甘草查爾酮A與三種抗生素聯用對產氣莢膜梭菌感染小鼠的治療作用

周文惠,包紅霞,王俊豪,黃遠玲,王文惠,郝海紅,2,3,4,5*

(1.華中農業大學, 農業微生物資源發掘與利用全國重點實驗室,武漢 430070;2.動物育種與健康養殖前沿 科學中心,武漢 430070;3.華中農業大學,農業農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室,武漢 430070; 4.華中農業大學-深圳營養與健康研究院,深圳 518000;5.石河子大學動物科技學院,石河子 832000)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,CP)是革蘭陽性厭氧條件致病菌,感染可引起多種畜禽疾病,包括雞壞死性腸炎、羊氣性壞疽等[1-2]。產氣莢膜梭菌作為一種食源性人畜共患病原菌,引起多種腸道疾病,對人類健康和公共衛生造成了嚴重的威脅。目前,抗生素在治療產氣莢膜梭菌感染中仍發揮極大的作用,然而,由于抗生素的濫用與不合理使用等多種因素,導致產氣莢膜梭菌耐藥性增強[3-4]。中藥作為中國傳統文化的瑰寶和新藥研究領域的重點研究對象,以其不易誘導產生耐藥性、成本低、殘留少、毒副作用小等優點成為當前研究熱點,對多種疾病的治療也有一定作用[5-6]。中藥八大碗“參苓術草、芎歸地芍”中的草即為甘草,是常用且重要的中藥材,其應用范圍廣泛,有“十方九草”之說。甘草查爾酮A(licorice chalcone A, LCA)是從甘草中分離出來的一種新型類黃酮類物質,在甘草中的含量遠遠高于其他成分,具有抗癌、抑菌、抗炎、抗氧化、降血糖、保肝、抗寄生蟲、減少肥胖等多種藥理活性[7-13],其中抑菌作用是被顯著低估的一種重要的藥理作用[14-17],研究表明,LCA對產氣莢膜梭菌具有明顯抑制作用[18],因此,本試驗以LCA為代表藥物,探究其與多種抗生素聯用對產氣莢膜梭菌的抑菌作用,為抗生素與中藥單體聯用抗產氣莢膜梭菌的應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小檗堿標準品(純度大于98%)、LCA標準品(純度大于98%)、四環素(tetracycline,TCN)標準品(純度大于95%)購自上海源葉生物科技有限公司;克林霉素(clindamycin,CLDM)標準品(純度大于87.2%)購自中國藥品生物制品檢定所;替米考星(tilmicosin,TMS)標準品(純度95.3%)購自中國獸醫藥品監察所。

藥敏板(動物源細菌耐藥性檢測板-魏氏梭菌1#、2#、3#)購自一諾康(天津)科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 A型產氣莢膜梭菌標準菌株(CVCC2030)由華中農業大學國家獸藥殘留基準試驗室提供。將甘油凍存菌液劃線于強化布氏瓊脂培養皿,于37 ℃厭氧條件培養18～24 h,挑取單個菌落接種于FTG培養基于上述相同條件下培養8～12 h,劃線接種于強化布氏瓊脂培養皿18～24 h,刮取菌落用無菌PBS調麥氏比濁0.5(此時活菌數約為1×108CFU·mL-1),制成細菌懸液。

1.2.2 藥敏試驗 參照“1.2.1”的方法配制菌液;采用微量肉湯稀釋法[18],檢測CLDM、TMS、TCN等20種抗生素和LCA、小檗堿(berberine, BBR)2種中藥單體對產氣莢膜梭菌標準菌株CVCC2030的敏感性,測量其單獨作用于產氣莢膜梭菌的MIC值。采用棋盤法對該20種抗生素和2種中藥單體進行聯合藥敏試驗,測量其聯合作用時的FIC值。計算FIC指數,FIC指數=甲藥聯合使用時的FIC/甲藥單獨使用時的MIC+乙藥聯合使用時的FIC/乙藥單獨使用時的MIC。當FIC指數≤0.5時,表示有協同作用;當0.52時,表示有拮抗作用。選擇有協同作用的兩種藥物進行后續試驗。

1.2.3 殺菌曲線的繪制 細菌活化后挑取單菌落接種于100 mL FTG肉湯培養基中,37 ℃ 過夜厭氧培養。使用FTG培養基將過夜培養的菌液稀釋100倍,分為10組,每組3個平行,各組藥物濃度見表1,于37 ℃條件下厭氧培養。分別于之后的24 h內每隔2 h從每管內取樣100 μL菌液,稀釋涂布于強化布氏培養皿,培養24 h后分別計數,繪制不同藥物種類和濃度作用下產氣莢膜梭菌的殺菌曲線[18-21]。

1.2.4 溶血試驗 將羊血用PBS清洗后取1 mL沉淀用PBS稀釋為2%體積的紅細胞懸液,將稀釋好的紅細胞懸液置于4 ℃條件下保存。將過夜培養后的菌液用無菌PBS稀釋至0.5 MCF(麥氏濁度單位),設置11組,A組為無藥陽性對照,B組為PBS無菌陰性對照,試驗組加入菌液和不同濃度的藥物(表2),37 ℃溫水孵育30 min,加入2 mL紅細胞懸液,再次溫水孵育30 min后取出,10 000 r·min-1

表1 殺菌曲線分組設置Table 1 Sterilization curve grouping settings μg·mL-1

離心2 min,取上清液測量其OD532 nm。根據公式計算其溶血定量,溶血定量(%)=(樣品OD532 nm-陰性OD532 nm)/(陽性OD532 nm-陰性OD532 nm)×100%,設定無藥A組為完全溶血,溶血定量100%,無菌B組為完全不溶血,溶血定量為0%。

表2 溶血試驗分組設置Table 2 Hemolysis test grouping settings μg·mL-1

1.2.5 細菌的遷移力——滑動試驗 在BHI瓊脂培養基中加入不同濃度的LCA和TMS,混勻后制備含藥培養皿,用打孔器均勻打孔。按“1.2.1”方法配制菌液至1×108CFU·mL-1,將5 μL菌液滴入所制備的含藥培養皿中,37 ℃厭氧培養72 h,觀察其在平板上形成的菌苔大小與形狀。比較其遷移距離在藥物影響下的變化[22-25]。

1.2.6 氣性壞疽模型的建立 氣性壞疽模型使用25只SPF級6～8周齡BALB/c 雄鼠進行試驗。將小鼠分為5組,其中4組分別為1×109、108、107、106CFU·mL-14種不同濃度的菌液,一組為PBS陰性對照,取0.1 mL右后肢肌肉注射感染小鼠,一段時間后處死,解剖觀察其感染程度并進行分離鑒定,確定最佳菌液濃度[18]。

1.2.7 產氣莢膜梭菌感染的治療試驗 將70 只6～8周齡的BALB/c小鼠分為14個組,每組5只。每只小鼠右后肢肌肉注射0.1 mL 1×108CFU·mL-1菌液,次日開始對小鼠進行灌胃給藥,A組和B組分別為陰性和陽性對照組,治療時給0.2 mL 50%體積濃度的DMSO,其他組為試驗組,分別給予不同濃度和種類的藥物,連續給藥6 d[26-28],每天觀察小鼠的外觀和精神狀態,詳細記錄不同組小鼠在治療過程中的死亡情況及死亡時間,及時剖殺死亡小鼠,觀察其病理變化并拍照記錄,第7天全部處死、觀察病理變化。

1.2.8 細菌分離鑒定 取病變組織樣品,分離純化細菌后進行PCR鑒定。PCR引物:cpa.F:5′-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3′;cpa.R:5′-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3′。采用25 μL PCR反應體系:TaqDNA聚合酶12.5 μL,cpa上、下游引物各1 μL,菌液2 μL,ddH2O 8.5 μL,設立陰性與陽性對照。PCR反應條件:94 ℃預變性 5 min;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共30個循環;72 ℃ 10 min。擴增產物長度約為402 bp。

1.2.9 組織切片與HE染色觀察 無菌取各組小鼠感染的腿部肌肉組織,置于4%甲醛溶液中固定24 h,送至百仟度生物公司切片分析。

1.3 數據分析

2 結 果

2.1 藥敏試驗

藥敏試驗結果如表3、4所示,在20種抗生素中,共有紅霉素等6種抗生素與LCA有相加作用,吉他霉素等4種抗生素與LCA有協同作用;吉他霉素等4種抗生素與BBR有相加作用,喹烯酮等3種抗生素與BBR有協同作用。

表3 甘草查爾酮A(LCA)藥敏試驗和聯合藥敏結果Table 3 Licorice chalcone A(LCA) drug sensitivity test and combined drug sensitivity results

根據試驗結果顯示,LCA與多種抗生素聯用的協同作用普遍優于小檗堿;在與LCA作用的抗生素中,TCN、TMS、CLDM FIC指數最低,與LCA協同作用最好。

表4 小檗堿(BBR)藥敏試驗和聯合藥敏結果Table 4 Berberine (BBR) drug sensitivity test and combined drug sensitivity results

2.2 殺菌曲線

每隔2 h取體系中菌液涂板計數,以時間為橫坐標,體系中菌落數的負對數為縱坐標,繪制殺菌曲線,如圖1～3所示。

圖1 甘草查爾酮A作用下產氣莢膜梭菌CVCC2030的殺菌曲線Fig.1 Bactericidal profile of Clostridium perfringens CVCC2030 under the action of licorice chalcone A

圖3 LCA與TMS聯合作用下產氣莢膜梭菌CVCC2030的殺菌曲線Fig.3 Bactericidal profile of Clostridium perfringens CVCC2030 under the action of licorice chalcone A and tilmicosin

由圖1、2可以看出,LCA對細菌生長的抑制作用不明顯,TMS對產氣莢膜梭菌的抑制作用較強,生長情況顯著受到抑制,細菌活性明顯下降,2×MIC濃度的TMS可在14 h內將細菌殺滅至檢測線(10 CFU·mL-1)以下,4×MIC濃度的TMS可在12 h內將細菌殺滅至檢測線以下,且后期無恢復生長,濃度越高,殺菌速度越快,所需時間越短,表明體外條件下TMS對產氣莢膜梭菌CVCC2030的殺菌效果呈現濃度依賴性。

與圖3結果對比,在相同濃度下LCA和TMS單獨使用對產氣莢膜梭菌生長僅起到抑制作用,不能完全殺滅,但聯合作用時細菌生長停止,幾乎全部死亡。低于MIC濃度的藥物聯合作用時,對細菌的生長有一定的抑制作用,但8 h后恢復生長。

2.3 溶血試驗

根據溶血試驗結果(表5)顯示,LCA與TMS對產氣莢膜梭菌的溶血效果均有抑制作用,細菌溶血性顯著降低,聯合作用處理后抑制作用更顯著,I組與D組和H組相比,溶血定量顯著降低,協同效果作用明顯。且不同濃度的藥物作用于細菌后其溶血定量有明顯的濃度梯度,其溶血抑制作用存在濃度依賴性,高濃度藥物對細菌的溶血抑制作用較強。

2.4 滑動試驗

如圖4所示,LCA和TMS對產氣莢膜梭菌的生長都有抑制作用,然而在本次研究結果中卻發現低劑量的LCA單獨使用時與空白對照組相比,菌苔平均直徑略有增大,高濃度時無肉眼可見的菌苔生長;TMS單獨使用時對細菌遷移的抑制作用隨濃度升高而增強,對產氣莢膜梭菌的運動性無增強作用;當LCA與TMS聯合使用時,菌苔直徑顯著增大,但菌苔內細菌密度有一定的降低。

表5 溶血試驗結果Table 5 Hemolysis test results %

A為空白對照組;B所用含藥培養基為LCA 1 μg·mL-1 ;C所用含藥培養基為TMS 1 μg·mL-1;D所用含藥培養基為LCA 0.5 μg·mL-1+TMS 0.5 μg·mL-1 A. The blank control; B. The drug-containing medium used is LCA 1 μg·mL-1; C. The drug-containing medium used is tilmicosin 1 μg·mL-1; D. The drug-containing medium used is LCA 0.5 μg·mL-1+tilmicosin 0.5 μg·mL-1圖4 滑動試驗中菌苔大小及形狀Fig.4 Size and shape of the fungal moss in the sliding test

2.5 小鼠氣性壞疽模型的建立

根據感染情況,選擇使用1×108CFU·mL-1菌液進行肌注,成功建立小鼠腿部氣性壞疽模型。

2.6 鼠源產氣莢膜梭菌的分離鑒定

PCR結果如圖5,成功分離鼠源產氣莢膜梭菌16株。

M. DL2000 DNA相對分子質量標準;1～16. 樣本;+. 陽性對照;-. 陰性對照 M. Marker 2000;1-16. Sample to be tested;+. Positive control;-. Negative control圖5 16株鼠源產氣莢膜梭菌的PCR鑒定結果Fig.5 PCR identification of 16 strains of Clostridium perfringens of murine origin

2.7 產氣莢膜梭菌感染治療試驗

小鼠腿部肌肉大體觀察和HE染色切片結果如圖6、7。

感染1 h后,陰性對照組小鼠精神良好、皮毛光亮、行動靈敏;陽性對照組和試驗組均表現出右后肢行動不便、跛行、精神萎靡等癥狀。試驗組中高劑量LCA組全部死亡,高濃度TCN組死亡率達80%,見表6。

a.陰性對照組;b、c.陽性對照組;d.TCN 20 mg·mL-1組;e.TCN 80 mg·mL-1組;f.LCA 20 mg·mL-1 TCN 40 mg·mL-1組;g.TMS 10 mg·mL-1組; h.TMS 50 mg·mL-1組; i.LCA 20 mg·mL-1 TMS 10 mg·mL-1組; j.CLDM 5 mg·mL-1組; k.CLDM 10 mg·mL-1組; l.CLDM 50 mg·mL-1組;m.LCA 20 mg·mL-1組;n.LCA 20 mg·mL-1CLDM 40 mg·mL-1組 a. Negative control group; b and c. Positive control groups; d. Tetracycline 20 mg·mL-1 group; e. Tetracycline 80 mg·mL-1 group; f. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 tetracycline 40 mg·mL-1 group; g. Tilmicosin 10 mg·mL-1 group; h. Tilmicosin 50 mg·mL-1 group; i. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 tilmicosin 10 mg·mL-1 group; j. Clindamycin 5 mg·mL-1 group; k. Clindamycin 10 mg·mL-1 group; l. Clindamycin 50 mg·mL-1 group; m. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 group; n. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 clindamycin 40 mg·mL-1 group圖6 病理組織觀察結果Fig.6 Pathological tissue observation results

A.陰性對照,未進行感染處理;B.陽性對照,感染后未進行治療;C.LCA 20 mg·mL-1;D. CLDM 5 mg·mL-1;E. CLDM 10 mg·mL-1;F. CLDM 50 mg·mL-1;G. TCN 20 mg·mL-1;H. TCN 80 mg·mL-1;I. TCN 20 mg·mL-1+LCA 20 mg·mL-1;J. TMS 10 mg·mL-1;K. TMS 50 mg·mL-1;L. TMS 10 mg·mL-1+LCA 20 mg·mL-1 A. Negative control, no attack treatment; B. Positive control, no treatment after attack; C. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1; D. Clindamycin 5 mg·mL-1; E. Clindamycin 10 mg·mL-1; F. Clindamycin 50 mg·mL-1; G. Tetracycline 20 mg·mL-1; H. Tetracycline 80 mg·mL-1; I. Tetracycline 20 mg·mL-1+Licorice chalcone A 20 mg·mL-1; J. Tilmicosin 10 mg·mL-1; K. Tilmicosin 50 mg·mL-1; L. Tilmicosin 10 mg·mL-1+Licorice chalcone A 20 mg·mL-1圖7 小鼠右后肢肌肉HE染色結果(200×)Fig.7 HE staining results of right hind limb muscles of mice (200×)

給藥治療后發現,LCA單獨使用時效果不顯著,高濃度LCA致死率高達100%,50 mg·mL-1CLDM抑菌效果較好,但體內情況下CLDM與LCA協同后效果未見顯著增強;LCA與TMS和TCN體內協同作用較明顯,抗生素與LCA聯用后抑菌效果明顯優于兩種抗生素單獨使用,高濃度TCN毒性較強,致死率高,TMS組低濃度組未見死亡,高濃度組致死率低,安全性高,綜合效果優于TCN。

剖檢時發現陽性對照組和各試驗組右后肢均呈現不同程度的腫脹,部分小鼠右后肢毛發脫落,皮膚可見充氣水泡樣腫大,觸感堅實,剖開后見小鼠腿部肌肉組織顏色較深,有不同程度的出血和膿腫塊,如圖6中b、c所示,陰性對照組小鼠腿部肌肉呈肉粉色,無出血和膿腫,如圖6a所示。與陽性對照組相比,各試驗組的腫脹程度可見不同程度的減輕,但與陰性對照組相比仍有一定改善。

表6 感染及治療前后小鼠病理變化及死亡率Table 6 Pathological changes and mortality of mice before and after the attack and treatment

隨機選擇部分小鼠病變組織進行切片,如圖7,陰性組中多核肌細胞的細胞核位于細胞邊緣,橫切肌細胞為形態不規則的多邊形,相鄰細胞排列緊密,細胞之間界限清晰,肌束之間間隙大小均勻,組織內未見壞死、炎癥、出血、水腫等明顯病理性改變,組織形態結構正常;陽性對照組視野中可見肌肉組織局部肌細胞壞死,組織形態遭到破壞,壞死肌纖維被增生的纖維結締組織取代,伴有大量炎性細胞浸潤。LCA高劑量組全部死亡,低劑量組視野中可見肌細胞結締組織增生,細胞之間間隙顯著增大,組織排列疏松,伴有炎性細胞彌散性浸潤,但肌細胞壞死較陽性組少,組織形態仍可見。

低劑量CLDM組視野中肌肉組織局部仍可見肌細胞大面積壞死和纖維結締組織增生,伴有大量炎性細胞浸潤;高劑量CLDM組肌束間結締組織輕度增生,肌束間隙輕度增大,炎性細胞少量彌漫性浸潤,抑菌效果顯著。CLDM與LCA聯用組與單獨使用時相比效果未見顯著增強。

TCN單獨作用時低劑量組效果不明顯,肌細胞壞死明顯,但與LCA聯用后組織僅有少量炎性細胞彌散性浸潤,但肌纖維形態結構較完整,細胞未見壞死、出血等病理變化,可見TCN與LCA聯用能夠顯著提升治療效果;高劑量組鏡下細胞排列緊密,少見有炎性細胞和結締組織增生,治療效果顯著,但致死率較高,達80%。

TMS低劑量組鏡下視野中肌肉組織內部分肌細胞壞死,肌束形態結構破壞,由大量結締組織增生取代,肌束間隙有大量炎性細胞彌散性浸潤;同濃度TMS與LCA聯用后,肌細胞形態結構相對完整,組織細胞排列輕度疏松,炎性細胞浸潤減少,協同作用顯著,TMS高劑量組肌細胞輕度溶解,肌細胞胞質淡染,結締組織增生和炎性細胞浸潤不明顯。

3 討 論

隨著畜牧業的蓬勃發展,細菌感染導致的畜禽疾病日益嚴重,且由于人們對抗生素的濫用和誤用,在實際生產中抗生素濫用現象十分普遍,導致細菌耐藥性日益頻發,尤其是“超級細菌”的產生為人們敲響了警鐘。“減抗”“禁抗”已成為當前流行的大趨勢,抗生素替代品的研發迫在眉睫。

多項研究表明,LCA有一定的抑菌活性[29-34],但有關抗菌機制的研究仍不清楚。Haraguchi等[34]的研究表明,不同于其他查爾酮,LCA和甘草查爾酮C(LCC)在其B環中各有一個異戊二烯鏈,能夠為分子滲透到細胞膜中提供足夠的疏水性。此外,LCA和LCC都是細菌NADH氧化酶的有效抑制劑,這些特性為其抗菌作用提供了基礎。

LCA對多種細菌都有不同程度的抑制作用。陳環環[29]、吳玉霞[35]通過棋盤法證實LCA與頭孢噻呋鈉聯合使用對大腸桿菌具有協同抑菌作用,與頭孢噻肟聯合具有協同和相加作用,與氨芐西林、阿莫西林、阿米卡星具有相加作用,得出結論,LCA與β-內酰胺類和氨基糖苷類聯用的抑菌效果較好,與喹諾酮類聯用協同效果不明顯。

LCA通過破壞金黃色葡萄球菌的細胞壁來抑制其生長,劉一寧[36]通過氣道滴注金葡菌建立小鼠的肺損傷模型,發現LCA可以降低感染小鼠肺部的載菌量。吳玉霞[35]通過掃描電鏡觀察LCA作用后對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以及標準菌的形態得出,LCA對MRSA抗菌活性明顯優于標準菌。Qiu 等[37]研究認為,LCA可能通過抑制Agr雙組分系統,從而顯著降低了甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌分泌的SEA和SEB毒素,從而達到抑菌作用。

郭晉祥等[31]研究表明,LCA通過抑制生物被膜的形成從而實現對銅綠假單胞菌的抑制作用,且LCA對小鼠體內銅綠假單胞菌感染有一定的治療作用,減少小鼠皮膚表面膿腫的形成。LCA對腸球菌的抑菌活性也是通過影響生物膜的形成實現的,Liu等[33]研究表明,LCA可以通過調控MarR家族、TetR家族和MerR家族轉錄調控因子,抑制糞腸球菌生物膜的形成,從而發揮抗菌的作用。

本試驗測定了LCA和小檗堿兩種中藥單體與紅霉素等20種抗生素對產氣莢膜梭菌的MIC,并分別進行聯合藥敏試驗。結果發現,大環內酯類和四環素類抗生素與小檗堿和LCA聯合抑菌增效作用明顯,LCA對產氣莢膜梭菌的MIC值為4 μg·mL-1,有良好的抑菌活性,而小檗堿對產氣莢膜梭菌的MIC值為32 μg·mL-1,甘草查爾酮A具有更大的開發潛力。

殺菌曲線顯示,LCA和TMS對產氣莢膜梭菌的生長抑制作用較為顯著,對產氣莢膜梭菌的溶血性也有濃度依賴性的抑制作用,聯合作用處理后效果明顯,推測LCA和TMS可能會影響產氣莢膜梭菌α毒素的產生,細菌的磷脂酶活性被抑制,從而影響其溶血性。

小鼠氣性壞疽的治療試驗結果顯示,CLDM對產氣莢膜梭菌的抑菌作用在體內和體外都有較好的表現,但體內試驗顯示其與LCA協同作用后效果未見顯著提升,TCN和TMS與LCA協同作用表現較好。CLDM作為一種被廣泛應用于厭氧菌感染的抗生素類藥物[38],對產氣莢膜梭菌的抑制效果極為顯著,雖然本試驗中未與LCA表現出顯著的協同作用,但其單獨作用時的效果也值得關注。目前四環素類抗生素耐藥廣泛[39-40],出現了越來越多的耐藥菌株,且TCN的毒性較強,殘留引起極大危害[41],因此TMS的應用前景更加廣泛,治療產氣莢膜梭菌感染在臨床生產上的開發潛力更大,是一種值得關注的研究新方向,有待進一步發掘。

4 結 論

在治療產氣莢膜梭菌感染時,替米考星與甘草查爾酮A聯合作用,可以降低藥物使用量并提高治療效果。