基于H2O2-丁基玫瑰紅B-Fe2+體系的熒光猝滅法測定血清過氧化氫酶的活性

蒲文靜,白 瑩,董 娜,張愛菊,張小林

(甘肅醫學院,平涼 744000)

過氧化氫酶(CAT)是人體組織中重要的抗氧化酶,具有積極的防御功能[1-2],能夠清除細胞代謝產物H2O2,阻止H2O2進一步轉化為氧化性更強的羥自由基(·OH)。近年來,血清CAT活性作為腫瘤和抗衰老有關的指標而備受關注。傳統CAT活性測定方法包括滴定法[3]、比色法[4]、光度法[5-7]等。以羅丹明類染料作為探針的熒光分光光度法在生物檢測和藥物分析領域應用廣泛[8-9]。文獻[10]基于碘-羅丹明B締合反應的靜態熒光猝滅原理測定CAT活性,該方法有較寬的檢測范圍(1.5×10-4～9×10-3U·mL-1)和較低的檢出限(5×10-6U·mL-1),可用于魚肝提取液中CAT活性分析。

丁基玫瑰紅B(BRMB)又名丁基羅丹明B、四乙基羅丹明丁酯,其結構中含有C=N基團[11],在釋放熒光的同時很容易被H2O2氧化,出現瞬間熒光猝滅現象[12];CAT屬于血紅蛋白酶,具有電子傳遞作用,能分解部分H2O2。因此,本工作利用CAT活性對H2O2-BRMB-Fe2+體系熒光變化程度的影響,提出了基于H2O2-BRMB-Fe2+體系的熒光猝滅法測定血清CAT活性的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

930N型熒光分光光度計。

1 mmol·L-1H2O2底液：用水將30%(質量分數,下同)H2O2溶液稀釋500倍,高錳酸鉀法測其濃度為19.5 mmol·L-1,再用水二次稀釋至1 mmol·L-1,備用。

1 U·mL-1CAT標準溶液：取CAT標準品5 mg,用水溶解并稀釋至100 mL,碘量法[13]測其活性為100 U·mL-1,再用水二次稀釋至1 U·mL-1,備用。

0.02 mmol·L-1BRMB溶液：取0.010 7 g BRMB,用水溶解并稀釋至1 000 mL,備用。

0.01 mol·L-1Fe2+溶液：取0.278 0 g FeSO4·7H2O,用水溶解并稀釋至100 mL,備用。

0.1 mol·L-1冰乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)：取乙酸鈉1.79 g,加入冰乙酸4.46 mL,再用水稀釋至1 000 mL,備用。

CAT標準品為優級純;30%H2O2溶液、BRMB、FeSO4·7H2O均為分析純;試驗用水為蒸餾水。

1.2 試驗方法

取血清樣品10 μL,加入1 mmol·L-1H2O2底液0.50 mL,于30 ℃恒溫反應15 min,再依次加入0.02 mmol·L-1BRMB溶液0.70 mL、0.1 mol·L-1冰乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)1.00 mL、0.01 mol·L-1Fe2+溶液0.08 mL,混勻,于室溫反應20 min后用水定容至10 mL,靜置1 min。以水為參比,設置激發波長為365 nm,在1 cm吸收池中測定上述體系在590 nm發射波長處的熒光強度F;以煮死酶液為對照,按照同樣的方法測定其在590 nm發射波長處的熒光強度F0,以熒光強度差值ΔF(ΔF=F-F0)計算CAT活性。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜圖

圖1為不同體系的熒光光譜圖(激發波長為365 nm),其中BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,CAT活性為0.05 U·mL-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1。

1-BRMB;2-H2O2+BRMB+Fe2+;3-CAT+H2O2+BRMB+Fe2+圖1 熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra

結果表明：BRMB于590 nm處產生明顯的熒光發射峰(曲線1);H2O2既是氧化劑又是還原劑,在冰乙酸-乙酸鈉緩沖液中,H2O2氧化BRMB,使BRMB的熒光基團遭到破壞,出現熒光猝滅現象(曲線2);CAT是分解H2O2的專一酶,H2O2的分解在一定程度上恢復了BRMB的熒光(曲線3),其恢復程度與CAT活性有關。

2.2 熒光猝滅條件的選擇

2.2.1 催化劑

試驗分別考察了Fe2+、Fe3+對H2O2和BRMB反應催化性能的影響,所得熒光光譜圖見圖2,其中cBRMB=1.4 μmol·L-1,cH2O2=0.05 mmol·L-1,cFe2+=80.0 μmol·L-1,cFe3+=80.0 μmol·L-1。

1-BRMB+H2O2/Fe2+;2-H2O2+BRMB+Fe2+;3-H2O2+BRMB+Fe3+;4-BRMB+Fe3+圖2 Fe2+、Fe3+對體系熒光強度的影響Fig.2 Effects of Fe2+ and Fe3+ on the fluorescence intensity

結果表明：在BRMB溶液中只加入H2O2,熒光強度基本不變(曲線1);在H2O2和BRMB混合溶液中分別加入Fe2+、Fe3+后,均出現熒光猝滅現象(曲線2、3),而Fe2+產生的猝滅現象更明顯(曲線2);當不存在H2O2,Fe2+、Fe3+分別與BRMB混合時,Fe2+對BRMB無影響(曲線1),而Fe3+亦可使熒光猝滅(曲線4),說明Fe3+是反應物而非催化劑。因此,試驗選擇以Fe2+作為H2O2氧化BRMB的催化劑。

2.2.2 BRMB濃度

BRMB濃度直接影響后續酶活性的測定范圍,濃度偏小,線性范圍變窄;濃度過大,締合作用導致體系穩定性變差,酶活性測定準確度受影響。在冰乙酸-乙酸鈉緩沖液中,單獨考察了BRMB濃度對其熒光強度的影響。結果表明：熒光強度隨著BRMB濃度的增大而增大,并且BRMB濃度在1.4 μmol·L-1以內與對應的熒光強度呈線性關系。因此,試驗選擇BRMB的濃度為1.4 μmol·L-1。

2.2.3 酸度

試驗考察了酸度對BRMB熒光釋放和H2O2-BRMB-Fe2+體系熒光猝滅的影響。結果表明：在強酸性環境中,質子化作用削弱了BRMB的熒光強度,不利于猝滅反應的進行;當pH>3.5時,熒光猝滅基本完全;當pH>4.0時,BRMB的熒光強度較大,并且熒光強度差值ΔF趨于恒定;當pH>6.8時,Fe(OH)2的生成導致Fe2+催化性能降低。為防止Fe2+水解,試驗選擇酸度為pH 4.2的冰乙酸-乙酸鈉緩沖液作為猝滅反應的介質。

2.2.4 熒光猝滅反應時間

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1的混合溶液中,考察了熒光猝滅反應時間對體系熒光強度的影響。結果表明,受Fe2+催化影響,H2O2氧化BRMB速率較快,熒光強度在5 min內快速下降,20 min后降到最低并趨于恒定。因此,試驗選擇的熒光猝滅反應時間為20 min。

2.2.5 Fe2+濃度

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1的混合溶液中,改變Fe2+濃度,測定體系的熒光強度。結果表明：當無Fe2+時,BRMB與H2O2不反應,熒光強度無變化;當Fe2+濃度不大于80.0 μmol·L-1時,熒光強度顯著變小,并且Fe2+濃度越大,熒光猝滅越明顯;當Fe2+濃度大于80.0 μmol·L-1時,熒光強度趨于恒定。因此,試驗選擇的熒光猝滅反應催化劑Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1。

2.3 酶促反應條件的選擇

2.3.1 H2O2濃度

以酶空白體系為考察對象,在BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1,體系酸度為pH 4.2的混合溶液中,改變H2O2濃度,測定體系的熒光強度。結果顯示：當H2O2濃度在0.05 mmol·L-1以內時,熒光猝滅現象明顯,且熒光強度隨H2O2濃度的增大而減小;當H2O2濃度大于0.05 mmol·L-1時,熒光強度趨于恒定。為拓寬酶活性測定范圍,減少系統誤差,試驗選擇酶促反應體系中底物H2O2濃度為0.05 mmol·L-1。

2.3.2 酶促反應時間

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1,CAT活性為0.05 U·mL-1,體系酸度為pH 4.2的混合溶液中,改變酶促反應時間,測定體系的熒光強度差值ΔF。結果表明,酶促反應速率較快,12 min后ΔF值趨于恒定。為確保酶促反應更完全,試驗選擇的酶促反應時間為15 min。

2.4 共存物質的影響

2.5 標準曲線和檢出限

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1,體系酸度為pH 4.2的混合溶液中加入適量的CAT標準溶液,使其活性分別為0,0.005,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 U·mL-1,測定體系的ΔF值。以CAT活性為橫坐標,對應的ΔF值為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示：CAT標準曲線的線性范圍為0.005～0.05 U·mL-1,線性回歸方程為y=1 205x-1.476,相關系數為0.997 4。

平行測定酶空白體系10次,以3s/k(s為標準偏差,k為線性回歸方程的斜率)計算檢出限,結果為1.2×10-3U·mL-1,優于紫外分光光度法的[6-7]。

2.6 樣品分析和回收試驗

按照試驗方法對6份血清CAT活性進行測定(血清由體檢中心提供,屬于健康個體),計算測定值的相對標準偏差(RSD),并與碘量法[13]作比較,然后按照標準加入法進行回收試驗,計算回收率,結果見表1。

表1 樣品分析和回收試驗結果(n=6)

結果表明：血清CAT活性測定值為31.50～72.30 U·mL-1,與碘量法基本一致;正常人的血清CAT活性與年齡有相關性,青少年的明顯高于中老年的;加標回收率和RSD進一步證明該方法具有良好的準確度和較高的精密度。

本工作利用H2O2-Fe2+可以快速使BRMB發生熒光猝滅,而CAT對該猝滅有抑制效應,提出了基于H2O2-BRMB-Fe2+體系的熒光猝滅法測定血清CAT活性的方法。H2O2-BRMB-Fe2+熒光猝滅體系屬于動態猝滅,反應更為完全徹底,直接用于血清CAT活性分析,無需繁雜的樣品前處理,血清自身濁度、色度不影響酶活性的測定;并且以煮死酶液為空白對照,血清中的共存還原性物質不會對CAT造成干擾。該方法檢測范圍更寬,檢出限更低,成功用于人血清CAT活性測定,對臨床引領和示范作用具有重要意義。