異黃酮生物合成通路及關鍵酶研究進展

趙艷妹,劉林婭,魯明秋,何斌,龍彩鳳,龔小見,黃亞成*

1(貴州省山地環境信息系統與生態環境保護重點實驗室,貴州 貴陽, 550001) 2(六盤水師范學院 生物科學與技術學院, 貴州 六盤水,553004)

參考文獻

異黃酮屬于類黃酮屬,由肉桂酸輔酶A等酶合成的酚類化合物,主要活躍于豆科植物中,其中尤以大豆含量最多。根據其結構的不同,可以分為四類,12種。其中3種游離型化合物是異黃酮發揮作用的主要成分。20世紀,有研究學者[1]首次發現異黃酮與哺乳動物雌激素結構相似,并推測它們可能有防癌作用,從而使得異黃酮受到了廣大學者的關注。也因為它能和雌激素受體結合,被稱為 “植物雌激素”。除此以外,異黃酮還能夠預防女性絕經后的骨質疏松癥,減少脂質的積累,緩解更年期綜合征以及某些激素依賴性癌癥,如乳腺癌和前列腺癌等。

異黃酮的藥理活性在預防疾病方面具有良好的功效,但是在植物中的含量較少,即使在含量較高的大豆中也僅為1%～3%。因此提高植物體內異黃酮的含量和體外合成異黃酮能夠有效的改善異黃酮含量低的現狀。基于此,本文總結了目前異黃酮合成途徑以及藥理活性,重點從生物合成途徑以及關鍵酶和轉錄因子展開綜述,以期為深入研究異黃酮的生物合成機制和植物育種提供參考。

1 異黃酮的結構和存在形式

目前在異黃酮中分離出12種化合物,分為3種游離型苷元和9種結合性苷元,而結合性的苷元是在游離型的苷元的基礎上經過酸水解或者β-葡萄糖苷酶催化分解而得到。因此異黃酮主要是以葡萄糖苷的形式存在,其含量占到總異黃酮的97%～98%。異黃酮不同苷元的結構式見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034264)。

2 異黃酮的功能研究

異黃酮被證明是有益于人體健康的物質,在抗腫瘤、抗氧化、預防骨質疏松、緩解更年期綜合癥等方面有著顯著的功效。由于異黃酮的結構與β-雌二醇相似,可發揮弱雌激素作用,用于治療由雌激素缺乏導致的血脂升高[2];也能夠與成骨細胞內的受體結合,促進骨質的活性,提高骨密度,預防骨質疏松癥[3]。同時,作為類黃酮的一種,它有著黃酮類物質抗氧化的特點,能在抗腫瘤,清除自由基反應等方面發揮作用。以往研究證明染料木素在生理條件下是一種很有效的自由基清除劑[4],可減輕自由基帶來的氧化還原反應對機體DNA的損害[5],在保護肝臟防治細胞氧化應激損傷以及改善心血管疾病方面也具有重要作用。因此異黃酮的抗氧化能力可以為機體提供一定的保護。此外,研究也證明異黃酮能夠通過調節色氨酸的代謝通路從而緩解由谷氨酸引起的抑郁癥狀[6]。具體功能見附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034264)。

3 異黃酮的生物合成

3.1 異黃酮的合成路徑

異黃酮的合成過程由苯丙氨酸途徑和異黃酮合成途徑一起完成。苯丙氨酸代謝途徑是異黃酮合成的前提,其中3種主要的異黃酮化合物直接由苯丙氨酸途徑合成的,其他異黃酮化合物多數以葡萄糖苷-丙二酰-葡萄糖綴合物的形式貯存于液泡中。具體合成途徑為:苯丙氨酸(phenylalanine)作為最初底物,在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)的作用下生成肉桂酸(cinnamic acid),之后由一種P450 單加氧酶-肉桂酸-4-羥化酶 (cinnamate-4-hydroxylase,C4H)催化形成P-香豆酸,經4-香豆酰-CoA連接酶(4-coumaryl:coa ligase,4CL)連接一個輔酶A進而形成P-香豆酰-CoA。此后一部分的P-香豆酰-CoA在查爾酮合酶 (chalcone synthase,CHS) 的作用下與3 分子的蘋果酰 CoA 發生縮合反應, 形成C6-C3-C6的骨架結構。再經過查爾酮還原酶 (chalcone reductase,CHR)催化生成異甘草素(isoliquiritigenin),在此條件下一部分的異甘草素經過查爾酮異構酶(chalcone isomerase,CHI)催化又可生成甘草素(glycyrrhizin),之后經過一系列反應可以生成大豆黃素(daidzein);保留部分的異甘草素經過異黃酮合酶 (isoflavone synthase,IFS)可生成黃豆黃素(glyzein)。另一部分的P-香豆酰-CoA經過CHI能夠生成柚皮素。柚皮素是黃酮類和異黃酮類物質合成途徑中的共用底物,因此在此步驟中柚皮素的流向將成為影響異黃酮合成的關鍵因素。之后在CHI和異黃酮合酶(IFS)的共同作用下可催化生成染料木苷(genistein)。

異黃酮合成代謝途徑的參與基因數量眾多,調控機制復雜,現在公認的異黃酮合成途徑是由黃酮類物質合成的前體苯丙氨酸和丙二酰輔酶A經過PAL、C4H、4CL、CHS、CHR、CHI等多種酶的催化、羥基化等過程[9]。具體過程見圖1[10]。

圖1 異黃酮合成代謝途徑及主要化合物Fig.1 Isoflavone synthesis metabolic pathway and main compounds

3.2 異黃酮合成過程中的關鍵酶

研究發現,異黃酮的積累是通過復雜的遺傳互作網絡進行的[11]。在異黃酮合成的每個階段中都有大量的酶參與,而且酶與酶之間往往是通過相互影響、相互作用參與到合成途徑中。例如有研究證明異黃酮的積累由CHS8和IFS2共同調控[12],且與植物的發育階段有密切關系,呈現出時空表達的特點。在以往異黃酮合成途徑的研究中,已挖掘到 PAL、C4H、C3H、CHS 等多個參與異黃酮生物合成的重要酶。本文對異黃酮生物合成通路涉及到的關鍵酶進行總結,具體信息如表1所示。

表1 異黃酮合成代謝途徑中的關鍵酶及功能Table 1 Key enzymes and functions in isoflavone synthesis metabolic pathway

苯丙氨酸解氨酶(PAL)作為植物苯丙氨酸途徑的第一個酶,廣泛分布于植物和少數微生物中,現已在水稻、玉米、小麥等作物中都已分離純化得到PAL[21]。在高等植物中PAL家族含有多個家族成員,例如在擬南芥中有4個PAL家族成員,菜豆中有2個、歐芹中存在4個,楊樹中至少存在2個,茶樹中存在1個PAL家族成員[22]。對已報道的不同物種中PAL的成員個數進行統計(附表3,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034264),結果表明不同物種中所含PAL的基因家族成員個數不盡相同,但PAL家族成員序列具有較高的同源性,這表明PAL各成員都在異黃酮合成中具有重要意義。作為苯丙氨酸起始關鍵酶,PAL發揮著重要的作用。研究證實PAL能通過調控植物中苯丙氨酸代謝,影響相關代謝物質的積累,從而影響植物對生物脅迫和非生物脅迫的抗性及植物花色、花香的形成等。PAL多存在于植物表皮下的細胞以及微管組織中,而從亞細胞定位的情況來看PAL多數存在于細胞質中,這是植物苯丙氨酸代謝發生的主要場所。以往研究顯示大豆在幼苗時期的異黃酮含量要比成熟期高,說明異黃酮的含量與植物的發育時期有著密切關系,且證實主要由于PAL通過影響4CL、IFS2、CHS2和CHS1等基因的變化來調控異黃酮的合成[23],表明PAL影響著異黃酮合成途徑中的下游基因的表達,從而影響著異黃酮的合成。此外,植物不同部位異黃酮的表達也存在差異。異黃酮在水稻的莖、葉、種子中有表達,但是在3個部位隨著發育時期的不同,PAL的表達出現差異性[24]。宋修鵬等[25]也發現異黃酮在根中的表達尤其顯著,在葉片中的表達量相對而言較少[25]。

肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)是植物中第一個被鑒定出來的P450單加氧酶,而且在植物的各組織部位都表達出較高的活性[26]。肉桂酸-4-羥化酶(C4H)以肉桂酸為底物催化形成對-香豆酸[13],參與苯丙氨酸途徑的氧化反應[26]。同PAL一樣的是在不同植物中C4H的基因個數也不同。C4H在大豆發育前期表達量出現峰值,而且異黃酮的含量也有所升高,因此C4H的表達促進異黃酮的合成[27]。除此以外,C4H和PAL的變化趨勢呈現一致,都受到植物的生長發育以及外界刺激因素的調控[26]。

4-香豆酸輔酶 A 連接酶(4CL)是苯丙氨酸途徑的最后一個關鍵酶,催化各種羥基肉桂酸生成對應的硫酯,參與苯丙氨酸和各種末端產物合成途徑。其作用機制可以分為2種,一是以香豆素酸、咖啡酸和阿魏酸為底物催化為芥子醇,二是4CL以芥子酸為底物生成芥子酰-輔酶A[28]。4CL在葉片和豆莢中表達,4CL在大豆發育時期的后期出現峰值,促使與C4H共同生成的香豆酰-CoA進入異黃酮生物合成途徑[29-30]。

查爾酮合酶(CHS)是異黃酮合成途徑中第一個分支酶,是異黃酮表達的關鍵酶之一[14]。在多數植物中能夠催化4-香豆酰-CoA生成查爾酮,參與異黃酮的合成途徑,但是在少數植物中也可以將肉桂酰-輔酶A或者咖啡酰-輔酶A作為底物生成黃酮類物質黃烷酮[31]。CHS在異黃酮合成途徑中的作用不亞于PAL的作用。在豆科植物中CHS有8個家族成員,在異黃酮合成途徑的下游發揮了重要作用。但是8個基因家族成員在植物中具有組織特異性表達的特點,CHS1主要在葉片中表達,CHS2主要在子葉中表達,CHS7和CHS8主要在種皮中表達,而剩余的家族基因在各部位的表達量并不顯著。研究表明, CHS能影響花色素的形成,如抑制矮牽牛中CHS基因的表達,矮牽牛出現白色花或花色素分布不同的情況[32]。此外, CHS與大豆抗性形成有關。有研究表明轉入CHS基因的番茄中黃酮醇的表達增高,且番茄的抗氧化能力提高[33];而在楊樹中過表達的CHS增強了楊樹對低溫脅迫的耐受性,使其對低溫環境的敏感性降低[34]。

查爾酮還原酶(CHR)是大豆中異黃酮合成必不可少的一種酶,有研究表明CHR對于染料木素的合成有重要影響[35]。而且在低大豆苷元含量的品種中CHR的含量也低,這代表著CHR的含量與大豆苷元的合成也有關系。SREEVIDYA等[36]認為CHR發揮作用與CHS有關,CHR將在染料木素合成途徑中CHS催化形成的中間物質催化形成異甘草素,有學者推測CHR和CHS的能夠結合使得CHS蛋白性質改變,從而使得CHS最終催化產物從查爾酮變為異甘草素[37]。CHR的表達目前僅存于豆科植物中,而且表達量也很低,但CHR的作用機制相對復雜,是否有其他輔助因子的參與也更有待研究。

查爾酮異構酶(CHI)是最早被發現和研究的異黃酮合成的關鍵酶,這主要因為它能夠催化形成類黃酮類色素[33, 37]。在豆科植物中存在2種CHI,即為Ⅰ型 CHI 和Ⅱ型 CHI[38]。Ⅰ型 CHI也存在于一些非豆科植物中,與黃酮類、花青素的合成代謝有關,Ⅱ型 CHI的優勢體現在能夠催化異甘草素生成甘草素等,進而生成大豆苷元。大豆中異黃酮的合成主要是由Ⅱ型 CHI控制的[39]。有研究表明,兩種CHI雖都在大豆中表達,但兩者的同源性僅為50%左右[40],而且表達方式也不同,Ⅰ型 CHI主要在花組織與F3H協調表達參與異黃酮的合成途徑,Ⅱ型CHI在根中有特異性表達,它通過與IFS協同調節參與異黃酮的合成途徑[40]。雖然Ⅰ型CHI和Ⅱ型CHI的表達存在差異,但有趣的是類黃酮和異黃酮的合成過程中Ⅰ型和Ⅱ型CHI共享柚皮素這一重要的中間產物[40]。這代表雖然參與途徑各不相同,但各種酶可以通過協同作用參與生物合成機制來控制每種中間產物的流向。

黃烷酮-3-羥化酶 (flavonone 3β-hydroxylase,F3H)的表達與異黃酮的合成呈負相關。這要歸咎于F3H與異黃酮合成的相關酶呈現競爭關系[27],花青素也通過類黃酮合成機制來進行合成,F3H會促進花青素的合成,因此它的有效表達將過多底物用于合成花青素。研究證明轉入玉米C1和R轉錄因子的大豆籽粒中能夠抑制F3H合成花青素從而使得異黃酮的含量升高[10]。由于合成異黃酮的底物減少,因此作為異黃酮合成的下游基因,抑制F3H或者F3H基因沉默更有利于異黃酮的合成。

異黃酮合酶(IFS)是一種細胞色素P450單加氧酶[35],也是異黃酮類物質合成的第一個催化酶[21]。它能夠在NADPH和O2的輔助下催化柚皮素和甘草素完成C2-C3遷移[20]。它首次由HAGMANN團隊在處理后的大豆培養基上發現了IFS[41],由于它在植物中的含量較低而且不穩定,因此他發揮作用多同其他酶協作進行。易金鑫等[12]發現在農桿菌中轉化CHS8和IFS2的大豆種子異黃酮的含量要高于分別轉化兩種基因的大豆種子的異黃酮含量。其作用機制目前有兩種說法,其一為與CHI合成的柚皮素形成染料木素,其二是在CHR的參與下形成大豆苷元[35]。在豆科植物的合成代謝途徑中柚皮素是一種非常重要的前體物質,黃酮、花青素以及染料木素的合成都曾涉及到柚皮素。研究表明柚皮素在F3H的催化下合成花青素,而且也與CHI調節染料木素的合成[42]。

3.3 異黃酮合成過程中的相關轉錄因子

轉錄因子通常作用于其目標基因的啟動子區域并調節該基因表達[43]。異黃酮合成途徑涉及到的多數基因都以基因家族的形式出現,且不同基因家族參與不同的代謝途徑。而轉錄因子能夠通過多種機制進行調節,如改變其mRNA/蛋白豐度或通過翻譯后修飾[44]。對于異黃酮的合成與累積而言,轉錄因子的調控必不可少。

MYB轉錄因子是高等植物中最大的轉錄因子家族之一[45],在擬南芥有超過100個MYB轉錄因子[46],參與了包括苯丙氨酸代謝在內的多種植物代謝過程。研究表明MYB轉錄因子多數為R2R3類型[47],在植物生長發育的多個方面都有著重要作用,如參與次生代謝途徑,調控細胞分化,抵御外界的各種脅迫等等[48]。有研究表明GmMYB29和GmMYB133是異黃酮合成的正向調節因子,通過調節IFS2和CHS8的啟動子從而激活IFS2和CHS8的表達,從而參與大豆中異黃酮的合成[49]。GmMYB39可以通過抑制CHS的活性,來抑制異黃酮的合成[50]。R1型MYB家族轉錄因子GmMYB176可以激活CHS8啟動子的活性,使其毛狀根中的異黃酮的含量增加[51]。2種R2R2型MYB轉錄因子GmMYB133和GmMYB176能夠形成異二聚體,同自身也可形成同二聚體[49],參與異黃酮的合成途徑。GmMYB58和GmMYB205也是MYB因子家族的兩種關鍵正向調控物,GmMYB58和GmMYB205能夠激活CHS、IFS的啟動子活性,促進大豆種子中的異黃酮的合成[29]。GmMYB100是MYB家族R2R3型調控因子,該因子是一種負向調控因子。有研究表明GmMYB100的過表達與大豆毛狀根和擬南芥中類黃酮的相關表達基因的水平呈反比,GmMYB100通過調節CHI和IFS的啟動子的活性來抑制異黃酮的合成[30]。值得注意的是GmMYB100不光在大豆的根中表達,在花、葉和胚胎中也有表達[30]。GmMYBJ3也是一種典型的R2R3MYB轉錄因子,事實表明,GmMYBJ3在大豆胚乳中通過激活CHS8和CHI1A的啟動子,促進異黃酮的累積[30]。GmMYB12A和GmMYB12B2通過促進PAL、CHS等酶的表達,從而達到促進異黃酮積累的目的[48]。GmMYB183也是MYB轉錄因子之一,不過與之前的調控機制不同的是該基因能夠在鹽脅迫下激活GmCYP81E11d的表達促進類黃酮的表達增強了抗鹽性[52]。

bHLH轉錄因子普遍存在于多種生物中,也是植物中最大的轉錄因子家族之一[53],其中擬南芥中存在162個bHLHs轉錄因子[53]。bHLH轉錄因子的結構域可以分為一個HLH區域和一個堿性區域,其中HLH區域含有一個 α螺旋-環-α螺旋的結構部位,堿性區域能夠識別作用元件并與之結合[54]。同時,HLH還可以使轉錄因子之間形成同基因二聚體或者與bHLH其他亞族的轉錄因子形成異二聚體[53],這是bHLHs轉錄因子能夠發揮作用的原因。同時,多數的bHLHs還可以特異性識別并結合G-Box(5′-CACGTG-3′)序列[55]。以往研究表明MYC含有bHLH結構域,是bHLH家族轉錄因子的亞族,而在長春花中發現G-Box能夠與CrMYC1和CrMYC2結合,促進下游基因表達[56]。其生物學功能涉及到植物生長的多個方面。例如bHLH- MYB結合體可以與WD40形成轉錄因子復合體參與擬南芥表皮毛的生長[57]。bHLH轉錄因子也具有調控異黃酮合成的功能。劉德泉等人發現bHLH-MYC類轉錄因子家族成員GmbHLH3a和GmMYC2在大豆胚乳的發育后期有高表達,促進大豆胚乳中異黃酮的合成[53]。王慶鈺等[58]在大豆品種吉林32中得到GmbHLH13A7和GmbHLH3B13兩個bHLH轉錄因子,并且在大豆的花和胚乳中有高表達,并從轉基因大豆籽粒中發現異黃酮含量提高了24%～27%,因此兩種轉錄因子都可正向調節異黃酮的合成。王天亮等[54]在吉林32中得到GmbHLH3和GmPIF1兩個轉錄因子,并在大豆發根中有高表達。在過表達的GmbHLH3的大豆株系中,GmPAL1、GmC4H、Gm4CL、GmCHI1B1、GmIFS2和GmF3H基因的表達量也增高。在過表達GmPIF1的株系中,GmCHI1B1、GmPAL1和GmIFS2基因的表達水平提高。這代表GmbHLH3和GmPIF1對大豆發根中異黃酮的合成有正向調節作用。

表2 異黃酮合成過程中相關轉錄基因Table 2 Related genes transcribed during isoflavone synthesis

4 展望

異黃酮是一種主要活躍于豆科植物中的活性成分,不僅對豆科植物的生長發育具有重要作用,而且對人體具有顯著的保健作用,在抗腫瘤、預防心血管疾病和骨質疏松癥等方面都有著良好的功效。但由于植物中的含量較少,很難通過從植物中提取異黃酮滿足生產需求。因此提高植物體內異黃酮的含量和體外合成異黃酮,研究其合成通路和調控機制是有效途徑之一。異黃酮的合成由典型的苯丙氨酸代謝途徑和異黃酮合成途徑共同完成,其合成過程中涉及到大量的酶。雖然目前研究對涉及異黃酮合成途徑的相關酶進行了酶活性分析,并對相應的基因進行克隆、表達分析和功能鑒定,然而異黃酮的生物合成是一個非常復雜的基因互作網絡,涉及的轉錄因子數量十分龐大,因此對于未知的參與異黃酮生物合成途徑的相關轉錄因子還有待挖掘。且異黃酮的存在范圍是很小的,是否可以通過遺傳轉化體系獲得更高含量的異黃酮也有待研究。

異黃酮的相關研究工作已經取得了一定的成效,但在以下方面還需要深入研究:a)現階段在異黃酮的生物合成方面,各階段的關鍵基因仍然存在分歧。此外,轉錄因子是異黃酮合成途徑中關鍵酶發揮作用的前提,就目前的研究來看,還需擴大轉錄因子的研究范圍,挖掘和探索異黃酮合成途徑中的相關轉錄因子,豐富異黃酮合成的調控機制;b)異黃酮在植物中存在范圍較窄,需深入研究異黃酮生物合成途徑的關鍵酶和轉錄因子,通過轉基因技術在其他非豆科植物中實現異黃酮的生物合成。