鐵死亡途徑及其相關分子泛素化修飾的研究進展

楊曉妍,周媛靜,羅秀菊,彭 軍

(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系,湖南 長沙 410078; 2. 中南大學湘雅三醫院檢驗科,湖南 長沙 410013)

在疾病發生發展過程中,會發生不同類型的細胞死亡,常見細胞死亡方式有凋亡、壞死和自噬性死亡等,其中凋亡和自噬性死亡受到嚴密的信號通路調控,而壞死通常是被動和意外的死亡方式,不受信號通路調控。近年來研究發現,某些壞死也受到特定的信號通路調控,稱為調節性壞死,包括壞死樣凋亡(necroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)、細胞焦亡(pyroptosis)、PARP-1依賴性細胞壞死(parthanatos)、CypD依賴性壞死等[1]。其中,鐵死亡是細胞膜上多不飽和脂肪酸磷脂過氧化損傷引起的一種鐵依賴性細胞死亡方式,形態學特征表現為線粒體膜密度增加,線粒體嵴減少或者消失,線粒體外膜破裂,但細胞核正常;生化特征則表現為鐵積累和脂質過氧化。鐵死亡參與了多種疾病的病理過程,如心梗、腦卒中、癌癥和退行性疾病等。

泛素(ubiquitin,Ub)是一種進化上保守的蛋白質,可對蛋白質進行翻譯后標記以降解。泛素化修飾(ubiquitination)與細胞內生理和病理過程密切相關,包括細胞周期控制、酶激活、信號轉導、轉錄、DNA修復、受體轉運、免疫反應、炎性反應和凋亡等。研究表明,泛素化修飾涉及細胞鐵死亡過程,該文將就鐵死亡途徑及其相關分子泛素化修飾研究進展作一綜述。

1 鐵代謝簡介

鐵離子是維持機體功能正常運轉必不可少的金屬元素,參與構成血紅蛋白、肌紅蛋白及多種酶,影響氧氣運輸、能量代謝和信號傳遞等多種生理過程。鐵通常以Fe3+和Fe2+形式存在,Fe3+在十二指腸及空腸上段被鐵還原酶還原成Fe2+,隨后經腸道吸收或紅細胞降解后被銅藍蛋白氧化生成Fe3+,再與血漿中的轉鐵蛋白(transferrin,TF)結合,形成TF-Fe3+復合物。飽和的TF與細胞膜上的轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)有高度親和力,復合物通過內吞作用進入細胞,質子泵調節內體pH至 5.5,使轉鐵蛋白釋放Fe3+,TF仍與TFR結合。鐵還原酶將Fe3+還原為Fe2+,隨后通過金屬轉運蛋白(divalent metal transporter 1,DMT1)轉運至胞質,Fe2+由線粒體鐵蛋白(ferritin,FN)引導到線粒體進行代謝利用。過量的鐵則以惰性鐵(即Fe3+)的形式儲存在FN中,或者以Fe2+的形式儲存在不穩定鐵池(labile iron pool,LIP)中。鐵釋放后,轉運蛋白與TFR的親和力下降約500倍,導致其解離,轉運蛋白回到血流中重新捕獲Fe3+。鐵從內皮細胞(也包括神經元或星形膠質細胞)釋放到腦間質的過程很可能涉及FN與鐵氧化酶活性的結合,類似于腸上皮中的基底外側鐵轉運機制。鐵主要由鐵輸出蛋白(ferroportin, FPN)排出到細胞外[2]。

2 鐵死亡途徑

2.1 鐵穩態調節途徑鐵離子缺乏會引起貧血等疾病,而鐵離子濃度過高即鐵超載則會對細胞造成損傷,過量的Fe2+能通過芬頓反應產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)導致脂質過氧化。與鐵攝取、儲存及輸出有關的蛋白出現異常均可引起鐵穩態失衡,誘導細胞鐵死亡。

細胞內的TFR、FPN及FN都受到鐵調節蛋白(iron regulatory protein,IRP)的轉錄后調節,IRP通過與mRNA上的鐵反應元件(iron response element,IRE)結合或解離來調節蛋白的水平高低。編碼TFR的mRNA在其非翻譯區的3’端有多個IRE,FNmRNA和FPNmRNA在其5’端有一個IRE,當IRP與3’端IRE結合時,能促進mRNA表達,而當與5’端IRE結合時,則能抑制mRNA表達。此外,IRP與IRE的結合力高低與細胞內鐵含量有關,當鐵含量較低時,IRP以高親和力與IRE結合,穩定了TFRmRNA的表達,但抑制了FPN和FN的mRNA表達,使得TFR水平上調,鐵輸出與鐵儲存減少,增加細胞內鐵離子含量;相反,當細胞內鐵含量較高時,IRP無法與IRE結合,導致TFRmRNA下調,且促進FPN及FN mRNA翻譯,減少鐵吸收,促進鐵輸出與過量的鐵儲存,降低鐵含量[3]。

Feng等[4]發現TFR在細胞表面的累積是鐵死亡的一個顯著特征;我們最近報道,在缺血/再灌注處理后的大鼠心臟以及缺氧/復氧處理后的H9c2細胞中,TFR上調引起鐵過載,從而誘導鐵死亡[5]。

FN由鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FTH)和鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain,FTL)組成,FTH包含鐵氧化酶中心,將Fe2+氧化為Fe3+,FTL不具有催化活性,不同細胞類型中這兩種亞基比例不同,對鐵的儲存起關鍵作用。此外,Gao等[6]發現,erastin誘導的鐵死亡細胞中核受體共激活因子(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)介導的自噬途徑激活,使FN降解,導致其中儲存的鐵釋放到細胞中的不穩定鐵池,細胞ROS積累,導致鐵死亡。鐵輸出主要依靠FPN,有研究發現敲除FPN能加速erastin誘導的SH-SY5Y細胞和NESCs細胞鐵死亡[7]。

2.3 VDAC途徑線粒體VDAC屬于真核生物線粒體孔蛋白,是轉運離子和代謝物的跨膜通道,介導代謝物通過線粒體外膜運輸,VDAC有3種亞型,即VDAC1、VDAC2和VDAC3。鐵死亡誘導劑erastin可以通過直接結合VDAC2/3來改變線粒體外膜的通透性,從而降低NADH的氧化速率,誘導鐵死亡,因此VDAC對鐵死亡有著重要的調節作用。VDAC能被微管蛋白阻斷然后關閉,限制呼吸底物進入線粒體,這對癌細胞來說有利于其糖酵解,被稱為Warburg效應。進一步研究發現,erastin可以逆轉微管蛋白對VDAC的抑制,使VDAC打開,增加其電導率和促進代謝物進出線粒體[10],導致線粒體功能障礙,釋放大量的氧化物,最終誘導細胞鐵死亡。

2.5 多不飽和磷酸酯的合成及過氧化途徑游離多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)通過酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)與輔酶A連接生成對應的酰基輔酶A衍生物,PUFA-CoA通過溶血磷脂酰膽堿轉移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)在磷脂中再酯化,生成多不飽和磷酸酯PUFA-PLs,因此,ACSL4和LPCAT3能增強多不飽和磷酸酯的生成,促進鐵死亡。PUFA中存在雙烯丙基,很容易發生過氧化,所以它們在PUFA中的數量是決定脂質氧化性的主要因素。脂質過氧化物若不及時轉化為脂質氫過氧化物并還原為無毒的醇,自由基介導的反應的擴散會導致大量次級產物的生成,破壞膜的完整性,最終導致鐵死亡。值得一提的是,ACSL4促鐵死亡的作用與GPX4抗鐵死亡的作用呈負相關。GPX4表達和/或活性降低,則ACSL4水平升高,細胞鐵死亡增強;而GPX4表達和/或活性升高,則ACSL4水平下降,細胞鐵死亡減少[12]。見Fig 1。

Fig 1 Ferroptosis pathways

3 鐵死亡途徑相關分子蛋白的泛素化修飾

3.1 轉鐵蛋白受體的泛素化TFR在維持細胞內鐵穩態中發揮重要作用,其蛋白的穩定性將影響到細胞內鐵離子水平,進而影響鐵死亡。Tribbles同源物2(tribbles homolog 2,TRIB2)可通過調節TFR水平而改變細胞對鐵死亡的敏感性,該作用涉及對TFR泛素水平的調節。含有E3泛素蛋白連接酶的β-轉導蛋白重復序列(β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase,β-TrCP)是轉鐵蛋白受體泛素化E3泛素連接酶。一旦β-TrCP被敲除,TRIB2無法降低不穩定鐵水平,敲除和過度表達TRIB2對鐵死亡和脂質過氧化的影響都離不開TFR和β-TrCP[13]。此外,HECT型E3泛素連接酶(HECT, UBA and WWE domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1,HUWE1)可介導肝細胞中的TFR泛素化,降低TFR蛋白水平,阻止細胞內鐵超載,進而抑制鐵死亡[14]。見Tab 1。

TFR還會受到上游分子泛素化的間接調控。在大鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型中,我們課題組發現心肌組織中泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin specific protease 7,USP7)、p53和TFR上調,伴隨心肌細胞鐵死亡增加。USP7抑制劑通過增強p53泛素化,降低p53和TFR水平,減少鐵死亡而減輕心肌I/R損傷[5]。Song等[15]將OTU去泛素化酶1(OTU Deubiquitinase 1,OTUD1)鑒定為IRP2的去泛素化酶,在結直腸癌中被選擇性還原。OTUD1通過去泛素化和穩定IRP2促進TFR介導的鐵轉運,導致細胞內鐵超載而誘導鐵死亡。

3.2 SLC7A11的泛素化OTU去泛素化酶泛素醛結合物1(OTU deubiquitinase,ubiquitin aldehyde binding 1,OTUB1)為調節SLC7A11穩定性的關鍵因素。OTUB1直接與SLC7A11相互作用并使其穩定;敲低OTUB1則降低癌細胞中SLC7A11水平,抑制小鼠腫瘤異種移植物的生長,這與激活鐵死亡有關。過度表達癌干細胞標志物CD44可促進SLC7A11和OTUB1之間的相互作用,增強SLC7A11穩定性;下調CD44能部分減少這種相互作用。總之,CD44以OTUB1依賴性方式抑制癌細胞鐵死亡,其在調節SLC7A11的穩定性和癌細胞鐵死亡中起著至關重要的作用,是癌癥治療的潛在靶點[16]。

腫瘤抑制劑BRCA1相關蛋白1(BRCA1 associated protein 1,BAP1)編碼一種核去泛素化酶,以減少染色質上的組蛋白2A泛素化(H2Aub)。BAP1可降低SLC7A11啟動子上H2Aub的占位,并以去泛素依賴性方式抑制SLC7A11的功能,從而抑制胱氨酸攝取,導致脂質過氧化和鐵死亡。雖然BAP1能降低SLC7A11啟動子上H2Aub部位的結合能力, H2Aub泛素連接酶PRC1卻能增強H2Aub結合,但兩者都抑制SLC7A11的表達,表明H2Aub的動態調節對SLC7A11的功能至關重要[17]。

Chen等[18]研究了筋膜肌動蛋白捆綁蛋白1(fascin actin-bundling protein 1,FSCN1)在乳腺癌中的表達譜和生物學效應,通過對TCGA癌癥數據庫的生物信息學分析以及功能獲得和缺失的研究表明,Fascin可增強erastin誘導鐵死亡的敏感性。Fascin直接與SLC7A11相互作用,并通過泛素介導的蛋白酶體降解途徑降低其穩定性。

3.3 GPX4的泛素化倍半萜內酯衍生物DMOCPTL可通過影響GPX4泛素化水平誘導三陰性乳腺癌細胞鐵死亡及凋亡,從而抑制癌細胞的增殖,該報道首次證明GPX4泛素化參與調節鐵死亡[19]。在高糖誘導人視網膜毛細血管內皮細胞的鐵死亡模型,過表達三結構域蛋白質46(tripartite motif containing 46,TRIM46)可增加高糖誘導細胞鐵死亡的敏感性,而鐵死亡誘導劑RSL3能逆轉沉默TRIM46對高糖誘導鐵死亡的保護作用。進一步研究發現,TRIM46可以與GPX4相互作用,促進GPX4泛素化[20]。

3.4 VDAC2/3的泛素化神經前體細胞表達發育下調4(NEDD4 E3 ubiquitin protein ligase,Nedd4)是真核生物HECT結構域E3連接酶家族的重要成員,它由1個催化C端HECT結構域、1個N端鈣/脂質結合結構域(C2結構域)和4個負責細胞定位和底物識別的WW結構域組成。Nedd4利用其WW結構域識別具有PPxY序列的底物,通過蛋白酶體將其降解。Yang等[21]認為VDAC2/3為erastin誘導的鐵死亡中E3連接酶Nedd4的底物,敲低Nedd4導致VDAC2/3蛋白水平升高,使黑色素瘤細胞在體外和體內對erastin誘導的鐵死亡敏感性增加。

3.5 NCOA4的泛素化NCOA4為鐵蛋白自噬降解的運貨受體,它的豐度取決于細胞內鐵含量以及與E3泛素連接酶HERC2的相互作用。HERC2僅在鐵水平高時與NCOA4結合,使NCOA4被蛋白酶體分解。當鐵水平低時,HERC2不與NCOA4相互作用。NCOA4介導的鐵蛋白自噬稱為鐵自噬,參與細胞內鐵水平和鐵死亡調節。三結構域蛋白質7(tripartite motif containing 7,TRIM7)屬于E3泛素連接酶,介導內源性蛋白質被泛素蛋白酶體系統降解。TRIM7通過其C端PRY/SPRY結構域,使用K48連接鏈直接結合,升高NCOA4泛素化水平,降低NCOA4蛋白水平,進而抑制鐵蛋白降解,降低細胞內鐵水平,減少細胞鐵死亡[22]。

Tab 1 Modification of ubiquitination and deubiquitinationof ferroptosis-related molecules

除TRIM7外,NCOA4還受到多種去泛素化酶的調節,如去泛素化酶圓柱狀蛋白(CYLD lysine 63 deubiquitinase,CYLD)。利用小鼠阿霉素心臟毒性模型,我們課題組探討了精子發生相關蛋白2(spermatogenesis associated 2,SPATA2)/CYLD通路與NCOA4介導的鐵自噬之間的關系。我們發現阿霉素處理后,心肌組織SPATA2和CYLD蛋白水平升高,二者相互作用增強,NCOA4泛素化水平降低,NCOA4穩定性增加,導致鐵自噬增強,促進了心肌細胞鐵死亡和心肌損傷[23]。

4 靶向調節鐵死亡途徑相關蛋白泛素化水平與疾病治療

鐵死亡涉及多條相關途徑,靶向各條途徑的鐵死亡誘導劑或抑制劑均具有潛在的臨床價值。研究表明,通過誘導癌細胞鐵死亡來抑制腫瘤生長是一種有效的癌癥治療策略[24],但由于存在特異性低、半衰期短或長期毒性等原因,目前大多數鐵死亡誘導劑用于臨床還有很長的路要走。由于泛素化修飾系統可調節癌細胞對鐵死亡的敏感性,靶向泛素化修飾很可能成為誘導癌細胞鐵死亡的新策略。如前所述,諸多鐵死亡途徑相關分子(如TFR、SLC7A11、GPX4和VDAC2/3等)的穩定性均與其泛素化水平密切相關。理論上,通過靶向干預上述鐵死亡相關分子特定的泛素或去泛素酶均可影響鐵死亡,進而達到治療某些疾病的目的。目前這方面的報道不多,主要集中在靶向調節GPX4泛素化水平。

GPX4具有抗細胞鐵死亡作用,是鐵死亡的標志物之一。靶向調節GPX4的泛素化水平進而促進細胞鐵死亡是目前治療癌癥的新策略。20S蛋白酶體抑制劑PIs硼替佐米和卡非佐米已被FDA批準治療血液系統惡性腫瘤,靶向作用于蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system,UPS)。由于許多患者對PIs具有耐藥性,學者將目光聚焦到了UPS的上游去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)上,Yang等[25]發現了一種金屬基化合物即鈀-吡啶硫酮復合物PdPT,可以通過抑制DUB,促進鐵死亡標志物GPX4的蛋白酶體降解,從而促進鐵死亡。

蛋白質水解靶向嵌合體(PROTACs)可以通過調節E3泛素連接酶的活性從而引起目的蛋白的蛋白酶體降解。Luo等[26]基于PROTAC策略設計了一種用于GPX4化學降解的小分子dGPX4,它將GPX4抑制劑ML162與可招募E3泛素連接酶的泊馬度胺共價結合而成。dGPX4能夠在不同類型癌細胞中降解GPX4,誘導脂質過氧化和細胞鐵死亡,其抑制鐵死亡效率比GPX4抑制劑的效率高5倍。將dGPX4封裝在一種新型ROS可降解脂質納米顆粒中合成dGPX4@401-TK-12,發現其能在癌細胞中選擇性降解,從而釋放dGPX4,增強癌細胞中GPX4的降解和鐵死亡,有效抑制腫瘤生長而無明顯不良反應。

除了癌癥以外,泛素化對鐵死亡的調控同樣在其他疾病的治療中發揮作用。肝臟缺血/再灌注以后可引起肝損傷和嚴重的細胞死亡,包括鐵死亡,HUWE1可通過泛素化修飾TFR,使其發生蛋白酶體降解,從而調節鐵代謝[14]。研究表明鐵死亡參與到了帕金森綜合征中,He等[27]總結了VDAC在帕金森綜合征中的作用,認為聯合使用藥物抑制VDAC1的低聚化并促進VDAC1的泛素化可能是一種有效抑制帕金森綜合征的方法,但目前VDAC2/3在帕金森綜合征中的作用還有待進一步研究。

5 結語

泛素化是最常見的翻譯后修飾之一,泛素化酶是一個龐大的家族,它通過蛋白酶體促進蛋白質降解,這一過程可以被去泛素化酶逆轉。鐵死亡已成為當前癌癥治療領域的熱點,對其他疾病的治療研究也越來越深入,泛素化和鐵死亡對各種生理病理過程的重要性不容忽視,進一步探究兩者的相互作用,對疾病治療及其機制探究具有重大意義。

盡管鐵死亡途徑相關分子蛋白的泛素化修飾在調節鐵死亡中發揮重要作用,但涉及的諸多機制還有待闡明,如:BAP1對SLC7A11表達的調節在H2A非泛素化突變體表達細胞中是否有變化?GPX4泛素化調節機制如何?VDAC1在PD患者和體外模型中表達水平為何不同?參與鐵死亡發生發展的分子眾多,隨著研究的深入,關鍵的分子會逐漸明朗。目前通過靶向調節鐵死亡相關分子泛素化水平治療疾病的報道較少,且其中大部分針對鐵死亡中的泛素化修飾的研究都聚焦于動物及細胞中的癌癥治療,真正用于臨床疾病的治療還有很長的路要走。