根灌外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿生理特性的影響研究

張 玲,麻冬梅*,劉曉霞,馬巧利,侯汶君,李嘉文,蘇立娜,杭嘉慧

(1.寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/西北退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院,寧夏 銀川 750021; 2.寧夏大學(xué)林業(yè)與草業(yè)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是享有“牧草之王”美譽(yù)的豆科多年生草本植物,因其固氮能力強(qiáng),蛋白質(zhì)含量高、產(chǎn)量高,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,成為我國(guó)栽培面積最大的飼草作物之一[1]。截至2019年,我國(guó)紫花苜蓿商品草種植面積已達(dá)4.4×109m2,但隨著畜牧業(yè)快速發(fā)展和工廠化養(yǎng)殖快速推廣,我國(guó)優(yōu)質(zhì)飼草需求仍有40%～60%的缺口,紫花苜蓿所具有的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值使其成為飼料行業(yè)的主力軍[2-4]。干旱是抑制植物生長(zhǎng)最嚴(yán)重的非生物脅迫之一,干旱發(fā)生后,細(xì)胞器產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),生成大量過(guò)氧化物,膜脂過(guò)氧化加劇,影響細(xì)胞的正常代謝,抑制植物光合作用[5]。對(duì)植物的品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生影響的同時(shí),也會(huì)限制植物的地理分布[6]。干旱破壞ROS產(chǎn)生和清除間的平衡,產(chǎn)生大量H2O2,過(guò)量活性氧積累對(duì)細(xì)胞膜造成損傷—破壞核酸、氧化蛋白質(zhì)、引起脂質(zhì)過(guò)氧化,H2O2是極具細(xì)胞毒性的活性氧之一,大量積累嚴(yán)重影響正常代謝[7-8]。因此,確定應(yīng)對(duì)干旱脅迫的戰(zhàn)略,對(duì)全球農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。紫花苜蓿雖然可以抵擋一定程度的干旱,但是隨著全球氣候變化加劇,畜牧業(yè)發(fā)展牧草需求量增加,如何維持干旱脅迫下紫花苜蓿的生長(zhǎng)和產(chǎn)量,保障其高效發(fā)揮生態(tài)效益已經(jīng)成為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

褪黑素(Melatonin,MT)是一種調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、調(diào)控植物生長(zhǎng)的吲哚胺植物激素[9]。它首先在動(dòng)物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn),自1995年以來(lái),在多種植物的根、葉、種子和果實(shí)中檢測(cè)到褪黑激素的存在[10-11],2018年研究人員在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)植物褪黑激素受體—CAND2/PMTR1[12]。大量研究表明褪黑素對(duì)不良環(huán)境下作物耐受性提高有正向作用[13],其中包括清除活性氧、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、降低鹽脅迫對(duì)葉綠素的破壞,調(diào)控抗逆基因的表達(dá),從而提高植物抗逆性[14-15]。褪黑素可以緩解各種類型的非生物脅迫,如鹽堿、干旱、極端溫度和重金屬等[16-18],并在植物中作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),維持細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)[19]。桃苗(Prunuspersica)經(jīng)褪黑素預(yù)處理后氣孔開(kāi)度減小,褪黑素增強(qiáng)干旱脅迫下桃苗根系活力,提高葉片相對(duì)含水量和相對(duì)葉綠素含量,并提高DREB1A,DREB2A,LEA和PIP1等逆境響應(yīng)基因的表達(dá)量[20]。外源褪黑素提高鹽脅迫下煙草(NicotianatabacumL.)葉片含水率、過(guò)氧化物酶活性,降低H2O2和丙二醛含量[21]。先前的研究主要集中在干旱對(duì)植物種子萌發(fā)或幼苗生長(zhǎng)的影響,而關(guān)于外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿的調(diào)節(jié)作用研究較少。本研究以紫花苜蓿品種‘中苜3號(hào)’為材料,采用盆栽根灌褪黑素的方法,分析褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)及生理方面的影響,探討褪黑素緩解紫花苜蓿干旱脅迫可能的生理機(jī)制,以期利用褪黑素為紫花苜蓿抵御干旱提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與干旱處理

本盆栽試驗(yàn)于2022年4月在寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院氣候室進(jìn)行,試驗(yàn)材料為‘中苜3號(hào)’紫花苜蓿。每個(gè)花盆裝有500 g過(guò)篩的壤土,土壤選用寧夏本地土壤混合基質(zhì)土,每盆播種八粒種子,紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)至12 cm高時(shí),保留長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗每盆六株,進(jìn)行連續(xù)三天根灌100 mL不同濃度褪黑素,對(duì)照組(CK)及干旱組(D)根灌等量水,在第3次根灌褪黑素的次日,除對(duì)照組正常澆水外,其余處理均進(jìn)行自然漸進(jìn)式干旱,控制澆水,達(dá)到中度干旱(土壤相對(duì)含水量在40%～45%)程度,通過(guò)稱重法每?jī)商煅a(bǔ)充蒸發(fā)散失的蒸餾水。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理:① CK;②干旱(D);③干旱+30 μmol·L-1MT(D30MT);④干旱+60 μmol·L-1MT(D60MT);⑤干旱+90 μmol·L-1MT(D90MT);⑥干旱+120 μmol·L-1MT(D120MT);⑦干旱+150 μmol·L-1MT(D150MT),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。干旱處理14天后,于早上9∶00隨機(jī)選取不同處理下紫花苜蓿幼苗12株,葉綠素含量測(cè)定自莖頂部數(shù)第2片葉,生理指標(biāo)測(cè)定自莖頂部數(shù)第2～4片葉(葉片取下后立即置于-80℃冰箱保存),試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

隨機(jī)選取不同處理下紫花苜蓿幼苗12株,株高(莖基部到主莖頂部距離)使用卷尺測(cè)量,莖粗(子葉下部)以游標(biāo)卡尺測(cè)量(直徑)。

1.3 相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、H2O2含量的測(cè)定

根據(jù)改良的Cen等[22]方法測(cè)量相對(duì)電導(dǎo)率(Relative electrical conductivity,REC),稱取0.2 g葉片置于裝有20 mL去離子水的玻璃管中,室溫靜置12 h,測(cè)量電導(dǎo)率E1后,100℃煮沸30 min,待溶液冷卻測(cè)量電導(dǎo)率E2。

REC=(E1/E2)×100%

丙二醛含量根據(jù)Zhang等[23]的方法采用硫代巴比妥酸法測(cè)定,分別測(cè)量在532,600,450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值;Zhang等人建議,在415 nm處用分光光度法測(cè)定紫花苜蓿葉片中H2O2濃度。

1.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定

蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量;茚三酮比色法測(cè)定脯氨酸含量;可溶性蛋白含量測(cè)定根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法[24]。

1.5 葉片相對(duì)葉綠素含量、相對(duì)含水量的測(cè)定

相對(duì)葉綠素含量使用便攜式葉綠素儀測(cè)定。葉片相對(duì)含水量(Relative water content,RWC)使用以下公式計(jì)算,稱取約0.1 g葉片記為鮮重,置于蒸餾水中浸泡24 h,至達(dá)到恒定重量,擦干葉片水分稱量飽和重,然后于80℃烘箱中干燥至恒重,記為干重。

1.6 抗氧化酶活性測(cè)定

取紫花苜蓿葉樣品0.5 g在液氮中研磨,加入預(yù)冷磷酸緩沖溶液(pH = 7.9)7.2 mL,在4℃下孵育15 min。孵育完成后將溶液在4℃下12 000 g·min-1離心15 min;上清液用于測(cè)定抗氧化酶活性。參考高俊鳳等的方法進(jìn)行超氧化物歧化酶(Superoxidase dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性的測(cè)定[24]。

1.7 總RNA提取及基因表達(dá)分析

稱取0.1 g冷凍葉片加入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末,總RNA提取根據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Plus Kit)進(jìn)行,使用超微量紫外分光光度計(jì)和0.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA純度及濃度,按照Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR將檢測(cè)合格RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。MsCu/Zn-SOD,MsPOD,MsCAT,MsAPX引物根據(jù)Niu等[25]的研究設(shè)計(jì)。qRT-PCR的反應(yīng)條件為:95℃,30 s,95℃,5 s,60℃,20 s,72℃,30 s,循環(huán)40次。內(nèi)參基因選擇紫花苜蓿肌動(dòng)蛋白基因Actin。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù),基因相對(duì)表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算,引物信息在表1列出。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 qRT-PCR analysis primers

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Office excel 2021對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,使用SPSS 25.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan(P<0.05)多重比較,采用Origin 2022軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿株高和莖粗的影響

如圖1所示,干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)受到抑制,尤其是對(duì)株高、莖粗影響較大。與對(duì)照CK相比,干旱脅迫(D,中度干旱,土壤相對(duì)含水量為40%～45%)處理組的幼苗株高、莖粗分別顯著降低了55%,34%(圖2)(P<0.05)。對(duì)褪黑素緩解干旱效應(yīng)的探究試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與不添加褪黑素的干旱D處理組相比,添加60,90和120 μmol·L-1褪黑素可顯著改善干旱脅迫的紫花苜蓿幼苗的生長(zhǎng)性狀(P<0.05)。與干旱脅迫(D,中度干旱,土壤相對(duì)含水量為40%～45%)相比,D90MT處理的苜蓿幼苗的株高和莖粗分別顯著增加了75%和41%,效果最顯著(P<0.05)。因此高濃度褪黑素對(duì)干旱脅迫下植物生長(zhǎng)的緩解作用較小。可見(jiàn)施加合適濃度的外源褪黑素能夠有效減輕干旱對(duì)植物造成的負(fù)面影響,其中90 μmol·L-1緩解效果最為明顯。

圖1 不同處理下紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth of alfalfa seedlings under different treatments注:CK,正常澆水處理;D,干旱脅迫處理;D30MT,干旱脅迫處理+30 μmol·L-1 MT; D60MT,干旱脅迫處理+60 μmol·L-1 MT;D90MT,干旱脅迫處理+90 μmol·L-1 MT;D120MT,干旱脅迫處理+120 μmol·L-1 MT;D150MT,干旱脅迫處理+150 μmol·L-1;MT,褪黑素,下同Note:CK,the well-watered treatment;D,the drought stress treatment;D30MT,the drought stress treatment+30 μmol·L-1 MT;D60MT,the drought stress treatment+60 μmol·L-1 MT;D90MT,the drought stress treatment+90 μmol·L-1 MT;D120MT,the drought stress treatment+120 μmol·L-1 MT;D150MT,the drought stress treatment+150 μmol·L-1 MT;MT,Melatonin. The same as below

圖2 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿株高和莖粗的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on the plant height and stem diameter of alfalfa seedlings under drought stress注:A,株高;B,莖粗。數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Note:Panel A:Plant height;Panel B:Stem diameter. Value columns with different lowercase letters mean a significant difference (P<0.05) between different treatments. The same as below

2.2 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿葉片膜透性的影響

植物由于長(zhǎng)期缺水造成細(xì)胞膜受損。如圖3所示,與CK相比,干旱處理造成紫花苜蓿幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率(REC)、MDA及H2O2含量顯著上升,分別增加了96%,194%和94%(P<0.05)。經(jīng)褪黑素預(yù)處理后植株減少了REC,MDA及H2O2的產(chǎn)生。與D處理相比,60,90,120 μmol·L-1MT均顯著降低了各指標(biāo)的水平(P<0.05),其中,D90MT處理降低REC、MDA效果更明顯,與D處理相比,分別減少了31%和49%,干旱與90 μmol·L-1褪黑素復(fù)合處理紫花苜蓿幼苗MDA含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。與D相比,120 μmol·L-1MT預(yù)處理紫花苜蓿幼苗經(jīng)受干旱后H2O2含量最低,顯著降低了41%(P<0.05)。

圖3 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿葉片膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物的影響Fig.3 Effects of exogenous melatonin on the products of membrane lipid peroxidation of leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,相對(duì)電導(dǎo)率;B,丙二醛含量;C,過(guò)氧化氫含量Note:Panel A,Relative electrolytic leakage;Panel B,Malondialdehyde content;Panel C,Hydrogen peroxide content

2.3 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

如圖4所示,與對(duì)照組CK相比,干旱脅迫下脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量分別顯著上升了194%,119%和67%(P<0.05);干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗施加褪黑素處理顯著降低了脯氨酸的水平,其中以D90MT,D120MT處理的Pro含量最低,分別減少了51%和53%(P<0.05)。中高濃度褪黑素對(duì)降低可溶性糖和可溶性蛋白含量有顯著作用,90 μmol·L-1MT處理紫花苜蓿幼苗可溶性糖含量最接近對(duì)照組,與D處理相比減少了46%(P<0.05)。低濃度(30 μmol·L-1)褪黑素對(duì)干旱脅迫下葉片可溶性蛋白含量影響不明顯,60,90,120,150 μmol·L-1MT相比于D處理分別減少了24%,25%,20%,15%。

圖4 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of exogenous melatonin on the content of osmotic regulatory substances of the leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,脯氨酸含量;B,可溶性糖含量:C,可溶性蛋白含量Note:Panel A,Proline content;Panel B,Soluble sugar content;Panel C,Soluble protein content

2.4 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿葉片RWC和相對(duì)葉綠素含量的影響

葉片水分狀態(tài)受相對(duì)含水量(RWC)影響。如圖5A所示,與CK相比,干旱脅迫下RWC減少了49%。60,90,120,150 μmol·L-1MT處理均可顯著提升葉片相對(duì)含水量(P<0.05),90 μmol·L-1MT是最有益的處理,它導(dǎo)致干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的RWC較D處理增加了89%,且與對(duì)照組無(wú)顯著差異。干旱導(dǎo)致葉片缺水、發(fā)黃枯落,相對(duì)葉綠素含量顯著降低(P<0.05)。通過(guò)添加外源褪黑素,顯著增加了干旱脅迫下相對(duì)葉綠素含量(P<0.05)。D90MT,D120MT處理顯著提高了葉片相對(duì)葉綠素含量,與D處理相比,分別增加了50%,29%(圖5B)(P<0.05)。

圖5 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿葉片RWC和相對(duì)葉綠素含量的影響Fig.5 Effects of exogenous melatonin on RWC and relative chlorophyll content of leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,相對(duì)含水量;B,相對(duì)葉綠素含量Note:Panel A,Relative water content;Panel B,Relative chlorophyll content

2.5 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性的影響

逆境導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS積累增加,破壞了原本的ROS產(chǎn)生與消除之間的平衡,植物為應(yīng)對(duì)這一變化,增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶(SOD,POD,CAT,APX)含量以清除ROS。如圖6所示,干旱脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)抗氧化酶含量顯著上升,與CK相比,D處理中SOD,POD,CAT,APX活性顯著增加了96%,109%,33%,23%(P<0.05),中高濃度褪黑素使抗氧化酶含量進(jìn)一步提升,低濃度褪黑素可以提高抗氧化酶活性。與干旱脅迫相比,干旱與褪黑素復(fù)合處理(D90MT,D120MT,D150MT)幼苗葉片SOD活性顯著增加了53%,45%,36%(圖6A);POD活性顯著增加了56%,44%,50%(圖6B);CAT活性顯著增加了46%,32%,32%(圖6C);APX活性顯著增加了31%,28%,31%(圖6D)(P<0.05)。

圖6 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of exogenous melatonin on antioxidant enzyme activities of leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,超氧化物歧化酶活性;B,過(guò)氧化物酶活性;C,過(guò)氧化氫酶活性;D,抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性Note:Panel A,Superoxide dismutase activity;Panel B,Peroxidase activity;Panel C,Catalase activity;Panel D,Ascorbate peroxidase activity

2.6 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化酶基因表達(dá)的影響

抗氧化酶合成基因在不同處理下呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),植物為了抵御和適應(yīng)干旱脅迫造成的傷害,啟動(dòng)干旱應(yīng)答機(jī)制,激活抗氧化酶基因的表達(dá)。如圖7所示,與對(duì)照組相比,干旱顯著促進(jìn)了編碼抗氧化酶基因的表達(dá)(P<0.05),褪黑素進(jìn)一步提高了其表達(dá),尤其是在90 μmol·L-1和120 μmol·L-1褪黑素處理時(shí)有最高表達(dá)。與干旱脅迫相比,120 μmol·L-1褪黑素處理紫花苜蓿幼苗MsCu/Zn-SOD表達(dá)上調(diào)25%(圖7A),MsCAT上調(diào)19%(圖7C),MsAPX上調(diào)36%(圖7D),90 μmol·L-1褪黑素處理紫花苜蓿幼苗MsPOD表達(dá)上調(diào)37%(圖7B)。

圖7 外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶合成基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of exogenous melatonin on gene expression of antioxidant enzymes in the leaves of alfalfa seedlings under drought stress注:A,MsCu/Zn-SOD表達(dá)水平;B,MsPOD表達(dá)水平;C,MsCAT表達(dá)水平;D,MsAPX表達(dá)水平Note:Panel A,MsCu/Zn-SOD expression level;Panel B,MsPOD expression level;Panel C,MsCAT expression level;Panel D,MsAPX expression level

3 討論

植物在應(yīng)對(duì)干旱脅迫環(huán)境時(shí),會(huì)發(fā)生一系列生理及形態(tài)的變化來(lái)維持自身的生存生長(zhǎng),如葉片卷曲、刺化,根系變長(zhǎng)和氣孔關(guān)閉[26]。有研究發(fā)現(xiàn)施加褪黑素、2,4-表油菜素內(nèi)酯、NO,IAA和獨(dú)腳金內(nèi)酯等外源添加劑,可以達(dá)到對(duì)逆境脅迫下紫花苜蓿的生長(zhǎng)和生理等方面的正向調(diào)控作用,有利于紫花苜蓿抵抗逆境脅迫[27-31]。本試驗(yàn)中,干旱處理下紫花苜蓿幼苗植株矮小,葉片萎蔫、枯黃(圖1),葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量顯著下降,干旱處理組紫花苜蓿幼苗株高、莖粗顯著低于CK,而根灌外源褪黑素可以顯著提高株高莖粗(圖2),葉片相對(duì)含水量上升且與對(duì)照組無(wú)顯著差異,葉綠素含量在褪黑素緩解下含量顯著提高(P<0.05)。這與He等[32]在2022的研究結(jié)論外源褪黑素能夠增加干旱脅迫下甜菜(BetavulgarisL.)地上、地下部分鮮重干重及株高的結(jié)果一致,即添加適宜濃度的褪黑素能夠有效改善干旱導(dǎo)致的植物生長(zhǎng)受阻,促進(jìn)植株吸水和葉綠素合成。李榮等[33]的研究也證明外源褪黑素增加了鹽脅迫下黃瓜(CucumissativusL.)幼苗的株高和莖粗。

干旱等非生物脅迫造成植物滲透失衡,抑制植物吸水,植物通過(guò)自身滲透調(diào)節(jié),即增加滲透脅迫物質(zhì)含量,降低滲透勢(shì)以維持細(xì)胞膨壓和保水。可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸在干旱脅迫下是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究中,干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量顯著上升,以抵御滲透失衡,添加外源褪黑素后,其含量逐漸降低,但顯著高于對(duì)照組,這是因?yàn)橥屎谒卦谠鰪?qiáng)植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的同時(shí),提高了植物葉片相對(duì)含水量,緩解滲透脅迫,增強(qiáng)幼苗抗旱性。前人的研究中也有類似的報(bào)道,這與Ahmad等[34]研究得出外源褪黑素可顯著降低鹽脅迫下玉米(ZeamaysL.)葉片脯氨酸、可溶性糖含量的結(jié)果一致。根灌外源褪黑素對(duì)干旱脅迫下紫花苜蓿的影響大多集中于對(duì)葉片的研究,根系是感知水分最敏感的器官,對(duì)根系進(jìn)行生理分子方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道有待進(jìn)一步研究。

持續(xù)干旱脅迫造成細(xì)胞ROS的產(chǎn)生和消除不平衡,導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,對(duì)植物造成氧化損傷[35]。褪黑素誘導(dǎo)抗氧化酶活性,有助于維持ROS的平衡[36]。在干旱脅迫下,褪黑素處理的紫花苜蓿中抗氧化酶SOD,POD,CAT和APX的活性較高,中高濃度MT的作用效果更明顯(圖6)。對(duì)茶樹(shù)(CamelliasinensisL.)[37]和甜高粱(Sorghumbicolor)幼苗[38]的研究表明,MT通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性,從而提高了對(duì)干旱脅迫的抵抗力。干旱導(dǎo)致植株葉片細(xì)胞膜過(guò)氧化,膜透性增大,電解質(zhì)和小分子物質(zhì)外滲造成電導(dǎo)率升高,MDA作為膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物,其含量能夠反應(yīng)膜受損傷程度[39]。本研究發(fā)現(xiàn)干旱處理導(dǎo)致紫花苜蓿幼苗葉片H2O2、相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量增加;MT復(fù)合處理降低了H2O2,REC,MDA的含量(圖3),有效抑制了干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片中ROS的增加。本研究結(jié)果與褪黑素對(duì)獼猴桃(Actinidiachinensis)[40]和玉米[34]的影響相似。這表明MT誘導(dǎo)紫花苜蓿葉片中抗氧化酶活性的增加,以去除過(guò)量的ROS并保護(hù)植物免受氧化應(yīng)激。此外,我們的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)褪黑素增加了干旱脅迫下MsCu/Zn-SOD,MsPOD,MsCAT和MsAPX基因的表達(dá)量,這與Niu等[25]的研究結(jié)果一致,褪黑素抑制了因NaCl脅迫引起的細(xì)胞膜缺陷、脂質(zhì)過(guò)氧化和活性氧(ROS)積累,MT上調(diào)抗氧化酶的基因表達(dá)和活性,以清除NaCl處理植物中過(guò)量的ROS。

4 結(jié)論

綜上所述,干旱阻礙紫花苜蓿正常生長(zhǎng),植物為抵御干旱損傷啟動(dòng)自身防御機(jī)制,使抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加;外源褪黑素通過(guò)提高植物的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力緩解由干旱引起的損傷,添加不同濃度(30,60,90,120,150 μmol·L-1)的褪黑素具有不同的緩解程度,其中90 μmol·L-1褪黑素溶液處理最佳,并可使丙二醛含量、可溶性糖含量、相對(duì)含水量緩解到對(duì)照水平,對(duì)植物生長(zhǎng)生理及抗氧化酶基因表達(dá)等各方面具有明顯作用,顯著提高植物的抗旱性。田間生產(chǎn)應(yīng)用時(shí),在遇到水分脅迫的年際,可以通過(guò)根灌90 μmol·L-1褪黑素緩解牧草等植物的干旱生理脅迫,本研究對(duì)了解褪黑素對(duì)紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制和田間應(yīng)用具有一定理論意義。