飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、營養(yǎng)物質(zhì)利用、血清生化指標(biāo)和腸道微生物的影響

柯虹瑜，王瑗瑗，張 鑫，姚文祥，李小勤，冷向軍，2，3

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)是世界范圍內(nèi)最為重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種，也是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對(duì)蝦品種。2021年，我國凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到了197萬噸[1]。高密度集約化養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦自身免疫力下降，容易誘發(fā)各種疾病。為解決以上問題，抗生素被大量使用，由此嚴(yán)重影響了水產(chǎn)品質(zhì)量安全。因此，尋找抗生素的替代品，一直是行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。已有研究表明，有機(jī)酸及其鹽類有望成為蝦類養(yǎng)殖中的綠色飼料添加劑[2]。

富馬酸是一種酸性較弱有機(jī)酸，長久以來一直被用作食品添加劑。其在畜禽飼料中的應(yīng)用較多，在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用較少[3]。研究表明，飼料中添加富馬酸可提高非洲鯰(Clariasgariepinus)抗溫和氣單胞菌能力，具有替代抗生素的潛力[3]。三丁酸甘油酯是丁酸的前體物質(zhì)，其釋放的丁酸具有較強(qiáng)酸性，能有效抑制腸道致病菌的增殖[4]。檸檬酸可平衡腸道菌群，促進(jìn)對(duì)維生素、礦物質(zhì)的吸收，由此提高動(dòng)物的生長性能[5]。蘋果酸在機(jī)體的三羧酸(TCA)循環(huán)代謝過程中發(fā)揮著重要作用，有研究表明，飼料中添加蘋果酸能提高真鯛(Pagrusmajor)對(duì)磷的利用率[6]。各種有機(jī)酸的作用機(jī)理可能不完全相同，將其復(fù)合后，有可能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，產(chǎn)生更好的作用效果。ROMBENSO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酸組(丁酸、琥珀酸、富馬酸)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的存活率顯著高于單獨(dú)添加組(富馬酸)。目前，在凡納濱對(duì)蝦上研究報(bào)道過的有機(jī)酸有檸檬酸[8]、丁酸鈉[2，9]等，但均為單獨(dú)添加，尚未見有關(guān)富馬酸和三丁酸甘油酯等有機(jī)酸聯(lián)合添加的研究。

有機(jī)酸直接添加到飼料中，會(huì)造成損失，減弱作用效果。使用微囊化技術(shù)處理有機(jī)酸，是有機(jī)酸應(yīng)用的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，在飼料中添加不同水平的微囊化有機(jī)酸復(fù)合物(organic acids complex，OC，主要成分為富馬酸、三丁酸甘油酯等)，考察對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)利用率、肝胰腺酶活、血清非特異性免疫酶活性和腸道微生物組成的影響，為有機(jī)酸在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)飼料

微囊化有機(jī)酸復(fù)合物由加拿大集富動(dòng)物營養(yǎng)公司(JefoNu-trition Inc.，Canada)提供，產(chǎn)品顆粒大小為80目，有機(jī)酸含量為50%，包括富馬酸(16%)、三丁酸甘油酯(12.5%)和少量山梨酸、蘋果酸、檸檬酸等，包被材料為氫化油脂，占微囊化有機(jī)酸復(fù)合物的50%。

設(shè)置魚粉含量為10%的基礎(chǔ)飼料(對(duì)照組)，在此基礎(chǔ)上添加0.05%，0.10%，0.15%的微囊有機(jī)酸復(fù)合物，制成4組等氮等脂飼料：OC-0，OC-5，OC-10，OC-15組。各飼料添加0.05%的三氧化二釔作為指示劑，用于測(cè)定營養(yǎng)物消化率。各飼料原料粉碎后過60目篩，逐級(jí)混勻，90 ℃制粒，95 ℃后熟化20 min，晾干至水分約10%，密封保存?zhèn)溆谩Ｅ浞浇M成及常規(guī)營養(yǎng)組成見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)水平(風(fēng)干重，%)Tab.1 Ingredients and proximate composition of experimental diets(air dry basis，%)

1.2 實(shí)驗(yàn)蝦與飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦蝦苗購自上海青浦某育苗基地，在水泥池中進(jìn)行前期暫養(yǎng)，投喂商品飼料(蘇州通威特種飼料有限公司生產(chǎn)，粗蛋白含量≥42%)50 d。正式實(shí)驗(yàn)前24 h停止投餌，挑選大小均勻的健康對(duì)蝦1 000尾初始平均體重[(1.0 ±0.1)g]，隨機(jī)分配到20口網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.2 m)，置于4口水泥池(5 m×3 m×1.2 m)中，每口水泥池中放置5口網(wǎng)箱，每口網(wǎng)箱50尾蝦。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理組，每個(gè)處理組5個(gè)平行。養(yǎng)殖期間，每日投喂量為蝦體重量的3%～10%(前期投喂高，后期低)，分4次投喂(6：00、12：00、17：00和23：00)。根據(jù)對(duì)蝦的進(jìn)食情況和天氣情況及時(shí)調(diào)整具體投喂量，各網(wǎng)箱投飼量基本一致，并確保飼料在投喂后2小時(shí)內(nèi)被采食完；晝夜充氣，采用虹吸法吸走網(wǎng)箱底部糞便，養(yǎng)殖前期每周吸污一次，換水1/3，所用水源為沉淀后池塘水。實(shí)驗(yàn)期間，水溫27～32 ℃、鹽度0.5‰～1.0‰，溶氧≥5.6 mg/L，pH2)1 kg礦物質(zhì)預(yù)混料含鉀200.00 g、鎂58.200 g、銅3.550 g、鋅5.400 g、錳1.950 g、鈷0.198 g、硒0.040 g、碘0.248 g。

值7.8～8.5，氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共持續(xù)56 d。于上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地進(jìn)行。

1.3 糞便收集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一周，于每次投喂2 h后收集網(wǎng)箱底部包膜完整的糞便，105 ℃干燥，密封存放于-20 ℃冰箱中，以進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定分析。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前，隨機(jī)取60尾蝦保存于-20 ℃冰箱，用于初始常規(guī)成分測(cè)定。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)蝦進(jìn)行24 h饑餓處理，計(jì)數(shù)并稱量總重；每網(wǎng)箱隨機(jī)取13尾蝦并于靜脈竇處取血淋巴，離心(5 000 r/min，10 min)，取血清保存?zhèn)溆谩Ｃ烤W(wǎng)箱取4尾對(duì)蝦于-20 ℃保存，用于全蝦常規(guī)成分分析。另取9尾對(duì)蝦進(jìn)行肝胰腺采樣，每3個(gè)肝胰腺匯集為1個(gè)樣本，-80 ℃保存，用于消化酶活性測(cè)定。另根據(jù)生長性能，選對(duì)照組和OC-10組，每網(wǎng)箱取3尾已抽血對(duì)蝦，將全腸(未沖洗)匯集成一個(gè)樣本，用作腸道微生物組成分析。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長性能

生長性能指標(biāo)，包括存活率(SR)、增重率(WGR)、飼料系數(shù)(FCR)、蛋白質(zhì)沉積率、脂肪沉積率，計(jì)算如下：

SR=終末尾數(shù)(尾)/初始尾數(shù)(尾)×100%

WGR=[終末體質(zhì)量(g)-初始體質(zhì)量(g)]/初始體質(zhì)量(g)

FCR=攝入飼料量(g)/[終末體質(zhì)量(g)-初始體質(zhì)量(g)]

蛋白質(zhì)沉積率=全蝦蛋白增加量(g)/總蛋白攝入量(g)×100%

脂肪沉積率=全蝦脂肪增加量(g)/總脂肪攝入量(g)×100%

1.5.2 全蝦和飼料的常規(guī)成分

飼料、全蝦和糞便常規(guī)分析采用國際標(biāo)準(zhǔn)方法(AOAC，2005)。水分含量通過烘箱在105 ℃下烘干至恒重測(cè)定；在測(cè)量水分含量之后，收集干燥的飼料、全蝦樣品，將其研磨成粉末，以測(cè)定粗蛋白，粗脂肪和灰分含量。粗蛋白質(zhì)含量采用自動(dòng)凱氏定氮儀(2300-Auto-analyzer，F(xiàn)oss Tecator，Sweden)測(cè)定；粗脂肪含量采用氯仿-甲醇法測(cè)定；粗灰分含量是將樣品碳化后放置550 ℃馬福爐中灼燒6 h后測(cè)得。

1.5.3 營養(yǎng)物質(zhì)利用率

飼料和糞便中釔元素的含量采用等離子原子發(fā)射光譜法(VistaMPX，Varian Alo Alto，California，American)進(jìn)行測(cè)定。

干物質(zhì)表觀消化率、蛋白質(zhì)表觀消化率、脂肪表觀消化率、磷表觀消化率，計(jì)算公式如下：

飼料干物質(zhì)的表觀消化率=(1-飼料中Y2O3含量/糞便中Y2O3含量)×100%

各營養(yǎng)成分的表觀消化率=[1-(糞便中某營養(yǎng)成分含量/飼料中某營養(yǎng)成分含量)×(飼料中Cr2O3含量/糞便中Cr2O3含量)]×100%

1.5.4 消化酶活力

蛋白酶：稱取蝦肝胰腺組織，加入9倍預(yù)冷生理鹽水，在4 ℃條件下勻漿，離心15 min(3 000 r/min)。取上清液用福林-酚試劑法測(cè)定酶活力。

淀粉酶：取0.1 g肝胰腺組織，加入9倍預(yù)冷生理鹽水，剪碎后加入鋼珠，于組織研磨儀進(jìn)行研磨，冷凍離心(4 ℃，3 000 r/min，10 min)，取上清液測(cè)酶活力。

酶活力定義如下：

淀粉酶(U/gprot)：底物與1×10-3g蛋白在37 ℃下反應(yīng)30 min，酶活單位以水解的0.01 g淀粉為1單位。

蛋白酶(U/mgprot)：以2%酪蛋白溶液為底物，每1×10-3mg組織蛋白在pH 7.2，37 ℃條件下，每分鐘分解酪蛋白生成10-3mg酪氨酸的濃度。

1.5.5 血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)：采用2，4-二硝基苯肼法測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(GOT，U/L)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(AST，U/L)測(cè)定采用賴氏比色法，超氧化物歧化酶(SOD，U/mL)活性和堿性磷酸酶(AKP，金氏單位/100 mL)活性分別采用黃嘌呤氧化酶法和對(duì)硝基苯磷酸鹽法測(cè)定。所有指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒測(cè)定。

1.5.6 腸道微生物

腸道微生物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行分析測(cè)定。采用16S rDNA基因V3、V4高變區(qū)特異性引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對(duì)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過Illumina MiSeq platform(Illumina)平臺(tái)對(duì)腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)處理得到優(yōu)化序列，對(duì)獲得的不同相似度水平序列，以97%的相似水平對(duì)OUT進(jìn)行劃分。在Majorbio Cloud Platform(www.majorbio.com)基于OTU進(jìn)行alpha多樣性使用UPARSE(V7.1)分析菌群豐度(Chao 指數(shù))和菌群多樣性(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))。不同分類的鑒定結(jié)果以O(shè)UT注釋為基準(zhǔn)進(jìn)行劃分，統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(ANOVA)，用Tukey氏法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較(腸道微生物采用Majorbio Cloud Platform的T檢驗(yàn))。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為平均值有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 生長性能

由表2可知，飼料中添加了有機(jī)酸復(fù)合物后，OC-10和OC-15組的WGR較對(duì)照組提高了18.7%和17.9%，F(xiàn)CR降低了16.1%和18.5%。各組蛋白質(zhì)沉積率、脂肪沉積率、SR無顯著差異。

表2 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響Tab.2 Effect of organic acids complex supplementation on growth performance of L.vannamei

2.2 全蝦體成分

由表3可知，各組對(duì)蝦全蝦水分、粗灰分含量與對(duì)照組相比均無顯著性差異。飼料中添加OC后顯著降低了全蝦粗脂肪含量。OC-5和OC-10組粗蛋白較對(duì)照組顯著提高。

表3 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分的影響(濕重)Tab.3 Effect of organic acids complex supplementation on body composition of L.vannamei(wet weight) %

2.3 營養(yǎng)物質(zhì)利用率

由表4可知，在飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)消化率、脂肪消化率和磷消化率無顯著影響。

表4 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦營養(yǎng)物質(zhì)利用率的影響Tab.4 Effect of organic acids complex supplementation on nutrient utilization of L.vannamei %

2.4 肝胰腺消化酶

由圖1可知，飼料中添加0.05%～0.15%有機(jī)酸復(fù)合物，均顯著提高了對(duì)蝦肝胰腺淀粉酶活性，但對(duì)肝胰腺蛋白酶活性無顯著影響(圖2)。

圖1 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺淀粉酶的影響Fig.1 Effect of dietary organic acids complex on amylase activity in hepatopancreas of L.vannamei

圖2 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺蛋白酶的影響Fig.2 Effect of dietary organic acids complex on protease activity in hepatopancreas of L.vannamei

2.5 血清生化指標(biāo)

由表5可知，各有機(jī)酸復(fù)合物添加組超氧化物歧化酶均較對(duì)照組顯著提高，各組堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶無顯著差異。

表5 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effect of organic acids complex supplementation on serum biochemical parameters of L.vannamei

2.6 腸道微生物

由表6可知，OC-0組和OC-10組物種覆蓋率接近1，說明已經(jīng)將群落菌體充分采樣。數(shù)據(jù)可以代表細(xì)菌種群。OC-10組的Chao指數(shù)在數(shù)值上高于OC-0組。

表6 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物后凡納濱對(duì)蝦腸道微生物多樣性指數(shù)Tab.6 Diversity index of intestinal microbial of L.vannamei fed diets with organic acids complex supplementation

OTU的韋恩圖如圖3所示，OC-0組和OC-10組共有OUT數(shù)目為819個(gè)，OC-0組和OC-10組各特有OUT數(shù)目為250個(gè)和86個(gè)。

圖3 OTUs的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of OTUs

由圖4知，OC-0組和OC-10組在門水平上主要有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)。其中，變形菌門、放線菌門、厚壁菌門是OC-0組的優(yōu)勢(shì)菌門，分別占細(xì)菌總數(shù)的53.54%，15.94%，10.67%。OC-10組的優(yōu)勢(shì)菌門有變形菌門，占細(xì)菌總數(shù)的53.79%，以及放線菌門(19.97%)和綠彎菌門(7.81%)。放線菌門在兩組中占比存在數(shù)值上的差異(圖4，圖5，表7)。

圖4 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物后凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的門水平豐度Fig.4 Community abundance of intestinal microbiota at phylum level of L.vannamei fed diets with organic acids complex supplementation

圖5 凡納濱對(duì)蝦腸道微生物門水平上的差異檢驗(yàn)Fig.5 The difference test of intestinal microbiota of L.vannamei at phylum level

表7 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中主要菌門的占比Tab.7 The proportions of major intestinal flora of L.vannamei at phylum level %

在屬水平上，芽殖桿菌屬(Gemmobacter)是主要腸道微生物，占OC-0組16.34%，占OC-10組17.73%。此外，OC-0組的優(yōu)勢(shì)菌還有Arthrospira_PCC-7345(4.58%)，而分枝桿菌屬(Mycobacterium)是OC-10的優(yōu)勢(shì)菌。其中，OC-10組的分枝桿菌屬較OC-0組顯著增加(圖6，圖7，表8)。

圖6 飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物后凡納濱對(duì)蝦腸道菌群的屬水平豐度Fig.6 Community abundance of intestinal microbiota at genus level of L.vannamei fed diets with organic acids complex supplementation

圖7 凡納濱對(duì)蝦腸道微生物屬水平上的差異檢驗(yàn)Fig.7 The difference test of the intestinal microbiota of L.vannamei at genus level

表8 凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中主要菌屬的占比Tab.8 The proportions of major intestinal flora of L.vannamei at genus level %

3 討論

3.1 OC對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能和體成分的影響

有機(jī)酸在飼料中的添加，能夠起到促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長的作用[10]。研究表明，在飼料中補(bǔ)充0.2%檸檬酸，顯著提高了凡納濱對(duì)蝦增重率，降低了飼料系數(shù)[6]。唐啟峰等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含有三丁酸甘油酯的飼料后，凡納濱對(duì)蝦的周增重和蛋白質(zhì)效率顯著提高，餌料系數(shù)顯著降低。本實(shí)驗(yàn)中，飼料中添加0.1%和0.15%有機(jī)酸復(fù)合物后，顯著提高了蝦體增重率，降低了飼料系數(shù)(P<0.05)。有機(jī)酸對(duì)生長性能的改善，可能與促進(jìn)腸道有益菌的增長，促進(jìn)其消化吸收有關(guān)[10]。此外，在含12%魚粉的飼料中添加0.3%丙酸鈉和富馬酸，對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能無顯著影響[9]。不同的研究結(jié)果，可能與有機(jī)酸組成和基礎(chǔ)配方不同有關(guān)。

在全蝦體成分方面，OC的添加降低了粗脂肪含量(P<0.05)，OC-5和OC-10組的粗蛋白含量顯著增加(P<0.05)。粗蛋白含量的提高可能是由于有機(jī)酸復(fù)合物的添加降低了腸道內(nèi)的pH值，使食物排空減慢，蛋白質(zhì)在肝胰腺內(nèi)停留時(shí)間延長導(dǎo)致[11]。在斑節(jié)對(duì)蝦飼料中添加1%富馬酸，對(duì)幼蝦粗脂肪含量并無顯著影響[7]；在飼料中添加檸檬酸，對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分也無顯著影響[8]。XU等[12]研究表明，丁酸可通過降低脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平降低大黃魚(Larimichthyscrocea)體脂含量。本實(shí)驗(yàn)中，全蝦粗脂肪含量的降低，可能與OC促進(jìn)了脂肪代謝有關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

3.2 OC對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化能力的影響

研究表明，在攝食了含有機(jī)酸的飼料后，水產(chǎn)動(dòng)物的營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率會(huì)得到提高，這與有機(jī)酸種類和養(yǎng)殖對(duì)象密切相關(guān)[13]。WING等[14]發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦攝食了添加2%有機(jī)酸復(fù)合物(含甲酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸)的飼料后，蛋白質(zhì)消化率、干物質(zhì)消化率、磷消化率均顯著提高(P<0.05)。消化率的提高，可能與刺激了消化腺的分泌有關(guān)。然而，在建鯉飼料中添加0.25%的蘋果酸、富馬酸和丁酸鈉，僅提高了干物質(zhì)和粗蛋白消化率(P>0.05)[15]。本實(shí)驗(yàn)中，在飼料中添加有機(jī)酸復(fù)合物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)消化率、脂肪消化率和磷消化率均無顯著影響(P>0.05)。不同的作用結(jié)果，可能與有機(jī)酸與養(yǎng)殖對(duì)象種類有關(guān)。

凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中消化營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵酶有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。在飼料中添加OC后，凡納濱對(duì)蝦的淀粉酶活力顯著提高。這與翟秋玲等[16]的結(jié)果一致。在菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)[16]飼料中添加三丁酸甘油酯使回腸的脂肪酶活力、空腸和回腸胰蛋白酶活力以及腸道淀粉酶活力得到提高。在草魚(Ctenopharyngodonidella)飼料中添加復(fù)合酸后，淀粉酶活力顯著提高[17]。本實(shí)驗(yàn)中凡納濱對(duì)蝦的蛋白酶活性與對(duì)照組相比無顯著差異，但在數(shù)值上出現(xiàn)了下降。甲殼動(dòng)物胰蛋白酶的最適pH環(huán)境為7～9，攝入的酸過多可能會(huì)影響凡納濱對(duì)蝦肝胰腺內(nèi)環(huán)境[11]。

3.3 OC對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清生化指標(biāo)的影響

凡納濱對(duì)蝦無特異性免疫系統(tǒng)，非特異免疫系統(tǒng)是其抵御病害的重要系統(tǒng)，肝胰腺是凡納濱對(duì)蝦極其重要的器官。為探究復(fù)合酸是否對(duì)肝胰腺產(chǎn)生作用，選取谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)來評(píng)價(jià)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺健康程度。在無刺激環(huán)境下，轉(zhuǎn)氨酶活性較低，心臟和肝臟組織細(xì)胞受到損傷，或者天氣變化較大，血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高[18]。在對(duì)草魚的研究中，程卓[19]發(fā)現(xiàn)三丁酸甘油酯并未影響谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。本實(shí)驗(yàn)中，各有機(jī)酸復(fù)合物添加組的AST、ALT與對(duì)照組相比無顯著差異，表明OC并未對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺產(chǎn)生不利影響。

3.4 OC對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的影響

本實(shí)驗(yàn)中，添加有機(jī)酸復(fù)合物后，OC-10組的Chao指數(shù)得到提高，表明菌群豐度提高，OC改變了腸道菌群組成[23]。已有研究證明，菌群多樣性在維持生態(tài)功能方面有重要作用，提高菌群多樣性可以提高菌群穩(wěn)定性，減少機(jī)體患病風(fēng)險(xiǎn)[24]。門水平上，變形菌門(Proteobacteria)是凡納濱對(duì)蝦腸道中發(fā)現(xiàn)的核心細(xì)菌類群[25]，厚壁菌門(Firmicutes)在草魚腸道中占主導(dǎo)地位[26]。本實(shí)驗(yàn)中凡納濱對(duì)蝦腸道微生物菌群主要有變形菌門、厚壁菌門、放線菌門等，與吳金鳳等[27]的研究結(jié)果相似。可見，保守性是凡納濱對(duì)蝦腸道微生物菌群組成的特點(diǎn)之一。厚壁菌門中產(chǎn)丁酸細(xì)菌可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，宿主可以利用這些脂肪酸促進(jìn)腸粘膜的健康[28]。本實(shí)驗(yàn)中，變形菌門在菌門中占比明顯高于厚壁菌門，LI等[25]在凡納濱對(duì)蝦中也有相似發(fā)現(xiàn)，這可能是由于兩種細(xì)菌的生理功能差異以及其他影響因素，如飲食和棲息地。另外，本實(shí)驗(yàn)中，擬桿菌門也是OC-0組和OC-10組的優(yōu)勢(shì)菌群之一。當(dāng)機(jī)體失衡時(shí)，擬桿菌門可能會(huì)成為致病菌[29]，當(dāng)機(jī)體維持正常時(shí)，則是凡納濱對(duì)蝦腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌，能夠從許多方面影響機(jī)體健康。