒光表現為淺紅色熒光、明顯紅色熒光和亮紅色耀眼熒光。弱(+)=1,中(++)=2,強(+++)=3。1分計為陰性,2-3分計為陽性。χ2檢驗統計分析后IL-33、ST2、Vimentin、E-cad表達在肺腺癌與肺鱗癌之間無明顯差異(P>0.05,見表1)。

表1 IL-33、ST2、Vimentin、E-cad表達情況

圖3 IL-33、ST2、E-cad和Vimentin在NSCLC組織中的表達

四、 不同濃度 IL-33 對A549、SK-MES-1細胞增殖的影響

CCK-8結果表明,用0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的 IL-33刺激A549、SK-MES-1細胞48h,10ng/mL的IL-33刺激時細胞活力最大(P<0.05,見圖4A)。在分組培養48h后,A549+最佳濃度IL-33組細胞活力明顯高于HPAEpiC組、A549組(P<0.05),SK-MES-1+最佳濃度IL-33組細胞活力明顯高于HPAEpiC組、SK-MES-1組(P<0.05,見圖4B)。

圖4 IL-33對A549、SK-MES-1細胞增殖的影響

五、 IL-33促進 A549、SK-MES-1細胞遷移和侵襲

劃痕實驗表明 IL-33組A549、SK-MES-1細胞遷移的距離較對照組長(圖5A,P<0.05),Transwell實驗表明IL-33組A549、SK-MES-1細胞侵襲細胞數比對照組多(圖5B,P<0.05)。

圖5 IL-33促進 A549、SK-MES-1細胞遷移和侵襲

六、 IL-33調節 A549、SK-MES-1細胞中相關蛋白質的表達

與HPAEpiC組相比,A549、SK-MES-1組ST2、Vimentin、MMP9、E-cadherin表達量明顯增加(P<0.05,見圖6),最佳濃度10ng/mL IL-33刺激A549、SK-MES-1細胞后ST2、Vimentin、MMP9表達量顯著增加,而E-cadherin顯著下降(P<0.05,見圖6)。

圖6 各組細胞中ST2、Vimentin、MMP9、E-cadherin蛋白的表達

討 論

目前非小細胞肺癌的發生發展機制尚不完全明確。腫瘤微環境是一個復雜且不斷演化的環境,癌細胞可以通過分泌各種細胞因子、趨化因子和其他因子來功能性地塑造其微環境,其中細胞因子是腫瘤微環境中重要組成部分,在腫瘤的發展和擴散中起著關鍵作用[8]。環境刺激驅動下,腫瘤細胞會發生表型變化促進上皮性腫瘤的轉移過程,使腫瘤細胞能夠適應腫瘤微環境變化。越來越多的研究強調了癌癥相關EMT與慢性炎癥之間的聯系。炎癥介質如可溶性因子、氧化應激或缺氧可以促進癌細胞獲得EMT樣特征[9-10]。同時,EMT衍生的癌細胞可以產生促炎介質,如細胞因子,趨化因子和基質金屬蛋白酶(MMPs)促進與癌癥相關的炎癥,從而建立一個可能有助于維持EMT表型和促炎環境[11-12]。

IL-33是一種在炎癥和免疫過程中重要的信號分子,在腫瘤中與EMT密切相關。Landskron G.等發現IL-33可誘導人結腸癌細胞(HT29)間充質表型的發生[13]。在乳腺癌細胞中IL-33以劑量、時間不同濃度IL-33對A549、SK-MES-1細胞刺激48h時,隨著濃度的增加細胞活力先增強再下降,與0ng/mL、1ng/mL組相比,5ng/mL、50ng/mL組細胞活力增強(▼P<0.05),與5ng/mL、50ng/mL組相比,10ng/mL為最佳刺激濃度,細胞增殖活力最強(▼▼P<0.05)。與HPAEpiC組相比,A549、SK-MES-1細胞經IL-33(10ng/mL)處理后的細胞活力增強(▼P<0.05),與A549、SK-MES-1組相比,A549+IL-33組(10ng/mL)、SK-MES-1+IL-33組(10ng/mL)細胞增殖能力最強(▼▼P<0.05)依賴性通過IL-33/ST2/COT促進EMT參與乳腺腫瘤發生[14]。膠質瘤細胞中IL-33通過ST2激活JNK信號通路,上調MMP2和MMP9,促進EMT過程參與膠質瘤細胞的侵襲和遷移過程[15-16]。Xie C.等證明IL-33處理肝癌干細胞(CSCs)后激活p38,增加CSCs標志物的表達和EMT樣變化[17]。胃癌中IL-33通過st2L依賴的方式激活ERK1/2-SP1-ZEB2通路,誘導胃癌細胞上皮-間質轉化[18]。Yue Y.等證明IL-33可通過NF-κB途徑上調CCL2表達促進EMT參與食管鱗狀細胞癌(ESCC)轉移[19]。可見,IL-33在腫瘤EMT中發揮重要作用。

血清IL-33在非小細胞肺癌患者中顯著升高,且與浸潤深度、晚期及遠處轉移密切相關[20]。目前有關IL-33在NSCLC中的研究主要集中于免疫調節方面如IL-33結合DC、IL17RB+GATA3+、CD4+T等免疫細胞的受體ST2表達及細胞的擴增,通過誘導免疫衰竭和功能障礙等直接和間接促進腫瘤的進展和轉移[21-22]。我們通過TCGA數據庫分析IL-33不僅通過TCR信號、IL12、PD1/PDL1通路等免疫調節途徑而且還可通過EMT參與NSCLC的進展和轉移。本研究通過免疫組化發現肺腺癌、鱗癌組織中IL-33在腫瘤和成纖維細胞中都有定位,且與正常組織相比存在高表達,我們認為IL-33可能以自分泌或旁分泌的方式參與腫瘤進展機制。免疫組化結果提示肺腺癌、鱗癌組織中IL-33和ST2均有高表達,且外源IL-33刺激增加A549、SK-MES-1細胞ST2的表達,提示IL-33通過ST2在非小細胞肺癌中發揮作用。本研究者用外源IL-33刺激A549、SK-MES-1細胞促進其增殖、遷移及侵襲,且腫瘤細胞E-cadherin的表達顯著降低,間充質細胞標志物Vimentin、MMP9的表達明顯增加,這與肺癌組織免疫組化結果E-cadherin表達下降,Vimentin明顯增多一致。因此,我們推測非小細胞肺癌中IL-33自分泌或者旁分泌后,結合腫瘤細胞自身受體ST2表達使腫瘤細胞失去上皮細胞特征,獲得間質表型發生EMT直接和間接促進腫瘤的遷移和侵襲。可見IL-33在非小細胞肺癌中通過ST2參與EMT過程,干預IL-33可能抑制肺癌的轉移和侵襲,IL-33可能是肺癌治療的新靶點。