基于超高效液相色譜三重四極桿質譜法同時檢測佛手中香豆素類化合物含量

周胡懌,趙希娟,2,3,4*,焦必寧,2,3*

1(中國農業科學院/西南大學柑桔研究所,重慶,400712) 2(農業農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室,重慶,400712) 3(農業農村部柑桔及苗木質量監督檢驗測試中心,重慶,400712)4(西南大學 園藝園林學院,重慶,400715)

佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle)屬于蕓香科柑橘屬,是香櫞(CitrusmedicaL.)的變種,頂端較底部稍寬,有手指狀裂瓣,果肉為淺黃色或淺黃白色,外果皮為橙黃色或黃綠色[1]。作為藥食兩用的柑橘類水果,目前對佛手已有大量的研究,但并不全面。據報道,佛手具有抗氧化[2]、抗衰老[3]、抗炎[4]、抗菌[5]、降血糖[6]、免疫抑制[7]等活性,這些生物活性與佛手中的香豆素、類黃酮等豐富的生物活性物質密切相關。香豆素是佛手中主要的生物活性成分,迄今為止已在佛手中發現50余種香豆素類化合物。其次是類黃酮,在佛手柑中發現40種左右的類黃酮化合物[3,8-18]。

目前需要一種高效的分析方法,充分定性并定量佛手中的香豆素類化合物。對于植物或其他復雜樣品中的目標化合物的篩選和定量,超高效液相色譜三重四極桿質譜法(ultra-performance liquid chromatography tandem triple quaternary mass spectrometry,UPLC-QqQ-MS/M)的多反應檢測模式(multiple reaction monitoring,MRM)可以避免峰重疊引起的干擾,并且靈敏度更高,檢測時間更短。因此,本實驗建立了一種新的UPLC-QqQ-MS/MS方法,用于快速靶向篩查和定量分析佛手中的香豆素。這是目前定量和定性佛手中香豆素類化合物最快速全面的方法。為了評估該方法是否可用于實際樣品檢測,通過標準曲線、靈敏度、準確度和精密度對其進行了驗證。香豆素的靶向篩查與定向分析為佛手作為藥材或者食品提供了理論依據,并為后續研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗的41種香豆素標準品包括16種簡單香豆素、23種呋喃香豆素和2種其他香豆素,購自不同公司。異橙皮內酯(≥98%)、橙皮內酯(≥98%)、蛇床子素(≥98%)、異茴芹內酯(≥98%)、異歐前胡素(≥99%)、歐前胡素(≥99%)、水合氧化前胡素(≥98%)、氧化前胡素(≥98%)、異紫花前胡內酯(≥98%)、花椒毒醇(≥98%)、白當歸素(≥98%)、珊瑚菜素(≥98%)、8-氧甲基異歐前胡內酯(≥98%),上海源葉生物技術有限公司;茵芋苷(≥98%)、7-甲氧基香豆素(≥98%)、七葉內酯(≥98%)、異嗪皮啶(≥98%)、秦皮素(≥98%)、4-甲基傘形酮(≥98%)、香豆素(≥98%)、白當歸腦(≥98%)、8-羥基佛手苷內酯(≥98%)、獨活素(≥98%)、5,7-二羥基-4-甲基香豆素(≥98%)、異補骨脂素(≥98%)、蟛蜞菊內脂(≥98%)、4-羥基香豆精(≥98%)、5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素(≥99.9%)、濱蒿內酯(≥95.0%)、8-(牻)牛兒醇基補骨脂素(≥98.5%)、香檸檬亭(≥96.9%)、補骨脂素(≥99.1%),成都克洛瑪生物科技有限公司;檸檬內酯(≥98.2%)、香柑醇(≥98%)、花椒毒素(≥98%)、佛手柑內酯(≥98%),北京金諦澤浩科技有限公司;橙皮油內酯(≥98.5%)、橙皮內酯水合物(≥99.0%)、6′,7′-環氧香檸檬亭(≥95.1%)、6′,7′-二羥基香檸檬亭 (≥97.8%),美國Sigma-Aldrich公司;傘形花內酯(≥99.0%),德國Dr.Ehrenster GmbH公司。用甲醇制備各標準品的儲備溶液,質量濃度為100 mg/L,存于-80 ℃。

乙腈和甲醇均為色譜純,上海星可高純溶劑有限公司;甲酸為色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司;超純水由Milli-Q Advantage A10超純水器(美國Millpore公司)產生。

1.2 儀器與設備

Shimadzu LC-30AD液相色譜儀,日本島津公司;SCIEX QTRAP 6500串聯質譜儀,美國AB公司;Acquity UPLC HSS T3色譜柱,美國Waters公司;Sigma3-15K高速冷凍離心機,德國Sigma公司;0.22 μm有機相針式過濾器,上海安譜科學儀器有限公司;KQ5200DE超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司;PB3002-S /FACT分析天平,瑞士Mettler Toledo;Milli-Q Advantage A10超純水機,美國Millipore公司等。

1.3 樣品制備及提取

在中國浙江省、云南省、廣東省和重慶市采摘佛手果實樣品,每個產地至少20個,均處于商業成熟期。采摘后的佛手果實用超純水清洗擦干,制成均勻鮮樣在-20 ℃貯存備用。

將5.0 g均制鮮樣置于離心管中,加入12.5 mL甲醇,超聲提取30 min,8 000 r/min離心5 min,將上清液收集到50 mL離心管中。重復1次上述步驟,合并2次提取液,將提取液用0.22 μm有機相針式濾器過濾到進樣小瓶后上機檢測。

1.4 UPLC-QqQ-MS/MS條件

本研究使用Shimadzu LC-30AD液相色譜儀,ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),柱溫40 ℃,進樣量1.0 μL,流速0.3 mL/min,樣品室溫度15 ℃。流動相為乙腈(B)和含有0.1%(體積分數,下同)甲酸的純水(A),梯度洗脫程序:0～3 min:10%B～30%B;3～6.5 min,30%B～65%B;6.5～7.5 min,65% B～70% B;7.5～9.5 min,70%B～95%B;9.5～11 min,95%B～95%B;11～11.1 min,95%B～10%B;11.1～14 min,10%B～10%B。在梯度洗脫程序的最后3 min(11～14 min),平衡并洗滌色譜柱。

質譜為SCIEX QTrap?6500+ MS/MS系統,采用電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),正負電離模式。部分化合物的離子種類、前體離子、產物離子、去簇電壓(declustering potential,DP)、碰撞能量(collision energy,CE)等詳細質譜參數見表1,其他MRM參數和離子源條件參照GUO等[26]的方法。

1.5 方法學驗證

通過線性評估、靈敏度、精密度和準確度對定量方法進行評估。使用0.05、0.10、0.25、0.5、1、2.5、5、10、12.5、25.00、50.00、100.00 μg/L系列混合稀釋標準溶液進行線性評估。檢測限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分別為信噪比(S/N)≥3和≥10時對應物質的濃度,用于評估該方法的靈敏度。方法精密度通過日內差和日間差來評估,日內差是同一天對同一標準溶液檢測3次結果的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),日間差是連續3 d對同一標準溶液的檢測結果的RSD。準確度則通過回收率實驗進行評估,即向樣品中添加適當濃度的標準溶液,計算添加前后的提取液濃度差值與實際添加濃度的比值得到添加回收率。

表1 部分化合物MRM參數列表Table 1 Partial compounds and their MRM parameters

1.6 數據分析

在Analyst?(SCIEX)軟件上進行LC-MS/MS檢測和數據收集,使用MultiQuant?(SCIEX)軟件進行定量分析。使用使用Excel 2019、Origin 2018c和SPSS R26進行統計分析和繪圖。每種樣品均重復檢測3次,數據結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 質譜方法優化

每種化合物通過針泵進樣,進入手動調諧模式進行優化其MRM參數。首先通過一級質譜掃描確定前體離子,通過碎離子掃描確定產物離子信息,進一步調整優化每個離子對的DP和CE。優化結果如表1所示,每種化合物由2個離子對,其中前體離子和產物離子1是定量離子對,前體離子和產物離子2是輔助定性離子對。實驗結果表明,大多數香豆素類化合物在正離子模式下顯示出更高的響應值,只有七葉內酯、秦皮素和蟛蜞菊內脂在負離子模式下顯示出更高的響應值。由于使用了MRM模式,確保了實驗的高效性和準確性,能夠準確定量保留時間相同的化合物。

2.2 液相方法優化

通過優化液相參數,包括色譜柱、流動相和洗脫梯度等條件,實現了41種香豆素類化合物的良好分離。優化過程中使用的標準溶液質量濃度為50.00 μg/L,Acquity HSS T3色譜柱能保留極性更大的化合物,提供穩定的保留時間。選擇乙腈作為流動相B,比甲醇洗脫效率更高,對色譜柱的壓力更低。優化流動相B結果如圖1所示所示,嘗試通過向乙腈中添加0.1%甲酸來減弱拖尾,但噪音更大且響應值更低,最終選擇純乙腈作為流動相B。為了提高香豆素類化合物的分離效果和響應值,流動相A有3種優化方案,包括含0.1%甲酸、0.2%甲酸和0.5%甲酸的純水。3種流動相A的正負離子流圖如圖1所示,含0.1%甲酸比含0.2%甲酸的水峰形更好,且比含0.5%甲酸的水對正負離子的電離效果更好,故選擇含0.1%甲酸的純水作為流動相A。優化了洗脫梯度以確?；衔镌谳^短時間內正常分離,包括8組同分異構體:歐前胡素與異歐前胡素、8-(牻)牛兒醇基補骨脂素和佛手柑素、補骨脂素和異補骨脂素、花椒毒素和佛手柑內酯、橙皮內酯和異橙皮內酯、檸檬內酯和濱蒿內酯、珊瑚菜素和8-氧甲基異歐前胡內酯、香柑醇和花椒毒醇。液相方法優化后相對應的總離子流圖(total ions chromatogram,TIC)、正離子提取流圖[(+)XIC]和負離子提取流圖[(-)XIC]如圖2所示,該方法在14 min內有效分離了41種香豆素類化合物,其中包括8組同分異構體。

a-正離子;b-負離子圖1 正離子(+XIC)和負離子(-XIC)下提取的離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms in positive (+XIC) and negative (-XIC) ion mode

a-總離子流圖;b-正離子提取離子流圖;c-負離子提取離子流圖圖2 標準品總離子流圖、正離子提取流圖和負離子提取流圖Fig.2 Total ion chromatograms, extracted ion chromatograms in positive ion mode and negative ion mode from the standard mixture注:化合物序號對應表2。

2.3 方法學驗證

將混合標準品稀釋成0.05、0.10、0.25、0.5、1、2.5、5、10、12.5、25.00、50.00、100.00 μg/L系列溶液,每種標準物質使用至少5個適宜濃度與MRM定量離子峰面積進行線性擬合。標準曲線、相關系數和線性范圍如表2所示,線性相關系數均大于0.99,表明每種化合物的濃度與峰面積的線性關系良好。相同濃度下的不同物質響應值不同,檢測限和定量限通過計算每種化合物信噪比和濃度來確定。39種化合物的LOD≤1.00 μg/L,37種化合物的LOQ≤1.00 μg/L。此外,6′,7′-二羥基香檸檬亭的LOD和LOQ最高,分別為2.61、8.7 μg/L,橙皮內酯的靈敏度最高,LOD和LOQ分別為0.002、0.006 μg/L。

將適當濃度的標準溶液加入佛手樣品中,用甲醇提取稀釋后評估該定量方法對41種香豆素類化合物的準確度和精確度。如表2所示,所有香豆素類化合物的添加回收率為80.43%～119.73%。儀器的精確度通過計算同一混合標準品的日內差和日間差的RSD進行評估,每種化合物的日內RSD<4.85%,日間RSD<5.44%。結果表明,該定量方法的靈敏度、精確度和準確度高,可用于佛手樣品的41種香豆素的靶向篩查和定量分析。

表2 方法學驗證相關參數Table 2 Parameters related to method validation

2.4 佛手中香豆素類化合物靶向篩查與定量分析

將新建立的UPLC-QqQ-MS/MS方法用于浙江省、云南省、廣東省和重慶市4個產地佛手樣品中41種香豆素類化合物的靶向篩查與定量分析。根據4個產地佛手樣品提取物的統計結果(圖3),在所測的佛手樣品中未檢測到所有41種目標化合物,并且4個產地的佛手樣品所檢測到的香豆素種類數量不同。在浙江佛手中可以檢測并定量29種香豆素,云南佛手中有28種,而廣東和重慶佛手中只有25種。由于有的化合物含量低于相應的定量限但高于檢測限,有的香豆素可以檢測到但不能定量,例如花椒毒醇和蟛蜞菊內脂。

在16種簡單香豆素、23種呋喃香豆素和2種其他香豆素中,有6種化合物未在任何一個產地的佛手樣品中檢測到,包括秦皮素、8-羥基佛手苷內酯、5,7-二羥基-4-甲基香豆素、花椒毒素、8-氧甲基異歐前胡內酯和4-羥基香豆精。在浙江佛手中有5種化合物能檢測到但不能定量,包括異橙皮內酯、6′,7′-二羥基香檸檬亭、補骨脂素、花椒毒醇和蟛蜞菊內脂,后三者同樣在云南佛手中只能定性不能定量。七葉內酯、6′,7′-環氧香檸檬亭、異補骨脂素和蟛蜞菊內脂在廣東佛手中不能定量,重慶佛手中異補骨脂素和6′,7′-二羥基香檸檬亭低于定量限。

4個產地佛手樣品中簡單香豆素檸檬內酯含量均為最高,其中浙江佛手的檸檬內酯含量最高,為(241.73±21.03) μg/g,其次是廣東佛手為(156.93±16.56) μg/g,云南佛手有(127.13±13.85) μg/g,最后是重慶佛手(95.18±1.89) μg/g。此外,含量最多的呋喃香豆素為白當歸素。譚濤等[27]檢測了浙江佛手和云南佛手中的21種香豆素,結果表明檸檬內酯的含量最高,此結果與本文相同,但不同的是含量最多的呋喃香豆素為氧化前胡素,有可能因為他們的檢測中未涉及到白當歸素。雖然佛手樣品定量到的呋喃香豆素種類最多,有15種,但定量到的簡單香豆素的總含量遠高于呋喃香豆素。在ZHONG等[14]的研究中,廣東佛手中并未檢測到歐前胡素、氧化前胡素、香柑醇和橙皮內酯,但在本研究中,可以篩查并定量,這表明了該方法的高靈敏度。在本研究中,首次檢測并定量了4種香豆素,包括橙皮內酯水合物、異茴芹內酯、8-(牻)牛兒醇基補骨脂素和香檸檬亭。

3 結論

本研究開發了一種高效快速的UPLC-QqQ-MS/MS方法,可在14 min內篩查并定量41種香豆素類化合物,包括16種香豆素、23種呋喃香豆素和2種其他香豆素。該方法具有良好的線性關系、靈敏度、準確度和精確度,線性相關系數均大于0.99,回收率為80.43%～119.73%,日內差小于4.85%,日間差小于5.44%。該方法可應用于真實樣品的檢測,對4個不同產地的佛手果實中的41種香豆素類化合物進行篩查和定量,浙江佛手中檢出的香豆素類化合物最多,檸檬內酯是含量最高的香豆素。有4種香豆素首次在佛手中檢測并定量,包括橙皮內酯水合物、異茴芹內酯、8-(牻)牛兒醇基補骨脂素和香檸檬亭。該方法是目前涉及香豆素類化合物最多、檢測速度最快的定量方法,對不同產地佛手的靶向篩查和定量分析可為佛手作為食品或藥品提供理論依據和數據支持。