河川沙塘鱧病原殺鮭氣單胞菌致病性及感染后宿主免疫相關基因差異表達分析

李 杰，劉國興，2，錢且奇，朱玉潔，陳 圳，姜 群，王 駿，張曉君，高曉建

(1.揚州大學動物科學與技術學院 ，江蘇揚州 225009；2.江蘇省淡水水產研究所，南京 210017)

河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)屬于鱸形目(Perciformes)鰕鯱魚亞目沙塘鱧科(Odontobutidae)沙塘鱧屬(Odontobutis)，常見于我國長江中下游、錢塘江、閩江等[1-2]，該品種味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者的歡迎，已成為我國水產業(yè)極具發(fā)展?jié)摿Φ奶厣B(yǎng)殖品種。自2009年河川沙塘鱧開始規(guī)模化繁育以來，其人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，已在多個省市的養(yǎng)殖區(qū)開展了混養(yǎng)和套養(yǎng)[3]。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大以及水環(huán)境的惡化，河川沙塘鱧病害問題也逐漸嚴重，制約著其產業(yè)的健康發(fā)展。目前已報道的河川沙塘鱧病原有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[4]、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)[5]、溶血性蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[6]、兩性綿霉(Achlyabisexualis)[7]等。

2021年3月江蘇常熟市某養(yǎng)殖場河川沙塘鱧出現大規(guī)模死亡現象，發(fā)病水溫為12～15 ℃，其主要癥狀為體表不同程度的潰瘍，并且鰭條充血、出血。本研究從瀕死的河川沙塘鱧分離到優(yōu)勢生長細菌，命名為G2-4-1，經理化特性和分子特征確定其為殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)。通過對分離菌人工感染健康的河川沙塘鱧和組織病理分析以確定其致病性，并對其進行了致病菌毒力因子檢測、耐藥性檢測以及感染后宿主免疫相關基因表達變化分析，探尋河川沙塘鱧對殺鮭氣單胞菌感染的免疫應答規(guī)律，為進一步研究河川沙塘鱧細菌性疾病防控奠定了前期基礎。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

患病河川沙塘鱧(60±5)g采自江蘇常熟市河川沙塘鱧養(yǎng)殖場，將瀕死的河川沙塘鱧用75%的酒精體表消毒后，無菌條件取肝臟、腎臟及脾臟組織，并劃線接種至普通營養(yǎng)瓊脂平板，20 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單個優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，并將純化后的菌液加入等體積的20%(V/V)甘油，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 人工感染試驗

將分離菌G2-4-1接種于普通營養(yǎng)肉湯中，20 ℃培養(yǎng)36 h制成菌懸液，并用生理鹽水進行梯度稀釋至1.8×108、1.8×107、1.8×106、1.8×105、1.8×104CFU/mL。將健康的河川沙塘鱧[(15±1.5)g]暫養(yǎng)一周后，隨機分為5個感染組和1個對照組，感染組每組15尾魚，分別腹腔注射0.1 mL的不同濃度的菌液，對照組按照同樣方式注射等量無菌生理鹽水。感染試驗期間，水溫18～20 ℃，溶氧5.0 mg/L以上。連續(xù)觀察7 d，記錄河川沙塘鱧發(fā)病與死亡情況，同時將死亡的河川沙塘鱧重新分離細菌并鑒定，半數致死濃度(LD50)計算參考張慶萍等[8]方法進行。

1.3 組織病理觀察

取對照組和G2-4-1菌株感染組河川沙塘鱧的肝臟、鰓、脾臟和腎臟組織于Bouin’s液固定24 h后，用70%酒精保存。將固定的樣品經脫水、透明、打蠟、石蠟包埋后，用切片機切片(3～6 μm)，然后蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂膠密封后于光學顯微鏡觀察拍照。

1.4 分離菌形態(tài)觀察和理化特性測定

取分離菌G2-4-1進行革蘭氏染色，同時將分離菌G2-4-1滴于經聚醋酸甲基乙烯脂膜包被的銅網上并靜置1 min，用0.5%磷鎢酸水溶液負染1 min，最后自然干燥后利用Tecnai 12透射電子顯微鏡進行觀察。另外將分離菌G2-4-1接種于微量生化管測定精氨酸水解酶、賴氨酸脫羧酶、纖維二糖、麥芽糖等理化指標，并對照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[9]對分離菌進行種屬判定。

1.5 gyrB序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析

采用煮沸法提取分離菌的DNA作為模板，對菌株gyrB基因進行擴增。PCR反應條件為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復性 30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR產物由南京擎科生物有限公司進行序列測定。應用NCBI 中BLAST對測得的基因序列進行比對，選擇相關序列，利用 ClustaW進行同源性比對，通過 Mega4 軟件中鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.6 毒力基因檢測

選擇氣單胞菌的氣溶素(aer)、溶血素(hly)、封閉帶毒素(zot)、DNA酶(exu)、絲氨酸蛋白酶(ser)、磷脂酶(lip)、S層蛋白(sp)、熱不穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素(alt)和細胞毒性腸毒素(act)共9個毒力相關基因，采用Primer 5.0軟件設計特異性引物，由南京擎科生物有限公司合成(表1)，進行PCR擴增；PCR反應體系：2 × EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL,引物各0.5 μL,DNA模版1 μL,最后加ddH2O至25 μL，并以ddH2O替代DNA模板作為空白對照；擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸5 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，以擴增片段的有無及大小判斷相應毒力基因的存在情況。

表1 殺鮭氣單胞菌毒力基因引物序列Tab.1 Primer sequences of virulence genes of A.salmonicida

1.7 分離菌G2-4-1胞外酶與溶血素的測定

參考周麗穎等[10]采用平板法測定分離菌G2-4-1的蛋白酶、明膠酶、脂酶、卵磷脂酶、淀粉酶、DNA酶以及溶血素活性。

1.8 耐藥性分析

采用紙片擴散法(K-B)對分離菌G2-4-1進行藥物敏感性測定，將分離菌G2-4-1的濃度調整至1.5 × 108CFU/mL，吸取100 μL菌液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，將藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司產品)貼于平板上，28 ℃中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑(mm)。根據杭州天和微生物試劑有限公司產品說明書：抑菌圈直徑大于等于17(mm)為敏感，抑菌圈直徑大于等于14(mm)小于17(mm)為中介，抑菌圈直徑小于14(mm)為抗性，根據抑菌圈直徑判定分離菌G2-4-1的耐藥性。

1.9 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后免疫相關基因的表達分析

將健康的河川沙塘鱧分為感染組和對照組，每組50尾，實驗組每尾魚腹腔注射100 μL殺鮭氣單胞菌菌液，濃度為1.8×105CFU/mL。對照組按同樣的方式和劑量注射無菌生理鹽水，在注射6、12、24、48和72 h后，分別取實驗組與對照組的鰓、脾臟和腎臟組織，利用Trizol法提取RNA，并將RNA反轉錄為cDNA；qRT-PCR在實時熒光定量PCR儀進行，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒；本實驗以β-actin為內參基因，免疫相關引物信息見表2，并通過解離曲線分析確定引物特異性，每個樣品重復3次，用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，所得數據以平均值±標準差(x±SD)表示，用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，0.01

表2 熒光定量PCR相關引物序列Tab.2 Fluorescence quantitative PCR related primer sequence

2 結果

2.1 患病河川沙塘鱧癥狀及分離菌形態(tài)特征

患病河川沙塘鱧表現為體表嚴重潰瘍，體表嚴重潰爛，泄殖孔紅腫、潰瘍，解剖發(fā)現肝臟嚴重出血。從肝臟分離獲得的優(yōu)勢菌株G2-4-1為革蘭氏陰性短桿菌，在瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形、邊緣整齊、中間凸起、白色不透明、表面濕潤、直徑為1～2 mm；經負染色后，透射電子顯微鏡下觀察菌株G2-4-1呈桿狀，兩端鈍圓，無芽孢，單鞭毛(圖1)，大小多為0.5～1.0 μm。

圖1 自然感染河川沙塘鱧的發(fā)病癥狀及分離菌形態(tài)特征Fig.1 Clinical signs of naturally infected A.salmonicense and colony morphologies of the isolatea.背部潰瘍的河川沙塘鱧(△)，b.泄殖孔紅腫、潰瘍(★)，c.肝臟嚴重出血(□)，d.分離菌G2-4-1革蘭氏染色 e.優(yōu)勢菌株G2-4-1在營養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)，f.分離菌G2-4-1電鏡照片

2.2 分離菌G2-4-1的致病性

分離菌G2-4-1腹腔注射感染健康的河川沙塘鱧數小時后，河川沙塘鱧出現游泳遲緩、體色發(fā)暗等體征，背部出現潰瘍，鰓嚴重受損，泄殖孔腫脹等癥狀(圖2)，并陸續(xù)死亡，其發(fā)病癥狀與自然條件下發(fā)病河川沙塘鱧的癥狀相似，死亡情況見表3；對照組河川沙塘鱧在7 d內均正常。分離菌G2-4-1對河川沙塘鱧的7 d LD50為1.8×106CFU/mL。從人工感染殺鮭氣單胞菌中重新分離菌株進行鑒定，結果均與原感染菌一致。以上結果表明可確定該菌株為患病河川沙塘鱧的病原菌。

圖2 人工感染河川沙塘鱧的發(fā)病癥狀Fig.2 Clinical signs of artificially infected A.salmonicensea.背部潰瘍的河川沙塘鱧(△)，b.背部潰瘍(□)，鰓嚴重受損，c.泄殖孔紅腫、潰瘍(☆)

表3 分離菌G2-4-1人工感染河川沙塘鱧試驗Tab.3 Results of artificial infection of the strain G2-4-1 to healthy O.potamophilus

2.3 組織病理分析

健康對照組和患病感染組河川沙塘鱧的組織切片結果如圖3。對照組肝細胞結構完整，排列緊密，細胞邊界明顯(圖3-a)；感染組肝臟出血嚴重，細胞排列紊亂松散，細胞核染色較深，部分肝臟細胞溶解壞死，細胞核溶解消失(圖3-b)。對照組的鰓絲表面舒展平滑，細胞分布均勻，排列緊密(圖3-c)；感染組的鰓小片呼吸上皮細胞腫脹變性，出現壞死脫落，鰓細胞排列疏松紊亂，出現炎癥細胞浸潤，細胞空泡化(圖3-d)。對照組的脾臟細胞分布均勻、排列緊密，細胞結構完整(圖3-e)；感染組的脾臟細胞排列松散紊亂，部分細胞出現腫脹、空泡、壞死(圖3-f)。對照組的腎臟細胞排列緊密，結構完整，腎間質未見炎性細胞浸潤(圖3-g)；感染組的部分腎小管上皮細胞腫脹、壞死、脫落，細胞排列疏松，腎間組織細胞空泡，出現大片壞死(圖3-h)。

圖3 殺鮭氣單胞菌感染河川沙塘鱧的組織病理學變化(×200)Fig.3 The histopathological changes of A.salmonicida infection in O.potamophilus(×200)a.健康魚肝臟，b.患病魚肝臟，c.健康魚鰓，d.患病魚鰓，e.健康魚脾臟，f.患病魚脾臟，g.健康魚腎臟，h.患病魚腎臟 ★表示細胞核染色較深。☆表示肝細胞溶解壞死，細胞核溶解消失。□表示細胞腫脹變性，壞死脫落。▲表示細胞空泡化。→表示細胞腫脹、空泡、壞死。*表示細胞腫脹、壞死、脫落，細胞排列疏松。#表示細胞空泡，大片壞死。

2.4 分離菌G2-4-1理化特征

分離菌G2-4-1的精氨酸二水解酶呈陽性，且多項理化特性與《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology》[9]中描述殺鮭氣單胞菌理化特性一致，詳情見表4。

表4 分離菌G2-4-1的理化特性Tab.4 Physicochemical properties of the strain G2-4-1

2.5 gyrB基因序列同源性分析

分離菌G2-4-1的gyrB基因序列在GenBank中登錄號為OM203113，所擴增gyrB基因序列長度為1 116 bp。將分離菌G2-4-1的gyrB序列在NCBI進行Blast對比，結果顯示分離菌G2-4-1的gyrB序列與殺鮭氣單胞菌的gyrB序列(GenBank登錄號為：JN711839.1)相似性為99.63%，并且進化樹分析顯示分離菌G2-4-1與所選擇的殺鮭氣單胞菌聚為一支(圖4)，表明分離菌G2-4-1與殺鮭氣單胞菌親緣關系最近。

圖4 基于分離菌G2-4-1和其他細菌gyrB基因序列構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The neighbor joining(NJ)phylogenetic tree based on the partial gyrB gene sequences

綜合供試菌株的表型特征、理化特性及gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結果，判定分離菌G2-4-1為殺鮭氣單胞菌。

2.6 殺鮭氣單胞菌毒力基因和毒力因子檢測結果

毒力基因檢測結果表明，分離菌G2-4-1攜帶aer、hly、exu、ser、alt、act和lip共7個毒力相關基因(圖5)；胞外酶及溶血活性檢測結果表明，分離菌G2-4-1具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明膠酶和溶血素活性，但不具有DNA酶活性(圖6)。

圖5 殺鮭氣單胞菌毒力相關基因PCR擴增結果Fig.5 PCR amplification of the virulence-related genes of A.salmonicida M.marker；1.aer；2.hly；3.exu；4.ser；5.alt；6.act；7.lip

圖6 殺鮭氣單胞菌胞外酶和溶血素的檢測Fig.6 Determination of extracellular enzymes and hemolysin of A.salmonicida a，b：溶血素活性；c，d：蛋白酶活性；e，f：卵磷脂酶活性；g，h：明膠酶活性；i，j：淀粉酶活性；k，l：脂酶活性；a.c.e.g.i.k：實驗組；b.d.f.h.j.l：對照組。

2.7 殺鮭氣單胞菌耐藥性分析

分離菌G2-4-1對青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、麥迪霉素、多粘菌素B和克林霉素8種藥物耐藥，對克拉霉素和大觀霉素2種藥物中介，對恩諾沙星、氟苯尼考等24類藥物敏感(表5)。

表5 殺鮭氣單胞菌對34種抗菌藥物的敏感性Tab.5 Sensitivity of A.salmonicide to 34 antimicrobial agents

2.8 殺鮭氣單胞菌感染對河川沙塘鱧免疫相關基因表達的影響

2.8.1 殺鮭氣單胞菌感染對鰓組織中免疫相關基因表達的影響

由圖7可知，MHCⅡB免疫相關基因的相對表達量在感染6 h后顯著上調表達，在48 h達到峰值，上調0.84倍，在48 h后開始逐漸下降；MyD88、TLR和SOD共3個免疫相關基因的相對表達量在感染 6 h后顯著上調表達，在24 h達到峰值，分別上調1.83、1.8和1.47倍，在24 h后開始逐漸下降。結果表明河川沙塘鱧感染初期這些免疫相關基因的表達量在鰓組織中都迅速上調。

圖7 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后不同時間點(0、6、12、24、48、72 h)鰓組織中免疫相關基因的相對表達情況Fig.7 Analysis of immune-related genes expression in O.potamophilus gill in response to A.salmonicida challenge by qRT-PCR at 0，6，12，24，48，72 h post-injection**表示極顯著性差異(P≤0.01)

2.8.2 殺鮭氣單胞菌感染對脾臟組織中免疫相關基因表達的影響

由圖8可知，MHCⅡB免疫相關基因的表達量在感染 6 h后相對顯著上調表達，在12 h達到峰值，上調2.58倍，在12 h后開始逐漸下降；MyD88、TLR和SOD共3個免疫相關基因的表達量在感染 6 h后相對顯著上調表達，在24 h達到峰值，分別上調1.37、1.6和1.38倍，在24 h后開始逐漸下降。結果表明河川沙塘鱧感染初期這些免疫相關基因的表達量在脾臟組織中都迅速上調。

圖8 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后不同時間點(0、6、12、24、48、72 h)脾臟組織中免疫相關基因的相對表達情況Fig.8 Analysis of immune-related genes expression in O.potamophilus spleen in response to A.salmonicida challenge by qRT-PCR at 0，6，12，24，48，72 h post-injection**表示極顯著性差異(P≤0.01)

2.8.3 殺鮭氣單胞菌感染對腎臟組織中免疫相關基因表達的影響

由圖9可知，MyD88免疫相關基因的相對表達量在感染12 h后顯著上調表達，在24 h達到峰值，上調1.13倍，然后在24 h后開始逐漸下降；MHCⅡB、TLR和SOD共3個免疫相關基因的相對表達量在感染6 h后顯著上調表達，在24 h達到峰值，分別上調2.62、0.89和1.47倍，在24 h后開始逐漸下降。結果表明河川沙塘鱧感染初期這些免疫相關基因的表達量在腎臟組織中均迅速上調。

圖9 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后不同時間點(0、6、12、24、48、72 h)腎臟組織中免疫相關基因的相對表達情況Fig.9 Analysis of immune-related genes expression in O.potamophilus kidney in response to A.salmonicida challenge by qRT-PCR at 0，6，12，24，48，72 h post-injection*表示顯著性差異(0.01

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌的致病性

殺鮭氣單胞菌是革蘭氏陰性短桿菌，屬氣單胞菌屬 (Aeromonas)，可導致魚類發(fā)生癤瘡病或潰瘍病[12]。殺鮭氣單胞菌菌體主要集中在魚的肌肉和免疫器官，特別是在魚的脾臟、腎臟和肝臟組織，被其感染的魚類經常出現體表潰爛，器官發(fā)黑甚至嚴重出血[13]。本實驗中，感染殺鮭氣單胞菌的河川沙塘鱧臨床表現主要癥狀為體表不同程度地潰瘍，并且鰭條充血、出血，解剖時發(fā)現肝臟出血，這與雷美華等[14]報道殺鮭氣單胞菌可導致鰻鱺(Anguillajaponica)體表潰瘍，皮膚出現少量變色斑點，鰓傷，嚴重時出現死亡一致；COSCELLI等[15]報道殺鮭氣單胞菌能引起大菱鲆(Scophthatmusmaximus)肝臟出血，體表潰瘍；THOMAS等[16]發(fā)現殺鮭氣單胞菌引起胡鯰(Clariasbatrachus)體表粘液減少，鰓絲損傷，肝臟組織空泡化，嚴重時出現大量死亡等研究報道結果存在一致性，但并不完全相同，推測為同一種病原菌感染不同水產動物會出現不同的臨床癥狀表現，也可能是因為養(yǎng)殖水體溫度不同，病原菌理化特性存在差異性。據報道，感染殺鮭氣單胞菌患病或死亡的水產動物包括雜交鱘(Hybridsturgeon)[17]、鯽(Carassiusauratus)[18]、鯉(Lyprinuscarpio)[18]、長江江豚(Neophocaenaasiaeorientalis)[18]、裸蓋魚(Anoplopomafimbria)[19]和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[20]等，可見其致病性較強且宿主范圍較廣。

3.2 殺鮭氣單胞菌的毒力因子

殺鮭氣單胞菌的強致病性是由其多個毒力因子共同作用的[14]，郝婧薇等[21]研究發(fā)現，殺鮭氣單胞菌毒力基因主要包括aer和hly等。本研究通過檢測發(fā)現分離菌G2-4-1攜帶aer、hly、exu、ser、alt、act和lip共7個毒力基因，具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明膠酶和溶血素活性，但不具有DNA酶活性。這與張飄等[17]在感染殺鮭氣單胞菌的雜交鱘中的檢測結果一致；與刁菁等[22]在感染殺鮭氣單胞菌的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中的檢測結果基本一致，其還檢測出封閉帶毒素，而本實驗中并未檢出，推測這一差異是由于感染方式、劑量不同和菌株親緣性較遠。而ser、alt、act、exu和lip同樣與氣單胞菌的致病性有著重要聯系，ser能夠幫助細菌破壞并溶解宿主蛋白，可導致宿主結構損傷[23]，alt和act具有溶血性和細胞毒性，可裂解細胞和損壞組織，引發(fā)魚源出血和敗血等癥狀[24]，同時exu和lip可激活氣單胞菌的氣溶素活性，并增強細菌在宿主細胞中的黏附能力及降解宿主細胞成分[25]。本實驗中，感染河川沙塘鱧的肝、鰓、脾臟和腎臟組織均出現了不同程度的損傷，最為嚴重的是肝臟大量出血，根據組織病理觀察發(fā)現部分肝細胞溶解壞死，細胞核溶解消失，推測這一現象由殺鮭氣單胞菌攜帶的alt和act所引起。鰓組織中，鰓小片呼吸上皮細胞腫脹變性，出現壞死脫落，鰓細胞排列疏松紊亂，出現炎癥細胞浸潤，細胞空泡化，這與雜交鱘[17]感染殺鮭氣單胞菌后的組織病理變化一致。脾臟細胞出現腫脹、空泡、壞死，腎小管上皮細胞腫脹、壞死、脫落，腎間組織細胞出現空泡、壞死，綜合分析推測殺鮭氣單胞菌的主要靶器官為肝臟。

3.3 河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后免疫相關基因差異表達分析

本實驗鰓組織中，MHCⅡB表達量在48 h達到峰值，上調0.84倍，MyD88、TLR和SOD表達量在24 h達到峰值，分別上調1.83、1.8和1.47倍；脾臟組織中，MHCⅡB表達量在12 h達到峰值，上調2.58倍 ，MyD88、TLR和SOD表達量在24 h達到峰值，分別上調1.37、1.6和1.38倍；腎臟組織中，MHCⅡB、MyD88、TLR和SOD表達量均在24 h達到峰值，分別上調2.62、1.13、0.89和1.47倍，這與LIU等[4]研究發(fā)現河川沙塘鱧感染維氏氣單胞菌后，短時間內相關免疫基因的表達量顯著上調的結果相似，包括MHCⅡB、SOD等。龐紀彩等[26]和鄭風榮等[27]研究表明，MHCⅡB的特異免疫和氧化壓力成正相關，在細胞免疫和體液免疫中起著重要作用。范澤軍等[28]研究發(fā)現TLR負反饋機制對信號的平衡調節(jié)在抗感染免疫中起著重要作用。KAWAI等[29]研究指出MyD88是Toll樣受體信號中重要的轉導蛋白，能在信號途徑中發(fā)揮重要作用，還可以調控細胞因子的分泌從而影響適應性免疫應答。楊新良等[30]研究發(fā)現免疫細胞吞噬細菌后會激活胞內NADPH氧化酶，從而產生殺菌物質和一系列活性氧(ROS)。但是何勤等[31]研究指出當魚體長期處于氧化應激狀態(tài)下時，機體的免疫器官會受到不同程度的損傷，從而導致機體免疫力下降，最終引發(fā)疫病或死亡。LIN等[32]研究指出SOD可以清除ROS從而維持體內穩(wěn)態(tài)，LIU等[33]研究指出SOD清除機體的ROS能力可以作為評價機體免疫力的重要指標。大西洋鮭(S.salar)感染殺鮭氣單胞菌后，其肝臟和血清SOD活性顯著提高，表明了實驗魚感染殺鮭氣單胞菌后體內產生大量自由基并促進其抗氧化酶活性的提高[34]，本實驗結果與其結論具有相似之處。本實驗中隨著感染時間的增加，鰓、脾臟和腎臟組織中不同免疫相關基因表達量顯著上調，大部分在24 h達到峰值，可推測河川沙塘鱧感染殺鮭氣單胞菌后特異性免疫增強，抗感染免疫能力增強，適應性免疫能力增強，并且體內抗氧化酶活性明顯提高，體現出當河川沙塘鱧遇到殺鮭氣單胞菌入侵時，這些基因均參與了河川沙塘鱧對殺鮭氣單胞菌的免疫應答，通過不同免疫防護機制共同抵抗病原菌入侵從而保護機體，這些結果為進一步了解河川沙塘鱧和殺鮭氣單胞菌的相互作用提供了理論依據。

4 結論

本研究從患病河川沙塘鱧體內分離獲得1株具有致病性的殺鮭氣單胞菌 G2-4-1，其對河川沙塘鱧7 d LD50為1.8×106CFU/mL，該病原菌感染可導致河川沙塘鱧肝臟、鰓、脾臟和腎臟不同程度的變性、壞死和炎性細胞浸潤。該菌株攜帶aer、hly、exu、ser、alt、act和lip等毒力相關基因，具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、脂酶、明膠酶和溶血素活性，對恩諾沙星、氟苯尼考等藥物敏感。