肺泡上皮細胞分泌的外泌體調控巨噬細胞極化在急性肺損傷中的作用

王鑫鑫,林樹梅*,趙冬冬,王學生

(1.沈陽農業大學動物科學與醫學學院,沈陽 110866; 2.沈陽康利生物科技有限公司,沈陽 110000)

膿毒癥是指宿主以臟器發生功能障礙為特征,對侵入的病原體產生失控反應而造成有生命危險的癥候群[1]。在機體眾多受損器官中,肺是膿毒癥最早且最容易受傷的靶器官,在膿毒癥發病早期可引起急性肺損傷(acute lung injury,ALI),造成病畜呼吸系統發生功能障礙,ALI甚至是導致膿毒癥動物死亡的罪魁禍首[2]。據調研發現,全國生豬感染膿毒癥的概率已經超過50%,超過一半的膿毒癥患畜會發展為ALI,而ALI的死亡率約為40%[3]。

“炎癥因子風暴”是ALI炎癥初期的主要表現,本質上是肺的急性炎癥反應過程[4]。不分“敵我”的炎癥因子,對動物機體造成持續性損傷。膿毒癥引起肺損傷的致病機理錯綜復雜,涉及肺內多種細胞間的相互作用,如肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells,AECs)、肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages,AMs)、中性粒細胞、T細胞等[5]。目前,對于ALI還沒有特定的治療方法。ALI的臨床治療主要包括肺保護性通氣和限制性液體管理,并輔助糖皮質激素、吸入性肺血管擴張劑、神經肌肉阻滯和體外膜肺氧合[6-7]。盡管上述治療方法能夠改善ALI的癥狀,但是會伴有長期的后遺癥,包括認知障礙、肺功能不全、肌肉無力等[8]。因此,迫切需要探尋安全有效的ALI治療新策略。

AMs是駐留在肺組織中的主要免疫細胞,在ALI的發病中扮演著重要角色[9]。AMs通過不斷地接受來自周圍或其他遠處細胞的外源信號,激活AMs,釋放過量的炎性細胞因子,促進炎癥反應的發生發展。最新研究發現,AMs與肺結構細胞密切相關[10]。AECs是具有大表面積的結構細胞,作為肺泡中病原體防御的第一道防線,在肺損傷過程中,AECs通常是最先被攻擊的細胞[11]。當肺部感染病原微生物時,AECs參與包括巨噬細胞在內的各種免疫細胞和炎癥介質的募集,免疫細胞在對抗病原微生物的同時,不可避免地損傷AECs,同時,受損的AECs也會以外泌體形式發出調節信息影響AMs的表型及功能。

外泌體是各類細胞主動分泌的納米級別的細胞外囊泡,外泌體能夠穿透細胞膜并靶向特定組織或細胞的能力,同時外泌體具有低免疫力原性,不會被免疫系統排斥。一些調節信息以外泌體為介質在結構性細胞與免疫細胞之間的交流中扮演著關鍵角色,成為細胞功能的重要調節劑[12]。研究表明,外泌體可以促進組織修復和血管生成,以促進缺血組織的重建,從而在多種疾病中顯示出很好的應用前景[13-15]。而且,外泌體在炎癥反應和自身免疫疾病中體現積極的作用[16-17]。還有研究表明,在ALI的發病過程中,AMs通過不斷地接收來自包括AECs源性的外泌體刺激發生極化反應,從而影響ALI的發生發展。外泌體的發現為ALI的治療開辟了新思路。

1 巨噬細胞極化在急性肺損傷中的作用

1.1 巨噬細胞極化分型

在炎癥和宿主防御中,巨噬細胞在肺組織中起著核心作用,是先天性固有免疫的重要組成部分[18]。在肺組織中,巨噬細胞群有三種不同的來源:氣道、肺泡和間質巨噬細胞[19]。肺中的巨噬細胞通過抗原呈遞,以及吞噬吸入的顆粒、由外來病原體誘導產生的細胞因子來清除抗原及異物[20]。巨噬細胞的表型不是一成不變的,在各種環境因素或不同的病理生理條件刺激下,將一種“活化型”轉化為另一種“活化型”是一個快速且可逆的過程。巨噬細胞極化主要分為兩種不同的極化狀態:經典活化型巨噬細胞(classically activated macrophages,M1)與選擇活化型巨噬細胞(alternatively activated macrophages,M2)[21-22]。其中,M2型巨噬細胞由M2a、M2b、M2c和M2d四種亞型組成[10]。它們被不同的刺激物激活,M2a巨噬細胞主要是由白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)和IL-13誘導產生,而M2b表型通常是由IL-1β或免疫復合物誘導形成,IL-10和糖皮質激素促進M2c巨噬細胞的合成,M2d型由腺苷A誘導2a受體激動劑和Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)協調誘導形成[23-24]。研究顯示[25],在ALI的發病過程中,表現出較強的促炎及抗原提呈能力的主要為M1型巨噬細胞;而發揮抗炎、修復組織和促進纖維化作用的主要是M2巨噬細胞。巨噬細胞這兩種不同的極化狀態有著截然相反的功能,甚至可以說是相互拮抗。

1.2 巨噬細胞極化的調控

巨噬細胞通過吞噬作用清除機體內“垃圾”,積極參與細胞外基質重塑、血管生成以及炎癥反應等過程[26]。巨噬細胞在ALI的發病機制中起著主要作用,極化時間和程度決定了疾病的嚴重程度和發展方向,M1型巨噬細胞與發病初期密切相關,而M2型巨噬細胞主要與ALI炎癥的恢復期有關[27]。巨噬細胞的極化可受多種因素的調節,包括miRNA、蛋白質、糖皮質激素及中草藥提取物等。其中,miRNA是通過調控mRNA的穩定性和翻譯過程來調節相關基因表達的一種小型非編碼RNA。研究人員發現干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)或TLR受體激動劑促進巨噬細胞向M1型極化過程中,表達水平發生明顯上升的為miR-155[28]。隨后發現,miR-155可以靶向作用于TLR4信號通路中促進巨噬細胞向M1表型轉化的髓樣分化因子88蛋白,上調促炎因子表達。而在IL-4誘導巨噬細胞從M1向M2表型轉變的過程中,miR-155下降明顯。彭巍[29]通過miRNAs基因芯片技術篩選正常肺泡上皮細胞來源的外泌體(AEC-Exo)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導肺泡上皮細胞來源的外泌體(LPS-AEC-Exo)的差異miRNA表達譜,獲得與炎癥反應密切相關的miR-92a-3p,證明LPS-AEC-Exo通過miR-92a-3p激活AMs中的核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)炎癥信號通路,誘導炎癥反應。脂肪間充質干細胞外泌體傳遞的miR-16-5p可以通過抑制TLR4促進巨噬細胞向抗炎M2型極化來改善盲腸結扎和穿孔誘導的膿毒癥小鼠的肺損傷[30]。Song等[31]證明與未經IL-1β處理的間充質干細胞來源的外泌體組相比,經IL-1β預處理的間充質干細胞來源的外泌體中miR-146a的表達顯著增強,并且外泌體miR-146a轉移至巨噬細胞導致其發生M2極化。Gu等[32]發現,將miR-124模擬物轉染單核巨噬細胞能夠通過促進甘露糖受體C1基因、殼酶蛋白、IL-10的表達促進巨噬細胞發生M2型極化。

除了miRNA之外,許多蛋白質和糖皮質激素也參與ALI中巨噬細胞極化和炎癥反應調節。Mittal等[33]發現在LPS誘導的小鼠ALI模型中,觀察到通過給小鼠氣管滴注TSG-6(tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6,TSG-6)可以治療肺損傷,其作用機制主要是促使M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉變,使促炎細胞因子的釋放減少,同時提高抗炎細胞因子水平。眾所周知,甲基強的松龍具有抗炎特性,被廣泛用于各種炎性疾病,包括ALI。已有研究證實,甲基強的松龍抗炎作用與促進AMs發生M2極化,從而有助于炎癥的消退和組織的修復有關[34]。近年來,研究者從中草藥提取物中分離出許多具有抗炎療效的成分,其中有一種為苯丙素苷類化合物Smiglaside A。研究發現,Smiglaside A能夠減輕LPS誘導的肺損傷,并增加小鼠的存活率。這與其在抑制巨噬細胞M1極化的同時,促進巨噬細胞M2極化有關,極化調節作用由腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine activated protein kinase,AMPK)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ)信號通路介導[35]。

2 肺泡上皮細胞外泌體調控巨噬細胞極化在急性肺損傷中的作用

2.1 肺泡上皮細胞的分類及作用

AECs具有較大的表面積,是保護肺免受各種侵害的物理屏障,對維持肺的完整性和生理功能起著重要作用,并積極參與肺的免疫反應[36-37]。AECs由兩種主要的細胞類型形成:肺泡I型細胞(alveolar epithelial type I cells,AECI)和肺泡II型細胞(alveolar epithelial type II cells,AECII)。鱗狀肺泡I型細胞占據肺泡的大部分表面積(90%以上),是一種很薄的細胞,有利于機體進行氣體交換,同時也非常容易受到損傷;另一種主要的細胞類型是呈立方體細胞的肺泡II型細胞,在肺泡上皮中所占比例約為10%,主要參與肺表面活性物質的合成、分泌和貯藏[38-40]。在ALI發病時,AECI主要參與促炎反應,而作為祖細胞的AECII,在肺損傷后肺泡上皮的再生過程中發揮作用,同時,免疫細胞也可以通過多種生長因子和細胞因子的分泌而受到影響[41-42]。

2.2 外泌體介導細胞間通訊緩解急性肺損傷

細胞間通訊對于多細胞生物應對和適應環境變化十分關鍵,通常通過細胞間直接接觸或分泌可溶性介質來完成,是免疫反應的基石。20世紀60年代末,Bonucci[43]和Anderson[44]觀察到軟骨細胞分泌出約100 nm的小泡,并初次對這種小泡進行描述。通過使用電子顯微鏡觀察發現,這種直徑40～100 nm小泡外觀呈“圓盤狀”。隨著研究的逐漸開展,這種由細胞主動釋放的納米級囊泡被命名為“外泌體”。外泌體是由細胞膜以出芽方式形成的多泡體,富含特定的蛋白質、核酸、脂質,幾乎所有的細胞都具有分泌外泌體的能力,如網狀細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞、上皮細胞和腫瘤細胞等[45]。細胞釋放出的外泌體具有多種多樣的功能,如重塑細胞外基質和向其他細胞傳遞信號,這種細胞間的囊泡運輸在維持機體健康和疾病發生發展等許多方面發揮著關鍵作用,包括生長發育、免疫、組織穩態、腫瘤、神經退行性疾病等[46]。研究發現,在ALI的發生發展過程中,線粒體產生的活性氧導致線粒體DNA轉錄缺陷和線粒體功能障礙,受損的線粒體DNA會進一步引發肺部的不良反應[47-48],而間充質干細胞衍生的外泌體將攜帶的線粒體轉移至巨噬細胞,能夠增加巨噬細胞氧化磷酸化能力,增強巨噬細胞的吞噬能力,改善LPS誘導的肺損傷[49]。同時,Silva等[50]證實,間充質干細胞衍生的外泌體轉移至AECs可以緩解LPS引發的線粒體功能障礙,并恢復了AECs屏障完整性。由此可見,外泌體可能成為ALI的潛在治療手段。

最新發現,AECs分泌的外泌體可作為細胞間交流的通訊介質,參與肺部疾病的發生發展。Chen等[51]發現,AECs通過外泌體攜帶的HOX反義基因間RNA髓系(Homeobox A transcript antisense RNA myeloid-specific 1,HOTAIRM1)競爭性地與肺成纖維細胞上的miR-30 d-3p結合,促進肺成纖維細胞的增殖和分化,從而加速間質肺纖維化的發生。Yu等[52]使用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)刺激AECs產生外泌體(OAEs),OAEs可通過上調MMP14表達和裂解CD100激活巨噬細胞,從而增強中性粒細胞和單核細胞性氣道炎癥。此外,由AECs衍生的外泌體在哮喘性支氣管炎癥狀態下可以誘導未分化的巨噬細胞增殖和趨化性增加[53],在治療以肺損傷-肺纖維化為特征的氣道疾病中,AECs衍生的外泌體也表現了積極的作用[54]。因此,AECs分泌的外泌體是肺部結構細胞與免疫細胞聯系的重要橋梁,成為治療肺部疾病的新方法。

2.3 肺泡上皮細胞外泌體調控巨噬細胞極化影響急性肺損傷

AMs與肺結構細胞(AECs)存在密切聯系,特別是AECs能夠以外泌體方式調節AMs發生極化反應[55]。Lee等[56]發現酸誘導AECs釋放的微囊泡可以引起AMs發生極化反應,且在高氧條件下,AECs衍生的細胞膜囊泡可以通過miRNA激活AMs發生M1極化,介導炎癥反應。Moon等[57]發現通過傳遞促凋亡因子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartatespecific protease-3,Caspase-3),可使高氧誘導AECs釋放的外泌體刺激AMs發生M1極化,釋放大量炎癥因子,從而導致肺部發生炎癥反應。

作為miRNA的載體,外泌體可以將miRNA轉移至相應的受體細胞,參與細胞間通訊,影響肺部微環境,調節肺部疾病的病理過程。Liu等[58]在體外使用LPS刺激AECs來模擬炎癥發生,與AMs進行共培養,發現AECs分泌的外泌體可通過攜帶miR-92a-3p介導AECs和AMs之間的串擾,激活巨噬細胞發生M1極化,誘導肺部炎癥反應的發生。除此之外,李建軍等[59]發現結核分枝桿菌感染情況下,AECII來源的外泌體可通過miR-145刺激AMs向M2型極化并抑制M1型極化,對抗炎癥反應。因此,人們可通過影響AECs外泌體攜帶的miRNA來調控巨噬細胞的極化方向,從而減輕ALI的損傷程度(圖1)。

圖1 肺泡上皮細胞分泌的外泌體調控巨噬細胞極化在急性肺損傷中的作用[本文圖片使用在線繪圖軟件科研者之家(https://www.home-for-researchers.com/static/index.html)繪制]Fig.1 Role of exosomes secreted by alveolar epithelial cells in regulating macrophage polarization in acute lung injury[The images in this article are drew by using the online drawing software HOME for Researchers(https://www.home-for-researchers.com/static/index.html)]

此外,AMs對AECs的功能調節也可以通過外泌體來進行。研究表明,AMs源性的外泌體中含有與細胞因子信號傳導有關的抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling,SOCS),該蛋白可抑制炎癥性轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)信號通路[60]。AECs幾乎不表達SOCS蛋白,但AECs分泌的前列腺素E2和IL-10,可增加AMs含SOCS蛋白的外泌體分泌,含有SOCS蛋白的外泌體被AECs攝取并下調細胞因子誘導的STAT活化,維持AECs處于靜止狀態并限制正常AECs的惡性發展[61]。因此,在AECs與AMs之間的信息交流中,外泌體可以作為一個重要的介質,從而對肺部的炎癥起到調節作用。

3 小結與展望

ALI是一種嚴重且潛在致命的急性炎癥性肺部疾病,控制“炎癥因子風暴”是控制該疾病發生發展的關鍵。相關研究表明,來源AECs的外泌體可作用于肺組織中的結構細胞,介導肺部疾病的發病,而AMs是肺組織中主要的免疫細胞,AMs極化又是啟動ALI炎癥反應的關鍵調節因子。因此,通過調控AECs釋放的外泌體成分影響AMs極化,可調控炎癥反應,有望為ALI治療開辟新思路。