溫度和孵化方式對大鰭鳠受精卵孵化效果的影響

李曉莉，朱永久，吳興兵，楊德國，李學梅，朱挺兵

(中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

大鰭鳠(Mystusmacropterus)屬硬骨魚綱(Osteichthyes)鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagrdae)鳠屬(Mystus)，俗稱石扁頭、石胡子、江鼠等，自然分布于長江和珠江各水系的干流及其支流中，也是鲿科鳠屬中一種生長較快、個體較大的經濟魚類，其蛋白質、脂肪、必需氨基酸、鮮味氨基酸含量高，具有較高的食用價值[1]。大鰭鳠曾在長江上游江段漁獲物中占有一定比例，產量較大，近年來，由于水利工程的修建、水體污染、過度捕撈等生存壓力，大鰭鳠野生資源量迅速下降，捕撈個體呈現出小型化、低齡化等資源衰退現象[2]。上世紀90年代開始，相關單位陸續開展了對大鰭鳠的繁殖生物學、人工繁殖技術的研究，取得了人工繁殖技術的階段性突破[3-4]，但在人工繁殖過程中，尚存在早期生物學研究基礎薄弱、受精卵孵化效果不穩定等問題[5]，制約了大鰭鳠苗種規模化培育，限制了該品種的產業化發展。因此，有效提高受精率和孵化率已成為大鰭鳠人工繁育過程中重要研究內容。

魚卵受精后，進入胚胎發育階段，由于行為反應能力有限、對環境應激耐受機制發育不完善等因素，對環境因子變化的感知最為敏感[6-7]。溫度是影響魚類早期生長發育的重要環境因素，在胚胎孵化和代謝調控中起著關鍵的生理作用，也是影響胚胎成活、影響受精率和孵化率的決定性因素之一[8-9]。近年來，關于水溫對早期受精卵發育影響的研究在越來越多的魚類中得到證實[10]，但溫度對大鰭鳠受精卵孵化的影響尚無系統研究。

魚卵產出后黏性程度因種類的不同有較大差異，按黏性程度分為黏性卵、弱黏性卵和非黏性卵3類[11]。相較于非黏性卵，粘性卵由于自身的黏性特質，如卵膜表層結構遇水反應導致黏性卵在短時間內失去受精能力，受精卵黏連結塊致使內部氣體交換困難等[12]，進而導致在人工授精和孵化過程中更加困難，產黏性卵的經濟魚類人工授精及孵化方法是生產過程中延續至今的研究課題[13-14]。大鰭鳠受精卵為弱粘性[15]，目前生產上主要采用掛網孵化法，但由于水質管理困難，受精卵易滋生水霉，導致孵化效果不穩定，因此探索大鰭鳠受精卵適宜的孵化方式是大鰭鳠人工繁育過程中重要研究內容。

為此，本實驗采用單因子設計實驗開展了不同溫度(22、24、26、28和30 ℃)和不同孵化方式[脫黏孵化(蛋白酶脫黏、滑石粉脫黏)、掛網孵化、孵化框孵化]對大鰭鳠受精卵孵化的影響進行研究，旨在篩選出適宜的大鰭鳠孵化溫度和孵化方式，為大鰭鳠規模化高效制種提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 孵化條件

實驗于2022年6月在中國水產科學研究院長江水產研究所特有魚類繁育基地內進行，孵化用水為工廠化循環水，養殖水體pH為8.4±0.1，溶解氧為(7.5±0.3)mg/L，日換水率為50%，除溫度組實驗外，水溫穩定在(27±1)℃。

1.2 人工受精

1.2.1 親魚的選擇

實驗用大鰭鳠親魚來自中國水產科學研究院長江水產研究所特有魚類繁育基地，親魚均為4齡以上、體質健壯、無傷無病，性腺發育情況良好。雄魚規格為(409.16±87.09)g，雌魚規格為(310.51±100.63)g。

1.2.2 卵子采集

親魚捕撈后雌雄分開暫養。在人工受精前采用二次注射法用催產劑(HCG、LHRH-A和DOM混合藥物)對雌魚進行腹腔注射誘導催熟產卵，及時檢查卵子成熟情況，用手觸摸雌魚腹部有卵粒流動，輕擠雌魚腹部有少量卵粒流出時，便開始進行人工授精。將卵子擠入事先準備好的干凈且干燥的盆中并稱重，避免魚卵與水接觸。為減少卵發育程度差異對受精率統計的影響，參照CHATAKONDING等[16]的方法進行評估，卵液pH>7.4即可以判斷卵子質量合格。

1.2.3 精液采集

受精前12 h對雄魚進行催熟，催熟藥物及劑量同雌魚一致。雄魚精液收集采用殺魚取精的方法。取出精巢后用濾紙吸干精巢表面組織液和血液，稱重，在干凈的小燒杯中剪碎，用紗布過濾。為減少個體精子質量差異對受精率的影響，實驗采用多尾雄魚的精子混合樣本。將采集的精液按照1∶10加入精子稀釋液[22]，混合均勻放置于碎冰上保存備用。

1.2.4 人工授精

實驗過程采用半干法授精：將混合魚卵稱重后，每200 g卵子加入10 mL稀釋后的精液，用干燥羽毛輕輕攪拌10 s，然后加入激活液[17]再攪拌2 min使卵受精。倒出多余的激活液和卵巢液后再用清水沖洗受精卵1～2遍，完成受精。

1.3 孵化方法

1.3.1 不同溫度對大鰭鳠孵化及仔魚成活的影響

條件設置：實驗設置5個溫度組，分別是22、24、26、28和30 ℃，每個溫度組設3個平行。實驗在5個獨立控溫的室內循環水養殖系統中進行，系統由養殖桶、溫度調控器、冷凝機、電加熱板等控溫裝置(控溫誤差±0.5 ℃)及水處理裝置構成。養殖桶直徑為100 cm，高度為80 cm，每個養殖桶內放置3個直徑為20 cm鏤空帶濾網的圓形盛卵框，養殖桶一側有沖水裝置持續充水，防止卵粘連成塊滋生水霉，養殖系統水流量為6.7 L/min，每日監測溫度、溶解氧[(7.5±0.3)mg/L]、pH(8.4±0.1)、氨[(0.060±0.025)mg/L]和亞硝酸鹽[(0.032±0.008)mg/L]水平。光周期為12∶12，白天光照度約為1 000 lx。

孵化方法：將受精卵倒入盛卵框中，每框放100顆卵開始孵化。受精卵孵化至原腸晚期時，通過顏色發白、不透明的特征肉眼辨認未受精的卵，并及時剔除，避免受精卵被真菌和細菌感染。統計24 h、48 h好卵率，魚苗出膜后計數出膜仔魚數，出膜后24 h、96 h計算成活率。

計算公式如下：

好卵率=(好卵數/初始卵總數)×100%

出膜率=(出膜仔魚數/初始卵總數)×100%

成活率=(出膜仔魚數/初始活苗總數)×100%

孵化時間：50%受精卵孵化出膜時所用的時間。

1.3.2 不同孵化方式對大鰭鳠受精卵孵化的影響

實驗設掛網孵化、孵化框孵化、蛋白酶脫黏孵化、滑石粉脫黏孵化四組孵化方法，每組設3個平行。

掛網孵化法：實驗在直徑300 cm、高110 cm，水深100 cm的孵化桶中進行。掛網用聚乙烯網片為30目，規格為60 cm×40 cm。將300顆受精卵均勻撒在網片上，晾干10 min，待受精卵充分粘貼在網片上后，掛入孵化桶中流水孵化。

孵化框孵化法：實驗在直徑300 cm的孵化池進行，將底部有濾網的孵化框放入孵化池內，在孵化框上下同時以不同的角度注水，使孵化框中的受精卵定時均勻翻動，不形成死角，定時剔除浮于水體表層的壞卵。將300顆受精卵直接倒入孵化框內，定時剔除浮于水體表層的壞卵。

滑石粉脫黏孵化：滑石粉脫黏孵化與蛋白酶脫黏孵化均在直徑60 cm，高80 cm，錐底高50 cm的孵化桶中進行，水流從下部流入，流量為2.63 L/s，將魚卵沖散，不致粘連。稱取200 g滑石粉倒入10 L孵化用水中，充分攪拌均勻，按照100 mL脫黏劑∶100 g受精卵的比例將脫黏劑倒入300顆受精卵中，輕輕攪拌30 s，重復3次后倒出多余液體，再用清水沖洗2次后將受精卵倒入孵化桶中孵化。

蛋白酶脫黏孵化：稱取30 g堿性蛋白酶(活性200 U/g)倒入10 L孵化用水中，充分攪拌均勻后備用，大鰭鳠卵子受精后按照100 mL脫黏劑 ∶100 g受精卵的比例倒入300顆受精卵中，輕輕攪拌2 min倒出多余液體，后用清水沖洗2次，將受精卵倒入孵化桶中孵化。為進一步比較不同蛋白酶濃度的脫黏孵化效果，開展了3、1.5和0.75 g/L三個不同濃度的比較實驗，方法同上。

各組實驗均重復3次，各實驗組統計好卵率、出膜率指標，計算公式同1.3.1。

1.4 數據統計分析

實驗數據用“平均數±標準差(X±SD)”表示。使用Excel 2019和SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析，用方差分析(ANOVA)檢驗顯著性差異。

2 結果

2.1 不同溫度對大鰭鳠受精卵孵化及仔魚成活的影響

從圖1中可以看出，22～30 ℃時，24 h好卵率隨著溫度的上升呈線性下降趨勢，變化范圍為31.44%～64.63%，線性方程為y=-4.154 8x+158.11(R2=0.837 7)。其中低溫組(22 ℃)、中溫組(24、26 ℃)和高溫組(28、30 ℃)之間有顯著性差異。48 h好卵率隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢，22 ℃最低，僅為1.76%，28 ℃最高，為27%，各個溫度組之間差異顯著。采用曲線回歸分析溫度與48 h好卵率的關系，其中二項式函數擬合效果最好，其方程為：y=-1.404 9x2+75.155x-974.03(R2=0.799 5)，擬合得到溫度為26.8 ℃時48 h好卵率最大。

圖1 溫度對大鰭鳠好卵率的影響(Ⅰ)及溫度與好卵率的關系(Ⅱ)Fig.1 Effect of temperature on the good egg rate (Ⅰ)and the relationship between temperature and good egg rate (Ⅱ)of M.macropterus

從圖2中看出，溫度對大鰭鳠仔魚出膜率影響顯著：出膜率隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。22 ℃時大鰭鳠仔魚出膜率為0，其他溫度組表現為30 ℃組(11.89%)<24 ℃組(17.95%)<26 ℃組(25.33%)<28 ℃組(30.57%)，24 ℃和30 ℃組顯著低于26 ℃和28 ℃組。利用二次方程對大鰭鳠出膜率進行擬合分析，得到擬合方程為：y=-1.354 2x2+72.217x-933.77(R2=0.792 5)，通過求導推算極值的方法，得出大鰭鳠受精卵的最適發育溫度為26.8 ℃。此外，實驗結果還表現為仔魚出膜時間隨溫度的上升而逐漸縮短，30 ℃組出膜時間最短(46 h)；其次為28 ℃組(58 h)，再次為26 ℃組(79 h)，24 ℃組出膜時間最長(88 h)。

圖2 溫度對大鰭鳠出膜率的影響(Ⅰ)及溫度與出膜率的關系(Ⅱ)Fig.2 Effect of temperature on the hatching rate (Ⅰ)and the relationship between temperature and hatching rate (Ⅱ)of M.macropterus

大鰭鳠仔魚出膜后的24 h成活率如圖3所示，24 ℃組(54.76%)顯著低于26 ℃組(95.45%)、28 ℃組(91.67%)和30 ℃組(92.59%)，后三者則差異不顯著。24 h后，24～28 ℃條件下，仔魚成活率較穩定，96 h與24 h成活率差異不顯著，分別為52.38%、90.91%和92.59%，而30 ℃組則顯著降低，為40.74%。

圖3 溫度對大鰭鳠仔魚成活率的影響Fig.3 Effect of temperature on the survival rate of M.macropterus larva

2.2 不同孵化方式對大鰭鳠受精卵孵化的影響

4種孵化方式進行對比實驗，結果如圖4所示。從圖中可以看出，掛網組大鰭鳠24 h好卵率最高(48.11%)，其次是孵化框組(45.05%)，再次是蛋白酶脫黏(19.98%)，滑石粉脫黏孵化組最低(15.32%)，前二個實驗組與后二個實驗組之間差異顯著。出膜率結果表現為，掛網組(16.07%)>蛋白酶脫黏組(12.08%)>孵化框組(9.61)%>滑石粉脫黏組(9.26%)。為探究卵膜對孵化過程的影響，實驗分析了出膜率/24h好卵率，結果顯示，脫黏組的比值最大，均為60.46%，顯著高于掛網組(33.40%)和孵化框組(21.32%)，說明卵膜的存在對出膜率影響顯著。

圖4 孵化方式對大鰭鳠受精卵孵化的影響(Ⅰ、Ⅱ)Fig.4 Effects of hatching methods on hatching of M.macropterus embryos(Ⅰ、Ⅱ)

2.3 蛋白酶濃度對大鰭鳠受精卵孵化的影響

在實驗設置的3個蛋白酶濃度梯度下，大鰭鳠孵化效率如圖5所示，24 h和48 h好卵率均表現為0.75 g/L組(25.03%、16.80%)顯著高于3 g/L組(19.98%、15.42%)和1.5 g/L組(18.16%、12.03%)，后兩者之間差異不顯著，說明脫黏強度對胚胎發育有顯著影響。出膜率則表現為隨濃度降低而顯著降低的趨勢，分別為12.08%(3 g/L組)、7.90%(1.5 g/L組)和2.87%(0.75 g/L組)，出膜率/24h好卵率的比值表現為3 g/L組(60.46%)>1.5 g/L組(43.50%)>0.75 g/L組(11.47%)，三者之間差異顯著，說明卵膜的存在對出膜過程造成了影響，導致出膜率降低。

圖5 蛋白酶濃度對大鰭鳠受精卵孵化的影響Fig.5 Effect of protease concentration on hatching of M.macropterus embryos

3 討論

在魚類胚胎發育過程中，溫度通過調控孵化酶的作用影響魚類胚胎孵化，溫度過高會抑制孵化酶活性或使得卵裂及器官分化過程出現紊亂[18]，從而導致胚胎孵化率下降和畸形率升高，低溫同樣會抑制胚胎內孵化酶的活力，降低胚胎細胞代謝和分裂速度，進而減緩或阻止發育進程[19]，只有在適宜的溫度范圍內孵化酶擁有最大活性[20]。在本研究設置的溫度范圍內，48 h好卵率、出膜率及成活率隨著溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，溫度低于22 ℃大鰭鳠無法出膜，溫度過高則出膜率降低，畸形率升高。與馬本賀等[18]、李文豪等[19]的研究結果一致。二項式擬合得到大鰭鳠最適孵化溫度為26.8 ℃，這與烏蘇里擬鲿(Pseudobagrasussuriensis)(26 ℃)[21]、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)(24～27 ℃)[22]、斑鳠(Mystusguttatus)(26～28 ℃)[23]等鲇形目鲿科魚類的孵化溫度基本一致。實驗中26 ℃和28 ℃組大鰭鳠出膜后仔魚的成活率顯著高于其他溫度組，進一步證明了大鰭鳠適宜的胚胎發育溫度為26～28 ℃。有資料報道大鰭鳠在水溫為22～30 ℃的天然河流均能自然繁殖[24]，本實驗中22 ℃條件下大鰭鳠無法出膜，這一方面可能與胚胎不同發育階段對溫度的敏感程度不同有關，于歡歡等[25]研究發現原腸中期可能是石斑魚雜交子代胚胎發育過程中一個受溫度影響的重要敏感期。本實驗在恒溫條件下進行，使22 ℃組大鰭鳠胚胎發育在溫度敏感發育期終止，自然繁殖是在變溫環境中發生，溫度并非一直保持在22 ℃，胚胎發育敏感期可能被避開了；另一方面野外環境中胚胎發育受多個生態因子的共同作用[26]，導致與本實驗結果有差異。本研究中，隨著溫度的升高，大鰭鳠孵化時長從88 h縮短到46 h，這和馬躍崗等[4]的報道基本一致，這是由于在適當的溫度范圍內，溫度提高可以提高孵化酶活性，加快胚胎發育速度，從而縮短孵化時間[20]，故在不影響孵化率的情況下，可適當提高孵化溫度，縮短孵化時間，以降低遭受霉菌感染或其他生物侵襲的風險，進一步提高孵化率。

目前黏性卵孵化主要有脫黏孵化法和人工魚巢接卵孵化法[12]，本研究中掛網組(接卵孵化)和水流孵化框組(不脫黏孵化)24 h好卵率顯著高于脫黏組，這與卵膜的保護作用有關，卵膜可作為受精卵內部與外部環境污染物間隔離的屏障，可以保護魚卵免受環境變化(如干燥、機械力)影響造成的器質性損傷以及水流、捕食者和病原體(如細菌和真菌)感染，并且可以促進發育中胚胎氣體交換[27-29]。在脫黏過程中，不可避免地會對卵膜造成損傷，影響卵膜的保護作用，進一步影響脫黏組的好卵率。有研究表明，魚類的孵化受孵化酶、胚體運動等因素的影響，魚類受精后形成的卵殼會在胚胎發育的晚期阻礙胚體的出膜[30]，本研究中不同實驗組大鰭鳠仔魚出膜率表現為掛網組>蛋白酶組>孵化框組>滑石粉組，表明四個實驗組之間的差異相比24 h好卵率的差異顯著縮小，另外，從不同孵化方式出膜率/24 h好卵率來看，脫黏孵化的比值顯著高于掛網組和孵化框組，同時，不同蛋白酶濃度實驗結果也表現為出膜率隨濃度降低而顯著降低的趨勢，以上實驗結果均表明卵膜的存在對出膜過程造成了影響，導致出膜率降低。這與上述報道一致。

本實驗結果顯示掛網孵化組出膜率較高，但掛網法易遭受水霉感染，本研究在2022年度的催產過程中，掛網孵化5批次，有3批次因為受精卵滋生水霉而孵化失敗，綜合考慮采取蛋白酶脫黏孵化的方法較好。因此，在后續的大鰭鳠孵化研究中將重點考慮脫黏孵化方式，同時，脫黏使用劑量和處理時間對其孵化成功至關重要，做到既不傷害受精卵，又要能夠減少卵膜對仔魚出膜的影響。另外，需要加強大鰭鳠受精卵表面黏性成分的研究，以便于有針對性地使用蛋白酶分解的方法，對魚卵進行高效的脫黏處理，提高大鰭鳠胚胎孵化效率。