脂肪間充質干細胞對小型豬肝缺血再灌注合并肝切除組織細胞焦亡的影響

馬亞軍,焦智慧,劉笑凝,陸翔羽,劉 濤,王 月,樸晨曦,王洪斌*

(1.東北農業大學動物醫學學院,哈爾濱 150030; 2.黑龍江省普通高等學校動物普通疾病防治重點實驗室,哈爾濱 150030)

肝IRI是一種病理生理應激狀態,指的是肝的血液供應被中斷,一定時間后重新恢復血供應所引起的損傷。肝IRI發生后,低氧誘導中性粒細胞和巨噬細胞被激活并在肝中積聚,這些細胞通過旁分泌和自分泌方式分泌活性氧(reactive oxygen species, ROS)和炎性細胞因子來加劇肝IRI[1]。細胞焦亡是一種炎性相關的細胞死亡[2],與其他形式的細胞死亡不同,它是一種由NLRP3炎癥小體和caspase-1介導的溶解型細胞死亡。其特征在于質膜被GSDMD透化,導致隨后釋放細胞內容物[3-4]。研究發現,NLRP3炎癥小體作為炎癥的關鍵介質,被組織損傷時細胞內外產生的“危險”信號激活,從而快速啟動免疫反應[5]。肝IRI期間,肝細胞、肝竇內皮細胞以及免疫細胞等受到損傷并釋放大量的損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)[6-7]。近幾年,NLRP3炎癥小體已成為抗炎治療的新靶點,通過抑制NLRP3炎癥小體的激活和下調細胞焦亡能夠有效降低炎癥反應,改善損傷[8]。已有研究表明NLRP3炎癥小體的激活與肝IRI有著密切聯系[9]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種可以自我更新的祖細胞,可在特定條件下分化成各種細胞類型。MSCs來自不同來源的成體干細胞,包括骨髓、脂肪組織、臍帶、外周血,甚至腫瘤[10]。盡管存在許多MSCs來源,但可以被采取的組織量是有限的,且每次分離培養收獲的細胞量也相對較少。相比于其他MSCs,ADSCs可以通過非常微小的侵入性程序(例如吸脂術)重復獲得,此獲取途徑具有低發病率和高產量的MSCs[11]。此外,ADSCs具有比骨髓間充質干細胞更強的細胞分裂能力且同樣具有很好的再生能力,可以分化成多種細胞,包括肝細胞,因此ADSCs在細胞治療和組織工程中具有更大潛力[10,12]。除此之外,ADSCs在抗炎和免疫調節方面也具有調節作用,目前已被發現在多種疾病治療中擁有很好的發展前景,尤其是免疫性疾病[13]。近些年,許多研究者用ADSCs對IRI的治療作用進行了大量研究,這里也包括很多ADSCs對肝IRI修復的研究[14-16]。為探究ADSCs對肝IRI損傷的修復機制,作者建立了小型豬肝IRI合并肝切除模型,研究ADSCs對細胞焦亡的調節作用,為ADSCs應用到臨床提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

廣西巴馬小型豬:4～6月齡,重20～25 kg。所有動物均在相同且適宜的環境下飼養,試驗前均經過臨床和實驗室健康檢測。

1.2 試驗儀器與試劑

氣腹機、腹腔鏡器械、腹腔鏡(日本Olympus公司)、冷光源、高清內窺鏡攝像系統(深圳市神州醫療設備有限公司)、實時熒光定量PCR儀(上海羅氏制藥有限公司)、二氧化碳培養箱(德國Eppendorf公司)。

注射用丙泊酚(西安力邦制藥有限公司)、異氟烷(河北一品制藥有限公司)、胎牛血清(美國CLARK公司)、1%青鏈霉素,1%谷氨酰胺(Solarbio, China)、L-DMEM培養基(美國Invitrogen生命技術有限公司)、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)、RNA抽提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)、β-actin抗體(Cell Signaling Technology),IL-1β抗體(ABmart),IL-18、Caspase1、NLRP3抗體(萬類生物),ASC、p-NF-κBp65抗體(Santa Cruz Biotechnology),GSDMD抗體(Affinity Biosciences),NF-κBp65抗體(Proteintech)。

1.3 ADSCs分離與培養

采集小型豬腹股溝處脂肪塊,經PBS清洗,剔除血管、筋膜組織,剪碎,然后經0.01%Ⅰ型膠原酶消化、終止、過濾、離心。最終將細胞沉淀重懸于配有10% FBS,1%青鏈霉素,1%谷氨酰胺的L-DMEM培養液中置于37 ℃、5%CO2的培養箱中進行培養。ADSCs培養至第4代時進行流式鑒定以及誘導分化鑒定。小型豬ADSCs流式鑒定結果顯示,CD29、CD90和CD44陽性表達(>95%),CD34陰性(<2%),符合國際細胞治療學會的定義。標準培養條件下的體外分化培養,ADSCs能夠分別分化為成骨細胞、脂肪細胞和肝細胞[17]。

1.4 手術流程

健康巴馬小型豬18頭被隨機分為Sham組、IRI組和ADSCs組,每組6頭豬。如前所述,應用腹腔鏡技術建立手術模型,進行左半肝切除,右半肝缺血60 min[18]。Sham組只建立氣腹,翻動肝葉;IRI組與ADSCs組進行上述手術操作,其中,IRI組和ADSCs組分別在術后即刻通過肝實質注射生理鹽水和ADSCs(1×106·kg-1)。于術后1、3、7 d應用腹腔鏡技術進行肝組織樣本采集。

1.5 血清樣本分析

按照使用的試劑盒說明書對血清中的IL-1β和IL-18進行含量檢測。

1.6 Real-time PCR

根據制造商說明書提取肝總RNA。然后反轉錄為cDNA。用SYBR Green 三步法實時熒光定量RT-qPCR檢測基因IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、capase1、GSDMD、NF-κBp65以及內參β-actin的表達量。反應程序:95 ℃預變性15 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環,最后進行熔解反應。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequences

1.7 Western blot

向肝組織樣品中加入蛋白裂解液,使用組織勻漿機進行研磨,并在4 ℃下裂解30 min,最后經離心(12 000 r·min-1,4 ℃,5 min)獲得含有組織總蛋白的上清液。應用BCA法測定蛋白濃度。使用Buffer(5×)進行蛋白樣本處理。通過電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光檢測樣本相應目的蛋白相對表達量。經檢測的目的蛋白包括:IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、capase1、GSDMD、NF-κBp65、p-NF-κB以及內參β-actin,使用圖像處理應用程序ImageJ對目的條帶進行分析。

1.8 統計分析

使用GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, USA)對所有數據進行分析。所有數值均表示為“平均值±SD(標準偏差)”。各組之間的比較通過ANOVA(單向方差分析)進行評估。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 ADSCs對肝IRI合并肝切除誘導的促炎因子分泌的影響

如圖1所示,術后1 d時,IRI組與sham組相比,血清中IL-18、IL-1β含量顯著增加(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs組與sham組相比,血清中IL-18、IL-1β含量顯著性增加(P<0.05或P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01或P<0.05);ADSCs組與IRI組相比,血清中的IL-18、IL-1β含量顯著性減少(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性降低(P<0.05或P<0.01)。術后3 d時,IRI組與sham組相比,血清中IL-18、IL-1β含量顯著性增加(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs組與sham組相比,血清中IL-1β含量顯著性增加(P<0.05),肝組織中IL-1β基因和IL-18蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs與IRI組相比,血清中的IL-18、IL-1β含量顯著性減少(P<0.01),肝組織中IL-18、IL-1β基因和蛋白表達水平顯著性降低(P<0.01)。術后7 d時,各組血清和肝組織IL-18、IL-1β表達量無顯著差異(P>0.05)。以上結果表明,肝IRI合并肝切除損傷能夠促進促炎因子IL-18、IL-1β分泌,而ADSCs的干預可有效抑制促炎因子的表達。相關機制研究發現,細胞焦亡可促進炎性因子IL-18、IL-1β的成熟與釋放,因此本次研究進一步探究了ADSCs對肝IRI合并肝切除引起的組織細胞焦亡的影響。

2.2 ADSCs對肝IRI合并肝切除誘導的細胞焦亡的影響

如圖2所示,術后1 d時,IRI組與sham組相比,細胞焦亡相關因子NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01);ADSCs組與sham組相比,基因NLRP3、ASC和Caspase-1轉錄水平顯著性升高(P<0.05),GSDMD無顯著性差異(P>0.05),蛋白ASC和Caspase-1呈顯著性升高(P<0.01),NLRP3和GSDMD無顯著變化(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因與NLRP3、ASC蛋白表達量顯著性降低(P<0.01),GSDMD蛋白表達顯著(P<0.05)降低。術后3 d時,IRI組與sham組相比,細胞焦亡相關因子NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因和蛋白表達水平顯著性升高(P<0.01或P<0.05);ADSCs組與sham組相比,基因ASC、Caspase-1和GSDMD轉錄水平均顯著性升高(P<0.05),NLRP3無顯著變化(P>0.05),蛋白NLRP3、ASC和Caspase-1表達水平均顯著性升高(P<0.01或P<0.05),GSDMD無顯著變化(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,NLRP3、ASC、Caspase-1和GSDMD基因和蛋白表達量均顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。術后7 d時,IRI組與sham組相比,細胞焦亡相關基因Caspase-1和GSDMD轉錄水平仍呈顯著性升高(P<0.01或P<0.05),細胞焦亡相關蛋白ASC和Caspase-1表達呈顯著性升高(P<0.01),其他因子均無顯著差異(P>0.05);ADSCs組與sham組無顯著差異(P>0.05)。ADSCs組與IRI組相比,基因GSDMD、蛋白ASC、Caspase-1顯著降低(P<0.05或P<0.01),基因NLRP3、ASC和蛋白NLRP3、GSDMD均無顯著差異(P>0.05)。以上結果表明,肝IRI合并肝切除激活了NLRP3炎癥小體,進一步促進GSDMD的切割,ADSCs可抑制NLRP3炎癥小體的激活,減少GSDMD的切割,降低NLRP3、ASC、caspase1和GSDMD的表達,抑制肝組織細胞焦亡的發生。

A、B. 促炎因子血清學檢測結果;C、D. 促炎因子在肝組織中的基因檢測結果;E、F. 促炎因子在肝組織中的蛋白檢測結果。與sham組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;ADSCs與IRI組相比,*.P<0.05,**.P<0.01 A, B. Serological test results of pro-inflammatory factors; C, D. Genetic testing results of proinflammatory factors in liver tissue; E, F. Protein detection results of pro-inflammatory factors in liver tissue. Compared with the sham group, #.P<0.05, ##.P<0.01; ADSCs compared with the IRI group, *.P<0.05,**.P<0.01圖1 促炎因子分泌水平Fig.1 Pro-inflammatory factor secretion level

2.3 ADSCs對肝IRI合并肝切除中的炎癥調節因子NF-κB的影響

如圖3所示,術后1 d時,IRI組與sham組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性升高(P<0.01);ADSCs與sham組相比,NF-κBp65基因呈顯著性升高(P<0.05),p-NF-κBp65/NF-κBp65無顯著性差異(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。術后3 d時,IRI組與sham組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性升高(P<0.01);ADSCs與sham組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65無顯著性差異(P>0.05);ADSCs組與IRI組相比,基因NF-κBp65和蛋白p-NF-κBp65/NF-κBp65呈顯著性降低(P<0.01)。術后7 d時,各組之間無顯著性差異。NF-κB作為調節炎癥反應的主要因子,與NLRP3炎癥小體的激活密切相關。以上結果表明,肝IRI合并肝切除后,NF-κBp65相關基因與蛋白明顯增加,ADSCs干預后明顯抑制了NF-κBp65的表達。結合細胞焦亡相關檢測結果發現,ADSCs對于肝IRI合并肝切除引起的肝組織細胞焦亡的抑制作用可能與NF-κBp65信號通路相關。

(圖2續 Continued)

A. NF-κB相關蛋白圖;B. p-NF-κB/NF-κB在肝組織中的蛋白表達結果;C. NF-κB在肝組織中的基因表達結果。與sham組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;ADSCs與IRI組相比,*.P<0.05,**.P<0.01 A. NF- κ B-related protein map; B. The protein expression results of P-NF-κB/NF-κB in liver tissue; C. The gene expression results of NF- κ B in liver tissue. Compared with the sham group, #.P<0.05, ##.P<0.01; ADSCs compared with the IRI group, *.P<0.05,**.P<0.01圖3 NF-κBp65基因與蛋白表達水平Fig.3 NF- κBp65 gene and protein expression levels

3 討 論

肝IRI是肝切除和肝移植手術不可避免的并發癥,對于術后肝功能障礙具有不利影響。目前,肝IRI的損傷機制涉及多個方面,包括微循環功能障礙、缺氧、氧化應激、炎癥等[19]。肝內存有多種免疫細胞,肝損傷通常伴有強烈的炎癥反應,這是導致肝細胞大量死亡及肝損傷嚴重的重要因素[20]。作者之前的研究發現,小型豬肝IRI合并肝切除術能夠引發嚴重炎癥反應,進一步造成肝損傷[21]。細胞焦亡是一種炎癥性程序性細胞死亡模式,參與IRI的發生與發展[22-24]。焦亡發生時,NLRP3作為一種細胞內的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)能夠直接或通過ASC募集 caspase-1前體,從而形成蛋白復合體,即炎性體[25]。當受到刺激時,這些炎性體誘導caspase-1活化,活化后的caspase-1能夠促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放。此外,激活的caspase-1導致GSDMD蛋白裂解并釋放其N端結構域,后者聚合并在質膜上形成孔,進而引發細胞炎性死亡。本研究發現,小型豬肝IRI合并肝切除后,NLRP3炎癥小體被激活,caspase-1活化,GSDMD表達量增加,炎性細胞因子IL-1β、IL-18大量釋放。

MSCs是一種具有再生潛力與免疫調節特性的基質細胞,作為一種特殊的免疫調節物被廣泛應用于多種炎癥相關疾病的治療研究[26-29]。在肝IRI小鼠模型中發現,細胞焦亡在肝損傷修復中起著至關重要的作用[30]。Li等[31]發現,肝巨噬細胞的焦亡是肝IRI損傷炎癥調節的重要機制。MSCs能夠表達多種趨化因子和黏附蛋白來募集免疫細胞并通過直接細胞接觸調節免疫,抑制炎癥反應[32]。MSCs還能夠分泌多種免疫調節因子,包括轉化生長因子(transforming growth factor beta,TGF-β)、肝再生增強因子(hepatocyte growth factor, HGF)、白介素10(interleukin-10, IL-10)、白介素1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)等[33]。對此,一項小鼠心肌梗塞模型的研究證明,MSCs通過旁分泌作用抑制血管內皮細胞焦亡,降低心肌梗塞引起的炎癥反應[34]。作者以前的研究發現,ADSCs能夠減輕肝IRI合并肝切除導致的炎癥反應,促進肝再生[35]。為進一步探究ADSCs對小型豬肝IRI合并肝切除引起的細胞焦亡的影響,作者在術后對細胞焦亡相關基因和蛋白進行了檢測。結果發現,ADSCs的干預后NLRP3炎癥體被抑制,炎性細胞因子(IL-1β、IL-18)釋放量顯著減少。

NF-κB形成一系列轉錄因子,在多種生理和病理過程中起重要作用。NF-κB家族有5個成員,p65(RelA)、RelB、c-Rel、p105/p50和p100/p52,所有這些都共享一個共同的氨基末端REL同源結構域RHD[36]。核因子NF-κB作為一種炎癥和免疫穩態的主要調節因子,一直被認為是新型抗炎藥物的重要靶點[37]。NF-κB 活化增加NLRP3炎性小體相關蛋白編碼基因的轉錄[38],從而激活casapse-1并分離GSDMD的N端和C端以誘導焦亡[39]。因此,作者假設肝IRI誘導NLRP3炎癥小體活化與細胞焦亡受NF-κB信號通路調節。針對這一假設,作者對NF-κBp65相關蛋白與基因進行檢測發現,與細胞焦亡結果基本一致,肝IRI損傷發生后,NF-κBp65的表達水平顯著升高,而ADSCs干預后,其表達被明顯抑制。上述結果表明,ADSCs可能通過NF-κB通路降低小型豬肝IRI合并肝切除誘導的細胞焦亡。

4 結 論

小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝切除術激活了NLRP3炎性體,誘導細胞焦亡發生,而ADSCs的干預能夠有效降低細胞焦亡損傷,減少焦亡相關炎性因子的釋放,且修復機制可能與炎癥重要調節因子NF-κB的抑制有關。