Cortactin/N-cadherin信號軸在病理性心肌肥大中的作用

王鉞鎂,喻文靜,孫襲孟,張 靜,路 靜,劉培慶

(中山大學藥學院,廣東 廣州 510006)

心肌細胞是終末分化細胞,因此,成年人的心肌細胞通過增加大小來應對異常增加的負荷,維持功能和效率。肥厚是心臟在面對生理、病理性刺激時出現的適應性改變,但病理性肥厚通常發展為心衰。肥厚初期表現為:心肌表面積增加;心室腔變小、室壁變厚;胚胎基因如心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦利鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)、心肌β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)被激活。隨著病程的發展,將由代償轉為失代償:線粒體功能障礙、細胞延長、凋亡等使心肌收縮功能受損;心肌纖維化、心室擴張等嚴重損害心功能,最終發展為心衰[1-3]。

皮層肌動蛋白結合蛋白(Cortactin)是Src激酶80/85 ku的底物,人類Cortactin蛋白由CTTN基因編碼[4]。Cortactin具有高度保守的序列,人類、嚙齒動物和鳥類的分子結構相似[5]。其N端可激活Arp2/3復合物,與F-肌動蛋白(F-actin)結合,促進肌動蛋白的成核與聚集;其C端Src同源3(SH3)結構域,介導與多種細胞骨架蛋白或支架蛋白的相互作用。近年來,有文獻報道在p47phox敲除的小鼠心臟中Cortactin功能失調,肌絲功能受損,不能很好地抵御外界壓力[6]。也有文獻報道,心肌細胞中N-Cadherin調控Kv1.5通道功能需要Cortactin的作用[7]。

N-cadherin即N型鈣黏連蛋白,分子量130 ku,受到鈣的保護,定位于細胞黏附體連接處。根據細胞環境不同,可發揮促進黏附或誘導遷移的作用。N-cadherin參與了細胞骨架的重組以及成肌分化過程[8]。研究表明,N-cadherin可增強人多能干細胞來源的心肌細胞在梗死小鼠心臟中的修復能力[9];過表達N-cadherin可調動間充質細胞發揮對缺血性心臟損傷的保護作用[10]。但N-cadherin與Cortactin是否參與了異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)誘導的病理性心肌肥厚,兩者是否存在相互作用關系,尚不清楚。基于以上背景,本文就Cortactin、N-cadherin與病理性心肌肥大的關系進行研究,以期探尋病理性心肌肥大的新機制以及新的研究靶點。

1 材料

1.1 試劑ISO粉末(貨號:51-30-9,美國MCE公司);Cortactin抗體(貨號:11381-1-AP)、α-Tubulin抗體(貨號:11224-1-AP)、N-cadherin抗體(貨號:22018-1-AP)、GAPDH抗體(貨號:10494-1-AP)、熒光二抗,均購自中國Proteintech公司;利鈉肽A(natriuretic peptides A,ANF)抗體(貨號:sc-515701,美國Santa Cruz公司);β-MHC抗體(貨號:M8421,美國Sigma公司);RNA逆轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq、BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher公司);RNAiso Plus(日本TaKaRa公司);DAPI、5-BrdU(美國Sigma公司);羅丹明鬼筆環肽、Lipo-2000、轉染專用培養基(美國Invitrogen公司)。

1.2 實驗動物健康C57BL/6小鼠20只(雌雄各半),體質量20～25 g,購自上海南方模式生物科技有限公司,實驗動物質量合格編號:201900020004 59。飼養于中山大學實驗動物中心(東校區)屏障環境,實驗動物使用許可證號:SYXK(粵)2021-0112。實驗動物倫理審查申請編號:2021001193。

1.3 儀器CO2恒溫培養箱、全自動細胞組高內涵篩選分析系統、熒光定量PCR儀、Evos XL Core細胞成像系統(美國Thermo Fisher公司);FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司);5840R臺式低溫高速離心機(德國Eppendorf公司);5200型化學發光凝膠成像系統(上海天能公司);電泳儀、電轉儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 原代心肌細胞培養酒精棉球擦拭SD大鼠乳鼠(1～3日齡)胸腹部皮膚,開胸,將心臟放入含有預冷PBS的平皿中,洗去殘血并摘除結締組織,隨后將心臟剪成大小適當的小塊,轉入無菌錐形瓶中。PBS洗滌后,加入12.5 mL胰酶(1 g·L-1),冷消20 min。用磁力攪拌器水浴攪拌消化,控制溫度為37 ℃左右,消化5 min。每次消化結束后,將消化液轉入15 mL離心管中,1 500×g離心5 min。重復上述操作至組織塊消失,將收集的細胞轉到培養瓶中,在CO2培養箱中差速培養1～2 h,使成纖維細胞貼壁,與心肌細胞分開。收集上層培養基,加入雙抗和5-BrdU,按需求稀釋并接種細胞。培養至心肌細胞貼壁(通常為24 h左右),用PBS洗去未貼壁細胞,并換入新的含5-BrdU的培養液繼續培養、處理即可。

2.2 RT-qPCR檢測棄去培養基,預冷的PBS清洗,隨后用TRIzol收集細胞。加入氯仿,劇烈顛倒震蕩至液體乳化分層。靜置離心后,將上層液體轉至新的EP管中。加入異丙醇,輕柔混勻,靜置,離心,RNA沉淀在底部。用預冷的DEPC水配制的75%乙醇洗滌沉淀,離心、棄上清,開蓋室溫干燥。以DEPC水為溶劑,58 ℃空氣浴輔助溶解RNA 10 min后,測定其濃度和純度。使用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。參照SYBY Premix ExTaq的說明書,進行反應體系構建。引物由上海生工公司合成,采用 β-actin為內參基因。β-actin引物:正向5′-CCAAGACGGCAGACGAAGTTCC-3′,反向5′-AAGTTCCGCCCTTCCTTTCCAATG-3′;ANF引物:正向5′-CTGGGACCCCTCCGATAGAT-3′,反向5′-CACTCTGGGCTCCAATCCTG-3′;BNP引物:正向5′-AGTCTCCAGAACAATCCACGATGC-3′,反向5′-GCCTTGGTCCTTTGAGAGCTGTC-3′;β-MHC引物:正向5′-CCAGAACACCAGCCTCATCAACC-3′,反向5′-CACCGCCTCCTCCACCTCTG-3′;Cortactin引物:正向5′-GAAGCACGCCTCCCAGAAAGAC-3′,反向5′-CAGCACTCTTGTCTACACGGTCAG-3′。

2.3 Western blot檢測心臟組織經稱量、機械剪碎、PBS洗滌等步驟,加入適量含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA重懸,通過超聲破碎組織細胞、釋放蛋白;細胞經貼壁、加藥處理后棄去培養基,用PBS清洗干凈,加入適量的RIPA裂解液,刮下細胞轉至EP管中,冰上裂解30 min后,4 ℃、12 000×g離心15 min,吸取上清。蛋白定量后,將制好的樣品進行電泳,后轉至PVDF膜上。封閉,一抗、二抗孵育并洗滌后,使用ECL化學發光檢測試劑盒顯影,檢測ANF、β-MHC、Cortactin、N-cadherin蛋白變化。

2.4 心肌肥大動物模型的建立及取材C57BL/6小鼠隨機分為ISO模型組和生理鹽水(normal saline,NS)組,每組10只(雌雄各半)。模型組小鼠皮下注射5 mg·kg-1·d-1的ISO,連續5 d,隨后以7 mg·kg-1·d-1的劑量再給藥2 d。經超聲心動檢測模型建立成功后,稱體質量,并用異氟烷麻醉小鼠后,迅速打開胸腔,由心尖處注射適量0.1 mol·L-1KCl溶液,使心臟處在舒張末期。取材后的小鼠量取脛骨長后,統一收集進行無害化處理。取出的心臟經清洗、稱體質量、拍照后,沿中部橫切,部分用4%的多聚甲醛固定后包埋成蠟塊,制作切片;剩余部分存放于-80 ℃冰箱,提取組織蛋白進行Western blot實驗。

2.5 免疫熒光共定位將H9c2細胞接種在confocal皿中并處理。棄去培養基,用溫浴過的PBS清洗細胞(此后每步操作前均需用PBS清洗)。加入1 mL 4% 的多聚甲醛,室溫避光固定10 min;加入200 μL 0.3%的Triton破膜10 min;加入即用型山羊血清室溫30 min或4 ℃過夜封閉;加入Cortactin或N-cadherin抗體(1 ∶200)4 ℃過夜孵育;加入熒光二抗(1 ∶200),室溫避光1 h;1×DAPI染核10 min,清洗干凈后用激光共聚焦掃描顯微鏡拍照。

2.6 細胞水平干預Cortactin

2.6.1過表達Cortactin 采用Cortactin腺病毒(Ad-cttn)感染或載體為pcDNA3.1(+)并攜帶大鼠Cortactin編碼區的質粒,轉染原代心肌細胞36 h,空載腺病毒(Ad-con)為對照組。病毒購于上海維真生物有限公司。

2.6.2siRNA干擾Cortactin 加入Cortactin干擾序列,降低其表達。siRNA干擾使用轉染專用培養基和Lipo-2000進行瞬轉。3條干擾序列分別為轉染后4～6 h換液,繼續培養36 h,然后提取蛋白或RNA。對構建的干擾序列進行預實驗篩選,選擇效果最好的進行實驗。Cortactin的3條干擾序列分別為Cttn-Rat-1 sense:5′-GCAAGAUAGGAUGGACAA ATT-3′,antisense:5′-UUUGUCCAUCCUAUCUUGCTT-3′;Cttn-Rat-2 sense:5′-GCAAAUACGGAAUUGACAAT T-3′,antisense:5′-UUGUCAAUUCCGUAUUUGCTT-3′;Cttn-Rat-3 sense:5′-CCAGUAAUAUUCGUGCUAATT-3′,antisense:5′-UUAGCACGAAUAUUAC UGGTT-3′。

2.7 原代心肌細胞表面積測定細胞分為對照組、ISO組、過表達Cortactin組、過表達Cortactin+ISO組、si-Cortactin組和si-Cortactin+ISO組。每步操作前均用PBS清洗3次。細胞處理完成后,棄去培養液并清洗干凈,加入4%多聚甲醛固定15 min后,棄去多聚甲醛,室溫干燥10 min。加入0.3%的Triton破膜10 min。使用羅丹明-鬼筆環肽于37 ℃避光孵育30 min,使細胞骨架染色。1×DAPI染核10 min后,用細胞全自動高內涵篩選分析系統測定細胞表面積。

3 結果

3.1 ISO誘導的心肌細胞模型中Cortactin蛋白水平降低原代心肌細胞經心肌肥大刺激劑ISO(10 μmol·L-1)處理后建立模型。與對照組相比,ISO處理后的心肌細胞表面積明顯增加(Fig 1A);肥大指標β-MHC和ANF的蛋白水平明顯上調(Fig 1B);ANF、BNP、β-MHC的mRNA表達也明顯上調(Fig 1C),提示心肌細胞肥大模型構建成功。隨后檢測了Cortactin蛋白水平的變化,發現其蛋白表達隨時間的延長而逐步降低(Fig 1D)。同時免疫熒光法檢測了Cortactin蛋白在細胞內的定位及表達情況(Fig 1E),發現Cortactin蛋白定位于胞膜和胞質中,與文獻結果一致;且與對照組相比,ISO刺激24 h后,Cortactin的蛋白水平明顯下調。提示ISO刺激的細胞模型中,Cortactin蛋白表達降低。

3.2 小鼠心肌肥大模型中Cortactin蛋白水平下降為了檢驗Cortactin蛋白水平的變化在動物和細胞水平上是否有一致性,用ISO構建了小鼠的心肌肥大模型。與NS組相比,ISO處理后,小鼠心臟明顯肥厚、心肌排列紊亂、膠原沉積增加,纖維化明顯(Fig 2A)。通過小動物超聲成像檢測小鼠心功能的變化,發現與NS組相比,ISO處理組小鼠心臟射血分數(ejection fraction,EF)、短軸縮短率(fractional shortening,FS)、舒張末期左室前壁厚度(left ventricular anterior wall dimensions at end-diastolic,LVAW;d)、收縮末期左室前壁厚度(left ventricular anterior wall dimensions at end-systole,LVAW;s)、舒張末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall dimensions at end-diastolic,LVPW;d)和收縮末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall dimensions at end-systole,LVPW;s)均明顯下降,心質量體質量比(heart weight/body weight,HW/BW)明顯升高,心質量脛骨長比(heart weight/tibial length,HW/TL)略有升高,提示動物模型建立成功。隨后檢測心臟組織肥大指標的mRNA、蛋白水平變化,以及Cortactin蛋白表達變化。RT-qPCR和Western blot結果顯示(Fig 2C-E),與NS組比較,ISO組小鼠心臟肥大指標ANF、β-MHC的mRNA及蛋白水平均明顯升高,而Cortactin蛋白表達明顯降低。體內、體外實驗結果具有一致性,表明ISO能明顯降低心肌細胞內Cortactin的蛋白水平,提示Cortactin可能是ISO誘導的心肌肥大中的一個潛在保護因子。

3.3 過表達Cortactin可抑制心肌肥大的發生為了探究Cortactin在ISO誘導的心肌肥大中的作用,采用外源性干擾的方法干預其表達。在原代心肌細胞中轉染載體為pcDNA3.1(+)并攜帶大鼠Cortactin編碼區的質粒以過表達Cortactin蛋白,檢測心肌肥大指標的變化情況。Fig 3A的mRNA檢測結果顯示,成功在原代心肌細胞中過表達了Cortactin。如Fig 3B所示,相較于對照組,ISO處理組肥大指標ANF和β-MHC的mRNA水平明顯升高,而過表達Cortactin能明顯抑制ISO誘導的肥大相關指標mRNA的升高。Fig 3C、3D結果顯示,過表達Cortactin也能明顯抑制由ISO引起的原代心肌細胞表面積的增加,即可以逆轉由ISO引起的心肌細胞肥大。

3.4 干擾Cortactin可促進心肌肥大的發生利用siRNA干擾心肌細胞中Cortactin的表達。Western blot和RT-qPCR結果顯示(Fig 4A、4B),與對照組相比,單獨敲低Cortactin可升高肥大指標ANF、β-MHC的蛋白和mRNA水平。鑒于3條干擾序列對肥大指標的作用相差不大,但si-1對Cortactin的敲低效果較2和3好,選用該條siRNA進行后續實驗。由Fig 4C、4D的結果發現,無論是肥大指標蛋白水平的變化,還是心肌細胞表面積的變化,單獨使用si-Cortactin的結果與ISO相似,兩者疊加使用后,可進一步加劇心肌細胞的肥大程度。以上結果提示,干擾Cortactin的表達具有心肌損傷的作用,更可加重由ISO誘導的心肌肥大,故Cortactin可能具有心臟保護作用。

3.5 Cortactin對ISO誘導的心肌肥大的調控機制為了進一步探討Cortactin發揮心肌保護作用的具體機制,通過外源性過表達或者干擾的方法影響其在細胞內的表達,并在此基礎上檢測細胞內N-cadherin蛋白水平的變化。如Fig 5A所示,在ISO誘導的動物模型中,N-cadherin的蛋白水平也明顯下降。通過Fig 5B免疫熒光的結果,確認了肥大刺激劑ISO可以降低N-cadherin的蛋白水平。隨后干擾Cortactin的表達,發現同樣會降低細胞內N-cadherin的蛋白水平,疊加給予ISO后會使這種效果更加明顯(與si-Cortactin組對比)(Fig 5C、5E)。而通過Ad-cttn過表達Cortactin后,可以增加細胞內N-cadherin的蛋白水平,且這一效應可逆轉ISO導致的N-cadherin蛋白水平的降低(Fig 5D、5F)。結果提示,Cortactin與N-cadherin的蛋白水平變化具有同向性,它們可能通過細胞間的黏附與連接,影響病理性心肌肥大的發生發展。

Fig 1 Level of Cortactin protein decreased in ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in primary

Fig 2 The protein level of Cortactin decreased in cardiac hypertrophy caused by

Fig 3 Overexpression of Cortactin alleviated ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in

4 討論

病理性心肌肥大是一種不可逆轉的慢性疾病,并且通常會發展為心衰。當心臟長期暴露于慢性應激或損傷中,心臟會進入肥厚代償期。在這一階段,心臟大小和質量增加,也伴隨著一系列分子生化、結構和代謝的變化,以維持心臟功能。然而,隨著時間的推移,這種變化會導致心室擴張、收縮功能下降,最終發展為心衰。此時,心臟將不能維持向身體供應含氧血液[11]。病理性心肌肥大的發生機制非常復雜,包括代謝失調、自噬異常激活、線粒體自噬增多、鈣調節紊亂、兒茶酚胺與內分泌紊亂等[12]。

腎上腺素受體是G蛋白偶聯受體超家族的成員,介導兒茶酚胺類腎上腺素和去甲腎上腺素的效應,在心臟功能的調節中起著不可或缺的作用[13]。腎上腺素和去甲腎上腺素對β-腎上腺素受體的刺激可激活典型的Gs-AC-cAMP-PKA信號級聯反應。在中樞神經系統的控制下,交感神經系統(sympathetic nervous system,SNS)通過促進神經末梢去甲腎上腺素的分泌來正向調節心功能。SNS-兒茶酚胺-β-腎上腺素受體軸是驅動心臟工作的主要機制,然而SNS的長期激活可導致心臟結構改變(心臟重塑),并可能發展為心衰[14]。ISO為非選擇性激動β受體,三型受體均可激活,因此我們選用ISO作為心肌肥大刺激劑來構建細胞和動物模型。根據實驗室前期研究基礎,采用10 μmol·L-1的ISO刺激原代心肌細胞,成功復制了ISO誘導的心肌肥大模型。采用皮下ISO給藥1周的方式,成功建立了小鼠心肌肥大模型。

閏盤(intercalated disc,ICD)作為心肌細胞末端各種細胞表面成分的組織中心,從而確保整個心肌的適當機電偶合。ICD具有3個作用:提供黏附體連接和橋粒;提供機械偶合和間隙連接;提供電偶聯。N-cadherin是ICD的重要組成部分,負責維持ICD結構[7]。然而,N-cadherin不能單獨支持形態發生和組織穩態,其作用的發揮需要Cortactin 和p120-連環蛋白(p120-catenin,p120-ctn)的協助。Cortactin是一種皮層肌動蛋白結合蛋白,為Src激酶底物,可被Src家族激酶直接磷酸化,促進了Arp2/3介導的肌動蛋白體外組裝。p120-ctn可以直接與N-cadherin蛋白相互作用,確保它在細胞表面的穩定[15]。在ICD中,有含Xin重復序列的蛋白,mXinα上存在多個p120-ctn結合位點,且其SH3結合基序能與Cortactin相互作用。它能夠將N-cadherin/p120-ctn復合物連接到潛在的肌動蛋白細胞骨架上,這種聯系可維持ICD的結構穩定,也可影響細胞黏附性和信號轉導。在小鼠心臟中, N-cadherin與Cortactin在ICD的共定位水平很高,而在mXinα缺失的心臟中,這一共定位水平急劇減少[16]。心臟特異性的N-cadherin缺失會導致ICD的分解和自發性致死性室性心動過速。與野生型小鼠相比,心肌細胞條件性敲除N-cadherin小鼠心室肌細胞的動作電位持續時間延長、Kv1.5/Kcne2的表達降低。Kv1.5/Kcne2表達的降低與肌動蛋白細胞骨架的破壞和肌膜接觸的減少有關。研究結果表明,在細胞黏附分子、N-cadherin、肌動蛋白結合支架蛋白、Cortactin和心臟中Kv通道重塑之間存在一種新的機制聯系[7]。

Fig 4 siRNA targeting Cortactin aggravated ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in

Fig 5 Cortactin could coact with N-cadherin in ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in H9c2 and C57BL/6

本實驗旨在探究細胞間的黏附與連接在病理性心肌肥大中的作用。本研究發現心肌肥大刺激劑ISO可使Cortactin和N-cadherin的蛋白水平降低,且在細胞中過表達Cortactin時,N-cadherin的蛋白水平也會升高,提示Cortactin和N-cadherin的蛋白變化具有一致性。Cortactin和N-cadherin之間有何關聯,它們是通過心肌電生理,還是心肌肌絲的穩定來影響心肌肥大的呢?以后將進一步研究。