子癇前期胎盤組織中神經(jīng)型Wiskott-Alrdich綜合征蛋白的表達(dá)及其意義

張碩，葛云鵬，王婷婷，沈鴻飛，李佳釙，宋貴玉，喬寵，2，3，4

（1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110039； 2. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生殖健康與遺傳醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110039； 3. 遼寧省母胎醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110039； 4. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)出生隊(duì)列研究中心，沈陽(yáng) 110039）

子癇前期是最常見的妊娠期特發(fā)性疾病，其發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、多環(huán)節(jié)的過(guò)程，涉及多器官損傷，不僅增加了孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒的死亡率和發(fā)病率，而且與糖尿病、心血管和腎臟相關(guān)疾病等的遠(yuǎn)期不良預(yù)后有關(guān)［1］。目前普遍認(rèn)為胎盤在子癇前期的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［2］。滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力不足，子宮螺旋動(dòng)脈出現(xiàn)重塑障礙［3］，合體滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常［4］，均可影響胎盤正常發(fā)育，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。

神經(jīng)型Wiskott-Alrdich綜合征蛋白 （neural Wiskott-Aldrich syndrome protein，N-WASP） 是由位于7q31.32的WASL基因編碼而成，分子量65×103。N-WASP作為一種成核促進(jìn)因子［5］，能夠調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲成核的程度、速度和位置，通過(guò)細(xì)胞骨架的重排參與組織形態(tài)的發(fā)生、細(xì)胞的侵襲和遷移等多種生物學(xué)行為。研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，N-WASP在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、胚胎的發(fā)育及細(xì)胞-細(xì)胞融合的過(guò)程中起重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)子癇前期胎盤組織中N-WASP的表達(dá)情況，探討其在子癇前期發(fā)病中的作用，以期為子癇前期的早期診斷和治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年7月至2021年12月間在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科病房分娩的孕產(chǎn)婦65例作為研究對(duì)象，均為單胎妊娠，胎兒無(wú)發(fā)育異常，病理未見絨毛膜羊膜炎，均排除原發(fā)性高血壓、糖尿病、慢性腎炎等病史。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)妊娠期高血壓疾病學(xué)組發(fā)布的《妊娠期高血壓疾病診治指南 （2020） 》［8］。分組：（1） 子癇前期組，共30例，進(jìn)一步分為早發(fā)型子癇前期 （early-onset preeclampsia，EOPE） 組 （分娩孕周＜34周，n=15） 和晚發(fā)型子癇前期 （late-onset preeclampsia，LOPE）組 （分娩孕周為34～40周，n= 15）；（2） 正常對(duì)照組，共35例，匹配早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期組孕婦年齡及分娩孕周，進(jìn)一步分為早發(fā)對(duì)照組 （ENC組，分娩孕周＜34周，n= 15） 和晚發(fā)對(duì)照組 （LNC組，分娩孕周34～40周，n= 20）。本研究已獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理審查批準(zhǔn) （倫理編號(hào)2021PS890K）。所有研究對(duì)象及其家屬均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的收集和處理：胎盤娩出5 min內(nèi)，術(shù)者自胎盤4象限中點(diǎn)處各取一塊1 cm×1 cm 全層胎盤組織，取材時(shí)避開胎盤大血管、邊緣、鈣化及壞死組織。于生理鹽水中反復(fù)清洗，盡量洗凈胎盤絨毛中的血液，用無(wú)菌濾紙吸干水分，取部分組織置于無(wú)菌凍存管并迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｆ溆嗵ケP組織在洗去胎盤絨毛中血液后，4%多聚甲醛固定，以備石蠟包埋用。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：取出4%多聚甲醛溶液中固定的胎盤組織，石蠟包埋，切片 （厚3～4 μm）。采用試劑盒 （KIT-9710，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司） 行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。用PBS稀釋兔抗人WASL多克隆抗體 （英國(guó)PROTEINTECH 公司） 至1 ∶100，用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。用DAB顯色試劑盒 （DAB-0031，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司） 進(jìn)行顯色，于光學(xué)顯微鏡下觀察胎盤組織出現(xiàn)棕黃色染色時(shí)為陽(yáng)性。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核5 min。應(yīng)用NIS-Elements軟件進(jìn)行圖像采集和分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) （quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR） 檢測(cè)胎盤組織中N-WASPmRNA表達(dá)水平：取約60 mg胎盤組織，采用TRIzol法提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度后，按Perfect Start?Uni RT&qPCR Kit （北京全式金生物技術(shù)股份有限公司） 說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物 （上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成） 序列：WASL，正向5’-GC TCTGGACGAGATGCACTGTTAG-3’，反向5’-CAGGT GTTGGTGGTGTAGACTCTTG-3’；以18S作為內(nèi)參照，正向5’-ATCCTCAGTGAGTTCTCCCG-3’，反向5’-CT TTGCCATCACTGCCATTA-3’。PCR體系按Perfect Start?Green qPCR SuperMix （北京全式金生物技術(shù)股份有限公司） 說(shuō)明書配制，于PCR 儀中行擴(kuò)增檢測(cè)：94 ℃ 30 s預(yù)變性；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。分析溶解曲線，通過(guò)循環(huán)閾值 （cycle threshold，Ct），采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 Western blotting：取約100 mg胎盤組織提取蛋白，用Omni-Easy?即用型BCA蛋白定量試劑盒 （上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司） 檢測(cè)濃度，并調(diào)整蛋白上樣量。凝膠恒壓電泳 （150 V，75 min），轉(zhuǎn)膜70 min，用5%脫脂奶粉室溫緩慢搖勻封閉4 h，加入兔抗人WASL多克隆抗體 （1 ∶2 000，英國(guó)PROTEINTECH 公司）、兔抗人GAPDH多克隆抗體 （1 ∶3 000，英國(guó)PROTEINTECH 公司），4 ℃孵育 16 h。次日室溫復(fù)溫 30 min。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育液 （1 ∶5 000，北京中杉金橋公司），室溫?fù)u床孵育2 h。用增強(qiáng)顯影液凝膠成像儀曝光成像。用Image Lab軟件檢測(cè)目的蛋白與內(nèi)參照條帶灰度值比值，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示。若2組數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，當(dāng)兩總體方差齊時(shí)，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；當(dāng)兩總體方差不齊時(shí)，采用t檢驗(yàn) （Satterthwaite法） 比較。若2組數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，兩樣本均數(shù)比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況比較

與相應(yīng)的正常對(duì)照組比較，EOPE組及LOPE組年齡及分娩孕周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05），收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白定量均顯著升高，新生兒出生體質(zhì)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組研究對(duì)象一般情況 （±s）Tab.1 Basic data of each group （±s）

表1 各組研究對(duì)象一般情況 （±s）Tab.1 Basic data of each group （±s）

1） P ＜ 0.05 vs. group ENC；2） P ＜ 0.05 vs. group LNC. EOPE，early-onset preeclampsia；ENC，early-onset control；LOPE，late-onset preeclampsia；LNC，late-onset control.

Neonatal birth weight （g）EOPE1532.53±3.8231.47±2.76150.31±25.221） 96.47±14.371）7.81±5.201）1 784±2801）ENC1531.41±3.9631.64±2.31117.86±11.51 79.82±9.75 0.07±0.052 002±152 LOPE1530.54±4.0137.76±1.54154.63±16.522） 104.39±11.242） 6.32±3.472） 2 875±5282）LNC2031.75±4.1338.43±1.44120.83±7.36 72.30±8.760.08±0.033 463±713 GroupnAge （year） Gestational week（week）Systolic pressure（mmHg）Diastolic pressure（mmHg）24 h urinary protein quantity （g）

2.2 N-WASP在胎盤組織中的定位及各組胎盤組織的HE染色

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，子癇前期胎盤組織及正常對(duì)照組胎盤組織中均可見N-WASP表達(dá)，EOPE和LOPE胎盤組織中陽(yáng)性染色較對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組明顯減弱。N-WASP在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，主要定位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞。HE染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組胎盤組織絨毛滋養(yǎng)層飽滿，而子癇前期胎盤組織中滋養(yǎng)細(xì)胞層明顯變薄，部分不均勻。見圖1。

圖1 胎盤組織中N-WASP定位表達(dá)及各組胎盤組織HE染色Fig.1 Localization of N-WASP in different placental tissues by immunohistochemical staining and HE staining of placental tissues in different groups

2.3 各組胎盤組織中N-WASP mRNA表達(dá)水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，EOPE組胎盤組織中N-WASPmRNA表達(dá)水平低于ENC組 （0.50±0.19 vs. 0.93±0.73），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。LOPE組胎盤組織中N-WASPmRNA 表達(dá)水平也顯著低于LNC組 （0.83±0.34 vs. 1.15±0.34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見圖2。N-WASPmRNA 在胎盤組織中的表達(dá)與EOPE的發(fā)生呈負(fù)相關(guān) （r= -0.37，P= 0.042）；與LOPE的發(fā)生同樣呈負(fù)相關(guān) （r= -0.39，P= 0.019）。

圖2 各組胎盤組織中N-WASP mRNA表達(dá)水平Fig.2 N-WASP mRNA expression levels in different placental tissues

2.4 各組胎盤組織中N-WASP蛋白表達(dá)水平比較

Western blotting結(jié)果顯示，EOPE組胎盤組織中N-WASP蛋白表達(dá)低于ENC組 （0.35±0.17 vs. 0.72±0.21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）；LOPE組胎盤組織中N-WASP 蛋白表達(dá)也顯著低于LNC組 （0.39±0.16 vs. 0.76±0.20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 胎盤組織中N-WASP 蛋白表達(dá)水平Fig.3 N-WASP protein expression levels in different placental tissues

3 討論

子癇前期是妊娠期特有的疾病，嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因之一［9］。胎盤在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在妊娠早期，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞能穿透蛻膜浸潤(rùn)至子宮肌層，進(jìn)而重塑子宮螺旋動(dòng)脈，形成高排低阻狀態(tài)，建立起有效的子宮-胎盤循環(huán)［10］。滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)淺，子宮螺旋動(dòng)脈重塑不足，子宮-胎盤循環(huán)無(wú)法有效建立，均可導(dǎo)致子癇前期發(fā)生。此外，胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化融合形成合體滋養(yǎng)細(xì)胞層，對(duì)于胎盤的形成同樣至關(guān)重要。合體滋養(yǎng)細(xì)胞層作為母胎界面屏障參與并維持了胎盤正常功能［11］。研究［4，12］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞合體化不足、合體滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，子癇前期胎盤組織于顯微鏡下呈現(xiàn)合體滋養(yǎng)層形態(tài)學(xué)異常改變，表現(xiàn)為合體滋養(yǎng)層變薄、不連續(xù)，以及出現(xiàn)多個(gè)液泡。同時(shí)，當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞合體化異常時(shí)也會(huì)引發(fā)子癇前期［13］。本研究中同樣也觀察到上述情況，與正常對(duì)照組胎盤組織相比，子癇前期組胎盤組織滋養(yǎng)層變薄，合體滋養(yǎng)層部分不均勻，甚至出現(xiàn)不連續(xù)。

N-WASP作為肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞骨架的重排，參與絲狀偽足、侵襲性偽足以及偽足小體的形成［14］。這些生物學(xué)行為影響了細(xì)胞在間質(zhì)中運(yùn)動(dòng)所必需的遷移和侵襲能力。N-WASP作為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心，參與了多種腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。在宮頸癌組織及細(xì)胞系中，均發(fā)現(xiàn)N-WASP呈過(guò)表達(dá)并促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［15］。胞外-5’-核苷酸酶通過(guò)腺苷A1受體誘導(dǎo)N-WASP發(fā)生構(gòu)象變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和肌動(dòng)蛋白聚合，在正常組織中對(duì)上皮完整性起到了保護(hù)作用，而子宮內(nèi)膜癌中這一平衡遭到破壞，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［16］。N-WASP在不同腫瘤組織中表達(dá)情況不同，N-WASP高表達(dá)與胰腺癌［17］、肝細(xì)胞癌［18］、食管鱗狀上皮癌［19］和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌［20］的不良預(yù)后和生存率呈負(fù)相關(guān)［17-18，21］，而在腎透明細(xì)胞癌中則表達(dá)水平降低［21］，提示其表達(dá)具有組織特異性，且其表達(dá)水平的改變對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移能力有直接的影響。另有研究［6］發(fā)現(xiàn)，WASP的果蠅同系物Wsp是幼年及成年果蠅成肌細(xì)胞融合的重要促進(jìn)劑。在小鼠胚胎發(fā)育中，N-WASP功能被破壞時(shí)，小鼠胚胎的成肌細(xì)胞無(wú)法融合［7］。目前尚無(wú)關(guān)于N-WASP在滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)情況及其與子癇前期發(fā)生關(guān)系的相關(guān)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，N-WASP在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及合體滋養(yǎng)細(xì)胞中均有表達(dá)，早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期胎盤組織中N-WASPmRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組，同時(shí)N-WASPmRNA在胎盤組織中的表達(dá)與子癇前期的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。因此，推測(cè)N-WASP通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白或通過(guò)影響肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白的表達(dá)水平導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排，從而對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn)能力產(chǎn)生影響，致使子宮螺旋小動(dòng)脈重塑障礙；此外，N-WASP也可能通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞合體化的過(guò)程參與了子癇前期的發(fā)生。綜上所述，N-WASP在子癇前期胎盤組織中低表達(dá)，其表達(dá)情況與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。