非釀酒酵母與釀酒酵母在米酒混菌發(fā)酵中的相互作用機制分析

李柔,劉源,宋開闊,徐巖,王棟*

1(釀造微生物學與應用酶學研究室,江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 3(海天醋業(yè)集團有限公司,江蘇 宿遷,223600)

米酒在我國具有悠久的歷史,其生產(chǎn)和消費相當廣泛。我國傳統(tǒng)米酒釀造具有多菌種混合發(fā)酵的特點,有研究表明在米酒釀造過程中存在著豐富的酵母菌[1]。根據(jù)酵母在釀造中的功能,可分為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非釀酒酵母(non-Saccharomycesyeasts,NSY)。釀酒酵母具有發(fā)酵效率高、耐受酒精濃度高的特點,通常是酒類發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌[2]。一般非釀酒酵母的發(fā)酵效率較低,產(chǎn)酒精能力弱[3],通常無法用于酒類產(chǎn)品的純種發(fā)酵。但非釀酒酵母通過一系列的復雜生化反應可以產(chǎn)生大量的酶、甘油、酯類和其他代謝物,改善酒體的口感和香氣,賦予酒體地域特色[4]。近年來,很多研究開始將釀酒酵母與非釀酒酵母進行混合發(fā)酵,對二者進行“取長補短”,旨為保證發(fā)酵效率的同時,又能改善產(chǎn)品品質[5-6]。其中在葡萄酒釀造領域應用較多[7]。

在酵母混菌發(fā)酵過程中,非釀酒酵母通常主要存在于發(fā)酵的早期階段,隨著發(fā)酵的進行,非釀酒酵母會在短時間內(nèi)被釀酒酵母取代[8],說明非釀酒酵母雖然可以與釀酒酵母共同參與酒精發(fā)酵,但其生長會受到抑制,有報道乙醇[9]、中長鏈脂肪酸[10]等釀酒酵母代謝物的影響較大。此外,不同酵母間還存在較為復雜的相互作用。在酵母混合釀造葡萄酒中,葡萄有孢漢生酵母(Hanseniasporauvarum)、美極梅氏酵母(Metschnikowiapulcherrima)等非釀酒酵母會與釀酒酵母競爭營養(yǎng)物質,導致發(fā)酵遲緩甚至停止[11];某些酵母甚至還會產(chǎn)生致死毒素抑制其他酵母生長[12]。近年來,細胞間接觸被認為能夠降低酵母,尤其是非釀酒酵母[13]的活力。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母能促使釀酒酵母的糖代謝相關基因過量表達,有利于釀酒酵母的生長代謝[14]。綜上所述,不同酵母間相互作用機理復雜,影響因素較多。同時,不同酵母菌株間的差異也較大。研究不同酵母間的相互作用及其機制對于釀造行業(yè)及相關領域具有較重要的理論和應用價值。

我國傳統(tǒng)米酒釀造中也存在這樣的問題,酒藥和開放的釀造過程會帶入豐富的非釀酒酵母,如扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、假絲酵母(Candida)、畢赤酵母(Pichia)等[1]。隨著發(fā)酵的進行,這些非釀酒酵母逐漸被釀酒酵母所取代[15],釀酒酵母作為酒精發(fā)酵的主導菌大量存在,但是相關的作用機制尚不清楚。隨著米酒純種釀造等新工藝的開發(fā),非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵對于米酒風味和品質的提升也受到了重視[16],對不同酵母間相互作用機制的認識也提出了新的要求,加深對這一問題的理解可以更好地指導我們選育和利用非釀酒酵母,設計發(fā)酵策略,優(yōu)化發(fā)酵過程,更大限度地利用微生物特性提高米酒品質。

本研究以2株與米酒釀造相關的常見非釀酒酵母為研究對象,采用同時接種和順序接種2種方式與釀酒酵母進行米酒混菌發(fā)酵,通過對發(fā)酵過程理化參數(shù)、生物量變化的監(jiān)測,分析酵母間的相互影響及其相關因素,并對釀酒酵母發(fā)酵代謝物、營養(yǎng)物質競爭、細胞-細胞接觸等因素的影響進行了探究,旨在對不同酵母間相互作用機制有更多的認識,為更加合理地調(diào)控微生物代謝,實現(xiàn)米酒釀造新工藝的優(yōu)化,釀造優(yōu)質米酒提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

本研究用于米酒釀造的釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeLBM-2901,Sc),保藏于江南大學釀造微生物學與應用酶學研究室。假絲酵母(CandidaglabrataLBM-202,Ca)為從傳統(tǒng)米酒發(fā)酵醪中分離而來,扣囊復膜酵母(SaccharomycopsisfibuligeraLBM-201,Sf)為從米酒酒藥中分離得到。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,瓊脂20,蒸餾水100 mL,115 ℃滅菌30 min;YPD液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,蒸餾水100 mL,115 ℃滅菌30 min。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、無水乙醇、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、3,5-二硝基水楊酸、甲醇,上海國藥集團;放線菌酮,青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司;酵母粉、蛋白胨,美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司;酶標儀,美國Bio-Tek公司;Milli-Q純水儀,美國Millipore公司;臺式高速離心機,德國Eppendorf公司;恒溫培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器公司;電子天平,瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 米酒發(fā)酵

為便于研究,本研究采用液態(tài)發(fā)酵的方式進行米酒發(fā)酵,具體操作參照鄒凌波[17]的方法,主要過程包括大米浸泡、蒸飯后加入α-淀粉酶液化、糖化酶糖化,制得的糖化米汁還原糖含量為200 g/L左右,115 ℃滅菌30 min備用。米酒發(fā)酵分別采用酵母純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵的方式進行。先將酵母活化,取保藏菌株接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)48 h,使得培養(yǎng)基中細胞數(shù)達到108CFU/mL,備用。

純種發(fā)酵:將活化后的釀酒酵母(Sc)、非釀酒酵母(Ca或Sf)分別接種于100 mL糖化米汁中,酵母接種量均為106CFU/mL,于帶發(fā)酵栓的錐形瓶中30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。每天定時取樣,檢測CO2失重、生物量等;發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心5 min取上清液,測定發(fā)酵液還原糖和酒精含量。失重小于0.2 g即為發(fā)酵結束。

混菌發(fā)酵:混菌發(fā)酵采用兩種方式,即同時接種發(fā)酵和順序接種發(fā)酵。同時接種發(fā)酵:活化后的釀酒酵母Sc分別與非釀酒酵母Ca或Sf同時接種于糖化米汁中進行發(fā)酵(分別記為Si-SC+CA,Si-SC+SF);順序接種發(fā)酵:活化后的非釀酒酵母Ca或Sf先接種于糖化米汁中,發(fā)酵3 d后,再接種釀酒酵母Sc(分別記為Se-SC+CA,Se-SC+SF)。酵母菌的接種量均為106CFU/mL,培養(yǎng)條件、理化指標及生物量測定方法同純種發(fā)酵。

樣品均設置3個平行。

1.3.2 酵母生物量測定

PD-L1在多種腫瘤中存在高表達。PD-L1通過與活化T細胞上表達的受體 PD-1相互作用，傳遞抑制信號導致T細胞失去活性[34]。相關的臨床研究已在進行中，PD-L1抑制劑阿維單抗和度伐魯單抗等單克隆抗體正在進行不同實體瘤的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗[35]，覆蓋了非小細胞肺癌、黑色素瘤和膀胱癌等多個瘤種，尚未見心臟毒性的報道。阿維單抗作為一、二線治療尿路上皮癌的常見3～4級免疫介導性不良反應有肺炎、皮疹和呼吸困難[36-37]。Barata等[38]完成1項回顧性單中心研究發(fā)現(xiàn)，79例患者使用阿特珠單抗治療后，尚未出現(xiàn)心臟相關不良反應。

酵母生物量的測定采用平板計數(shù)法[18]。在純種發(fā)酵條件下,直接在YPD平板上進行酵母計數(shù)。

在混菌發(fā)酵培養(yǎng)條件下,首先利用YPD平板進行總酵母數(shù)的計數(shù)。適量濃度的放線菌酮(cycloheximide)能夠抑制釀酒酵母的生長,而不影響非釀酒酵母的菌落形成[19],所以利用添加400 mg/L放線菌酮的YPD平板可進行非釀酒酵母的計數(shù)?？偨湍笖?shù)減去非釀酒酵母數(shù)即為釀酒酵母數(shù)。

1.3.3 還原糖和酒精測定

發(fā)酵液還原糖含量采用DNS法測定[20]。

酒精含量采用高效液相色譜法進行測定[21]。樣品經(jīng)10%三氯乙酸沉淀后靜置1 h,取上清液用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾,濾液供液相進樣。高效液相色譜儀色譜柱為Aminex HPX-87H(150 mm×4.6 mm,Bio-Rad),視差折光檢測器(RID)為Waters 2414,流動相為5 mmol/L稀硫酸,流速0.6 mL/min,進樣量10 μL。

1.3.4 釀酒酵母發(fā)酵代謝物對非釀酒酵母的影響

釀酒酵母發(fā)酵代謝物的制備:分別取釀酒酵母Sc純種發(fā)酵2 d和6 d的米酒發(fā)酵液靜置10 min,取發(fā)酵清液于6 000 r/min無菌離心10 min,取上清液在超凈臺中過0.22 μm無菌濾膜,得到無細胞的發(fā)酵上清液作為釀酒酵母Sc發(fā)酵代謝物溶液,貯存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.5 酵母的非接觸發(fā)酵

根據(jù)HU等[22]設計的一種模型,設計透析袋分室發(fā)酵實驗,以達到分隔酵母菌株發(fā)酵的目的,同時維持發(fā)酵體系成分均一。取10 kDa截留分子質量的透析袋,經(jīng)過滅菌后,在無菌條件下加入適量糖化米汁,置于裝有等量糖化米汁的錐形瓶內(nèi)。將非釀酒酵母接種于透析袋內(nèi),Sc接種于透析袋外;為驗證透析袋對于物質交換的影響,作為對照,將非釀酒酵母接種于透析袋外,Sc接種于透析袋內(nèi)。接種量均為106CFU/mL,錐形瓶加發(fā)酵栓封口進行發(fā)酵。處理樣品設置3個平行,30 ℃、低速振蕩發(fā)酵,每隔一天測定透析袋內(nèi)外的生物量、乙醇、還原糖含量,連續(xù)測定7 d。

2 結果與分析

2.1 不同酵母純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵過程變化

首先對兩種非釀酒酵母Sf和Ca進行米酒純種發(fā)酵及與釀酒酵母Sc混菌發(fā)酵,同時以Sc純種發(fā)酵作為對照,發(fā)酵過程中葡萄糖和酒精的含量變化如圖1、圖2所示。在純種發(fā)酵過程中,2株非釀酒酵母都表現(xiàn)出一定的酒精發(fā)酵能力,但是利用還原糖和產(chǎn)酒精速度都低于釀酒酵母Sc。Sc純培養(yǎng)在發(fā)酵第10天能達到9.52%的酒精度,而Sf在第14天結束發(fā)酵時僅能達到8.91%酒精度,是3株酵母中產(chǎn)酒精量最低、剩余還原糖含量最高的菌株。相較于Sf,Ca利用還原糖、產(chǎn)酒精能力更強,發(fā)酵能力較接近于Sc(圖2)。這一結果同已有的報道一致[23],表明非釀酒酵母在米酒發(fā)酵過程中存在劣勢,即發(fā)酵效率低,發(fā)酵周期長。當然,不同的非釀酒酵母發(fā)酵能力也存在差異。在2株非釀酒酵母與Sc混合發(fā)酵中,同時接種發(fā)酵能夠提高發(fā)酵效率,發(fā)酵第6天時還原糖均基本消耗完全,酒精度分別為9.46%(Si-SC+CA)和9.94%(Si-SC+SF)。但是在順序接種發(fā)酵中,2株非釀酒酵母與Sc組合發(fā)酵表現(xiàn)出不同的結果。由于釀酒酵母Sc具有較強的發(fā)酵能力,Sc的加入使得與Sf的混菌發(fā)酵效率明顯提高(圖1),但其發(fā)酵效率低于Sc純種發(fā)酵。但是Ca與Sc的順序接種發(fā)酵效率卻低于Ca的純種發(fā)酵(圖2),表明Sc的加入降低了Ca的發(fā)酵效率。

a-還原糖;b-酒精含量圖1 Sf純種發(fā)酵及與Sc混菌發(fā)酵過程中還原糖和 酒精含量變化Fig.1 Sugar consumption and ethanol content profiles of pure and mixed fermentations of Sf and Sc注:SF:Sf純種發(fā)酵;SC:Sc純種發(fā)酵;Si-SC+SF: Sc與Sf同時接種發(fā)酵;Se-SC+SF:Sc與Sf順序接種發(fā)酵。

a-還原糖;b-酒精含量圖2 Ca純種發(fā)酵及與Sc混合發(fā)酵過程中變化Fig.2 Sugar consumption and ethanol content profiles of pure and mixed fermentation of Ca and Sc注:CA:Ca純種發(fā)酵;SC:Sc純種發(fā)酵;Si-SC+CA:Sc與Ca 同時接種發(fā)酵;Se-SC+CA:Sc與Ca順序接種發(fā)酵。

以上結果表明,非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵時,不同的接種方式對米酒發(fā)酵過程的影響是不同的,可能存在較為復雜的機制。同時接種發(fā)酵對于發(fā)酵效率的提升可能是由于不同酵母間的協(xié)同作用,但在順序接種發(fā)酵中,不同的非釀酒酵母受到釀酒酵母的影響存在差異,Ca與Sc的混合可能抑制了它們的混合發(fā)酵。

2.2 純種和混菌發(fā)酵中不同酵母生物量的變化

進一步對2種混菌發(fā)酵過程中不同酵母生物量的變化進行了考察,并與各自酵母純種發(fā)酵過程中的生物量變化進行比較,結果如圖3所示。在純種發(fā)酵過程中,2株非釀酒酵母與釀酒酵母的生物量變化相似,均在發(fā)酵第2天生物量到達最高,發(fā)酵過程中基本維持在較高濃度(107～108CFU/mL)。在混菌發(fā)酵過程中,無論是哪種混菌發(fā)酵方式,Sc的生物量變化與其純種發(fā)酵過程類似,沒有受到明顯影響;對于非釀酒酵母,在發(fā)酵初期(釀酒酵母數(shù)量較低時),Ca和Sf的生物量變化也沒有受到顯著影響,但是當Sc生物量達到約107CFU/mL后,2株非釀酒酵母在2種混菌發(fā)酵中的生物量都會迅速下降,之后Sc成為發(fā)酵中的優(yōu)勢菌株。這種現(xiàn)象在一些同時接種發(fā)酵研究中也有報道[5]。研究結果表明,在混菌發(fā)酵過程中,無論哪種非釀酒酵母,較高濃度Sc的抑制作用都是明顯存在的,而非釀酒酵母對釀酒酵母的影響則非常有限。因此,由于非釀酒酵母受到了顯著的抑制,混菌發(fā)酵過程主要是由Sc主導發(fā)酵進程,特別是在中后期。雖然同時接種發(fā)酵相比于純種發(fā)酵提高了發(fā)酵效率,可能與發(fā)酵初期2種酵母尚未明顯相互影響,從而具有一定的協(xié)同作用有關,但是較高濃度的釀酒酵母對于非釀酒酵母的抑制仍然是明顯的,而釀酒酵母抑制非釀酒酵母的主要影響因素仍值得進一步研究。

a-Sf純種及與Sc混菌發(fā)酵;b-Ca純種及與Sc混菌發(fā)酵圖3 純種和混菌發(fā)酵中酵母生物量變化Fig.3 Changes of different yeast biomass in pure and mixed fermentations

2.3 釀酒酵母發(fā)酵代謝物以及營養(yǎng)物質對非釀酒酵母的影響

一般認為非釀酒酵母對于酒精的耐受性較弱[24],營養(yǎng)物質缺乏以及釀酒酵母代謝產(chǎn)物也會影響非釀酒酵母的生長[25],這些都可能是在混菌發(fā)酵中非釀酒酵母受抑制的原因。為了進一步明確這些因素對于非釀酒酵母的影響,將釀酒酵母Sc發(fā)酵米酒過程中不同發(fā)酵時間(2、6 d)發(fā)酵液經(jīng)過處理,制備釀酒酵母發(fā)酵代謝物溶液作為培養(yǎng)基,分別接入2株非釀酒酵母,探究Sc發(fā)酵代謝物對于非釀酒酵母生長的影響。同時,也添加酒精或葡萄糖,考察酒精或營養(yǎng)物質對于非釀酒酵母生長的影響。結果如圖4 所示。

由圖4可知,與純種發(fā)酵相比,非釀酒酵母Sf和Ca在釀酒酵母發(fā)酵代謝物溶液中發(fā)酵的生物量均有不同程度的降低,但仍維持在相對穩(wěn)定的水平,并未出現(xiàn)生物量的快速下降。說明釀酒酵母Sc發(fā)酵代謝物對于非釀酒酵母的生長存在一定程度的抑制,但是并不是在混菌發(fā)酵中抑制非釀酒酵母生長的主要因素。葡萄糖的添加對于2種非釀酒酵母基本沒有影響。對于Sf,較高濃度的酒精在發(fā)酵前期對其生長有一定的限制(圖4-a),但是也未使其在發(fā)酵過程中生物量快速下降。

a-Sf生物量變化;b-Ca生物量變化圖4 非釀酒酵母在釀酒酵母米酒發(fā)酵代謝物溶液中的生長情況Fig.4 The growth of non-saccharomyces yeasts in the metabolite solution of Sc from the fermentation of Mijiu

實際上在順序接種發(fā)酵中,Sc接種1 d后,2株非釀酒酵母的生物量均降低了一個數(shù)量級(圖3),此時酒精度約為3%(圖1、圖2)。而在純種發(fā)酵過程中,即使酒精度超過8%,2株非釀酒酵母的生物量也未出現(xiàn)迅速下降。這些都說明在混菌發(fā)酵過程中,引起酵母生物量迅速下降的主要原因可能并不是酒精的毒害作用,雖然一定濃度的酒精對Sf的生長有一定的影響。從純培養(yǎng)中也可以發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后期培養(yǎng)體系中碳源匱乏,而Sf、Ca的生物量基本可以穩(wěn)定在較高水平,說明營養(yǎng)物質限制也不是非釀酒酵母生物量快速降低的原因。

2.4 細胞非接觸發(fā)酵對非釀酒酵母的影響

本研究利用透析袋將不同酵母細胞隔離開來,采用非釀酒酵母與Sc非接觸發(fā)酵,進一步考察細胞-細胞接觸對非釀酒酵母的影響。為排除透析袋對于酵母生長的影響,將非釀酒酵母分別接種于透析袋內(nèi)、外進行對比實驗,結果如圖5、圖6所示。由圖5、圖6可以看出,非釀酒酵母在透析袋內(nèi)外的位置不同,對于與Sc非接觸發(fā)酵過程中還原糖、酒精含量以及生物量的變化趨勢無明顯影響,說明透析袋除了分隔不同酵母,并未明顯影響發(fā)酵體系的物質交換和均一性。從酵母生物量的變化來看,2株非釀酒酵母Sf和Ca無論是在透析袋內(nèi)、外,酵母的生長情況與純種發(fā)酵時基本類似,生物量可以穩(wěn)定在107～108CFU/mL,沒有出現(xiàn)混菌發(fā)酵中生物量快速降低的現(xiàn)象(圖3)。

a-Sc接種于透析袋外;b-Sc接種于透析袋內(nèi)圖5 Sf與Sc非細胞接觸發(fā)酵過程的主要參數(shù)變化Fig.5 Biomass, sugar and ethanol concentration changes during the fermentations of Sf and Sc without cell-cell contact

a-Sc接種于透析袋外;b-Sc接種于透析袋內(nèi)圖6 Ca與Sc非細胞接觸發(fā)酵過程的主要參數(shù)變化Fig.6 Biomass, sugar and ethanol concentration changes during the fermentations of Ca and Sc without cell-cell contact

這一結果表明,非釀酒酵母在混菌發(fā)酵中生物量下降的主要原因應該不是酵母的代謝產(chǎn)物,而非釀酒酵母與釀酒酵母的細胞-細胞接觸可能是主要原因。

3 結論

利用2種非釀酒酵母(Sf、Ca)分別與釀酒酵母Sc進行米酒混菌發(fā)酵,采用不同的混菌發(fā)酵方式(同時接種、順序接種),可以得到不同的發(fā)酵表現(xiàn)。雖然2株非釀酒酵母表現(xiàn)出不同的發(fā)酵能力,但是無論采用何種發(fā)酵方式,都受到釀酒酵母Sc的影響。當Sc生物量達到107CFU/mL的較高水平時,Sf、Ca生物量出現(xiàn)快速下降,生長受到明顯抑制;相反,Sc的生長并未受到明顯的影響。利用Sc米酒發(fā)酵液為培養(yǎng)體系,考察釀酒酵母發(fā)酵代謝物及酒精和還原糖含量對非釀酒酵母的影響,結果表明釀酒酵母發(fā)酵代謝物在一定程度上會影響非釀酒酵母的生長活力,較高濃度的酒精也會對Sf的生長產(chǎn)生一定的影響,但這些因素都不會引起混菌發(fā)酵中非釀酒酵母生物量的快速下降。采用透析袋分隔發(fā)酵的方式對非釀酒酵母和釀酒酵母進行細胞非接觸發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)Sc與非釀酒酵母的生長都未受到明顯影響,結果表明非釀酒酵母和釀酒酵母細胞-細胞接觸是非釀酒酵母在混合發(fā)酵過程中受到抑制,生物量快速下降的主要原因。綜上所述,在米酒混菌發(fā)酵中,釀酒酵母對非釀酒酵母的生長有明顯的抑制作用,這種作用機理較為復雜,主要是通過高濃度的Sc活細胞接觸來實現(xiàn)的。非釀酒酵母對Sc的影響卻較為有限。相關作用機制仍需要進一步深入研究。本研究結果為釀酒酵母與非釀酒酵母間的相互作用研究提供了一些參考,加深了對于傳統(tǒng)米酒發(fā)酵過程中酵母變化的認識,對于米酒釀造新工藝及其釀造策略優(yōu)化也具有一定的借鑒作用。