槲皮素通過介導JNK信號通路抑制線粒體凋亡途徑的神經保護作用

姚思凡,張 鑫,戴月英,沈麗霞

(河北北方學院藥學院,河北省神經藥理學重點實驗室,河北 張家口 075000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種原發性退行性腦病,根據經過流行病學調查的結果顯示,AD發病情況在性別之間存在明顯的差異,絕經后婦女相較于同齡男性,患上AD的幾率要高1.5～3.0倍。多年來,醫學界經常采用人工合成的雌激素替代治療方法來降低患上AD的風險,這種治療方式已經被證明能夠使風險降低50%,由于雌激素可能會增加患上生殖系統腫瘤和乳腺癌的風險,因此人們一直在尋求更安全的替代物來代替雌激素的應用。槲皮素(quercetin,Que)是與雌激素近似的植物雌激素類[1]。課題組前期研究顯示,Que雌激素樣作用對PC12細胞起神經保護效應[2]。

AD作為一種多因素疾病,線粒體功能障礙在AD的發病機制中扮演著早期事件的角色,甚至在臨床癥狀出現之前就已經發生[3]。JNK可被應激、輻射和生長因子等多種細胞外刺激激活,介導多種細胞功能,如凋亡、自噬、增殖、侵襲和遷移[4]。近年來,研究發現JNK信號通路在細胞凋亡過程中有著重要的作用[5]。JNK誘導細胞凋亡的分子機制可能涉及線粒體介導的細胞凋亡通路的參與,且JNK信號通路與雌激素之間亦存在聯系,JNK信號通路既參與了線粒體的凋亡[6-7],也有通過雌激素來調控細胞凋亡[8],針對JNK的治療策略有望改善AD。

本實驗分別從雌激素受體α/β拮抗劑MPP/PHTPP和JNK特異性抑制劑SP600125入手,研究Que通過對Aβ25-35誘導的PC12線粒體途徑的凋亡,并探討其保護作用及機制,為發展AD防治藥物提供新的思路和策略,同時為探索植物雌激素調節劑在絕經后女性AD防治中替代雌激素的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料PC12細胞購自中國科學院昆明細胞庫。MPP(批號:sc-204098)和PHTPP(批號:sc-204191)購自Santa Cruz公司;DAPI 染色液(批號:S0001)、Aβ25-35Peptide(批號:Y0044)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L/HRP antibody(批號:bs-0295G-HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司;Que(批號:100081-201610)和金雀異黃素(genistein,Gen批號:111704-201703)購自中國藥品生物制品檢定研究所;SP600125(批號:S5567)購自sigma公司;caspase 3活性檢測試劑盒(批號:C1116)和Fluo-4 AM(批號:S1060)購自碧云天生物技術研究所;17β-E2(批號:ab120657)、Cytochrome C抗體(批號:ab133504)、Bim抗體(批號:ab32158)、羊抗兔熒光二抗(批號:ab150080)購自abcam公司;HRP-conjugated β-Actin Rabbit mAb(批號:AC028)購自abclonal公司;JNK antibody(批號:9252T)、Phospho-JNK (Thr183/Tyr185) Antibody(批號:9251s)、Bcl-W Rabbit mAb(批號:2724s)購自美國CST公司。

1.2 儀器CO2培養箱購自Thermo公司,Cytation5細胞成像微孔板檢測儀購自BioTek公司,超速冷凍離心機購自sigma公司,倒置顯微鏡購自Nikon公司,FV3000激光共聚焦掃描顯微鏡購自OLYMPUS公司,化學發光成像系統購自Protein Simple公司。

1.3 方法

1.3.1Fluo-4 AM檢測PC12細胞鈣離子變化 將細胞以每個激光共聚焦小皿容納2×104個的密度接種,每個小皿中加入1 mL的培養液,經過24 h將培養基吸出。實驗分組為Control、Aβ組(終濃度為20 μmol·L-1)、Aβ+17β-E2(終濃度為0.1 μmol·L-1)、Aβ+Gen(終濃度為50 μmol·L-1)、Aβ+Que(40、60、80 μmol·L-1)。給藥培養24 h后,避光加入Fluo-4工作液(終濃度為0.5 μmol·L-1) 1 mL,室溫孵育20～30 min,去染色液,DPBS清洗3遍(每次5 min),激光共聚焦顯微鏡進行觀察,快速采集圖像,使用ImageJ軟件分析結果。

1.3.2Rhodamine 123染色液檢測PC12細胞線粒體膜電位變化 將細胞以每個激光共聚焦小皿容納2×104個的密度接種,每個小皿中加入1 mL的培養液,經過24 h將培養基吸出。實驗分組同“1.3.1”。各組給藥24 h后,棄液,加入37 ℃預熱的染色液(10 μmol·L-1) 1 mL,室溫孵育20 min,DAPI染核5 min,以上兩步需要避光,最后使用激光共聚焦顯微鏡快速采集圖像,ImageJ軟件分析結果。

1.3.3Caspase-3含量檢測 將細胞以每個6孔板容納5×105個的密度接種,每個小皿中加入2.5 mL的培養液,當細胞生長1～2 d,匯合度達70%-80%時,實驗分組:①分組同“1.3.1”; ②在建立研究模型和進行藥物干預之前,加入2 μmol·L-1的MPP/PHTPP,37 ℃孵育1 h,棄液,分組:Control、Aβ組、Aβ+中劑量Que(60 μmol·L-1)組、Aβ+MPP組、Aβ+中劑量Que(60 μmol·L-1)+MPP組、Aβ+PHTPP組、Aβ+中劑量Que(60 μmol·L-1)+PHTPP組,繼續加藥培養24 h。③在造模之前,加入10 μmol·L-1的SP600126預孵育培養1 h,分組:Control、Aβ組、Aβ+中劑量Que(60 μmol·L-1)、Aβ+SP600125組、Aβ+中劑量Que(60 μmol·L-1)+SP600125組,繼續加藥培養24 h。按照試劑盒說明書檢測Caspase-3含量。

1.3.4細胞免疫熒光染色法檢測PC12損傷細胞內蛋白的表達 將細胞以每個激光共聚焦小皿容納2×104個的密度接種,每孔100 μL,37 ℃孵育4 h后,補液1 mL繼續培養。實驗分組同“1.3.1”,棄去培養液,固定細胞30 min,0.1%透化液透化細胞20 min,封閉液封閉2 h,p-JNK(1 ∶200),4 ℃過夜,TBST進行清洗3次(每次10 min),室溫孵育熒光二抗(1 ∶500) 2 h,DAPI染核,PBST清洗,激光共聚焦顯微鏡下采集圖像并分析。

1.3.5Western blot法細胞中ERα、ERβ、p-JNK、JNK、Bcl-W、Bim和Cytochrome C蛋白的表達 實驗分組同“1.3.1”,收集各組細胞提取蛋白并進行進一步實驗。加入一抗β-actin、ERα、ERβ、p-JNK、JNK、Bcl-W、Bim、Cytochrome C,4 ℃冰箱孵育過夜,室溫搖床孵育二抗2 h,ECL曝光顯影,ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 槲皮素對PC12細胞鈣離子濃度變化的影響與正常對照組相比,Aβ25-35模型組鈣離子熒光強度增強(P<0.01),細胞突觸比正常對照組明顯減少。鈣離子大量外流,濃度升高,熒光值升高,說明Aβ25-35造成PC12受損。與Aβ25-35組相比,Aβ25-35與17β-E2、Gen和Que共培養后,鈣離子濃度顯著降低(P<0.01),其中在低、中、高劑量的Que中,中劑量Que作用效果最為明顯(P<0.01)(Fig 1-1,Fig 1-2)。

2.2 槲皮素對線粒體膜電位的影響與正常對照組相比,Aβ25-35模型組線粒體膜電位的熒光強度明顯增強(P<0.01),表明線粒體跨膜電位較低;陽性藥17β-E2、Gen和不同濃度的Que與Aβ25-35共培養后,與模型對照組相比,熒光強度減弱(P<0.01)(Fig 2-1,Fig 2-2);各組線粒體跨膜電位明顯升高,差異有統計學意義。提示,Que可調節Aβ25-35誘導PC12細胞導致的線粒體跨膜電位降低,從而保護細胞。

Fig 1-1 Immunofluorescence map of effect of Que on Ca2+ concentration in PC12 cells induced by Aβ25-35 (×200)

Fig 1-2 Effect of Que on Ca2+ concentration in PC12 cells

Fig 2-1 Immunofluorescence of Que on mitochondrial membrane potential in PC12 cells (×200)

2.3 槲皮素對PC12細胞Caspase-3表達的影響與正常對照組相比,Aβ25-35處理PC12細胞24 h后Caspase-3含量升高(P<0.01)。與Aβ25-35組相比,陽性藥17β-E2、Gen和低、中、高劑量的Que與Aβ25-35共培養后,Caspase-3含量降低(P<0.01),其中在低、中、高劑量的Que中,中劑量Que作用效果最為明顯(P<0.01)。

Fig 2-2 Immunofluorescence analysis of Que on mitochondrialmembrane potential of Rhodamine 123-labeled

ERs抑制劑組中結果表明,與Aβ25-35模型組相比,Aβ25-35+中劑量Que組細胞Caspase-3水平顯著提高(P<0.01),Aβ25-35+中劑量Que+MPP組Caspase-3與Aβ25-35+中劑量Que組相比明顯上升,差異具有統計學意義(P<0.05)。表明MPP可阻礙Que對PC12細胞Caspase-3表達的抑制。

SP600125抑制劑組中結果表明,與Aβ25-35模型組相比,Aβ25-35+中劑量Que組和Aβ25-35+SP600125組Caspase-3水平降低(P<0.01)。表明,SP600125可抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞Caspase-3表達的增加,而且相比于單獨Que組,Que和SP600125兩者合用效果最強(Fig 3)。

Fig 3 Effect of Que ,MPP ,SP600125 on Caspase-3

2.4 槲皮素對PC12損傷細胞內p-JNK熒光強度表達的影響Aβ25-35處理后增強p-JNK熒光強度(P<0.01),Aβ25-35與17β-E2、Gen和Que共同處理組p-JNK熒光強度減弱(P<0.01),表明,Que可通過影響JNK磷酸化表達發揮對PC12損傷細胞的保護作用(Fig 4-1,Fig 4-2)。

Fig 4-1 Aβ25-35 induced change of p-JNK immunofluorescenceintensity in PC12 cells(×200)

Fig 4-2 Effect of Que on fluorescence expression

2.5 槲皮素對PC12損傷細胞蛋白表達的影響與正常對照組相比,Aβ25-35組ERα表達降低(P<0.01)。ERβ表達差異無統計學意義(P>0.05)。與Aβ25-35模型組比較,陽性藥17β-E2、Gen和不同濃度的Que與Aβ25-35共培養后,ERα表達明顯上調(P<0.01)。藥物組ERβ表達與Aβ25-35模型組相比,無差別(P>0.05)。與正常對照組相比,Aβ25-35模型組p-JNK的兩個亞型表達均有升高,差異明顯(P<0.01),而JNK兩個亞型的表達均不明顯(P>0.05)。與Aβ25-35模型組比較,陽性藥E2、Gen和低、中、高劑量的Que與Aβ25-35共培養后,p-JNK的兩個亞型的表達明顯下降(P<0.01)(Fig 5-1,Fig 5-2,Fig 5-3)。

Fig 5-1 Detection of protein levels of ERα,ERβ,p-JNK and JNK by Western

與正常組相比,Aβ25-35作用細胞24 h后升高Bim、Cyt C表達(P<0.05),抑制Bcl-W表達,差異明顯(P<0.01),SP600125預處理1 h后,Aβ+SP600125組與Aβ組相比,Bim、Cyt C表達降低(P<0.01),Bcl-W表達升高(P<0.01),差異具有統計學意義。同時,在Aβ損傷的情況下,相比于單獨Que組所起的保護作用,Que和SP600125兩者合用效果最強。表明Que可通過JNK信號通路抑制Aβ25-35誘導的線粒體凋亡(Fig 5-4,Fig 5-5)。

Fig 5-2 Quantification analysis of ERα,ERβ

Fig 5-3 Quantification analysis of p-JNK ,JNK

Fig 5-4 Effect of SP600125 on protein levels of Bcl-W,Bimand Cyt C in PC12

Fig 5-5 Effect of SP600125 on protein level of Bcl-W,Bimand Cyt C in PC12

3 討論

雌激素受體分為雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ),課題組前期研究Que與雌激素受體之間的關系,加入雌激素受體拮抗劑ICI 182780干預后,結果顯示Que主要通過ERα起到雌激素樣神經保護作用[9]。進一步研究雌激素受體拮抗劑在AD模型中的應用,采用了Aβ25-35來誘導PC12細胞的損傷,并分別使用了ERα拮抗劑MPP和ERβ拮抗劑PHTPP進行干預。結果顯示,Que展現出對AD體外模型中的細胞損傷有較好的改善作用,并顯示出類似于雌激素的神經保護特性。

AD患者大腦中存在線粒體異常,線粒體功能障礙被認為是該疾病的早期和顯著特征,甚至在認知障礙出現之前已經觀察到[10]。線粒體功能損傷是AD常見現象,與Aβ有關。因此,改善線粒體損傷已成為AD預防和治療的重要問題。AD神經元丟失主要通過凋亡方式進行,其中線粒體途徑凋亡起關鍵作用,涉及Caspase-9參與的線粒體通路和Caspase-3參與的神經元凋亡過程。鈣離子與細胞凋亡之間存在緊密關聯,線粒體內鈣離子水平的升高會導致線粒體受損,進一步激活caspase,促進細胞凋亡[11]。本實驗結果顯示,Que能夠穩定線粒體跨膜電位,細胞內鈣離子降低,抑制Caspase-3,減少Cyt C,發揮神經保護作用,本研究的結果與以前的研究一致,表明Que在一定程度上對細胞線粒體具有保護作用[12]。當凋亡信號刺激細胞,Bcl-2家族含量失衡,亦會改變線粒體膜通透性,促使線粒體膜電位下降或者消失,Cyt C促凋亡蛋白從線粒體釋放,活化細胞凋亡的主要執行者Caspase-3[13]。本實驗顯示,Que可以逆轉 Aβ25-35引起的Bcl-W和Bim蛋白水平的表達,有效降低胞質中Cyt C和Caspase-3的水平。表明Que可通過線粒體途徑減弱Aβ25-35的神經毒性,發揮神經保護作用。

c-Jun N-末端激酶(JNK)在細胞內外應激下對平衡細胞生存和死亡起著關鍵作用。在本實驗中,經Aβ25-35誘導PC12細胞后,Caspase-3活性的相對變化,說明使用JNK特異性抑制劑SP600125進行干預后,抑制了Aβ25-35導致的細胞活性下降,起到神經保護作用,由此也說明了JNK信號通路參與了細胞凋亡的過程[14],其中Que和SP600125兩者合用保護效果更強。當細胞受到刺激時,活化的JNK會從細胞質迅速轉移到細胞核內,并導致基因表達的變化[15]。活躍的JNK也會定位到線粒體上。JNK在線粒體上的磷酸化作用可以影響Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白的功能,導致線粒體膜的通透性發生改變,激活caspase等特定的蛋白酶,這些蛋白酶是細胞凋亡過程中的關鍵執行者,它們能夠引發細胞內部的一系列級聯反應,最終導致細胞凋亡的發生。因此,JNK在細胞凋亡中發揮了重要的作用,它通過轉位到線粒體上,拮抗其抗凋亡活性,釋放Cyt C,激活Caspase-9和Caspase-3,進而引發細胞凋亡的過程。本實驗結果顯示,SP600125預處理組Bim和Cyt C表達增多,抗凋亡因子Bcl-W表達下降。表明JNK信號通路參與了Aβ25-35介導的PC12細胞線粒體凋亡途徑,SP600125抑制JNK磷酸化表達,可逆轉Aβ25-35誘導的細胞凋亡。另外,本實驗通過免疫熒光法和Western blot法標記了p-JNK,結果揭示了給予藥物共培養后,Aβ25-35誘導的JNK的磷酸化表達被顯著抑制。以上表明Que可能通過對JNK信號通路的調節作用抵抗Aβ25-35誘導的細胞線粒體凋亡通路。

綜上所述,Que通過抑制JNK信號通路,對線粒體途徑凋亡起到了神經保護作用。這為開發Que及其類似物作為潛在的治療神經退行性疾病的藥物奠定了基礎。Que有望作為AD的潛在治療藥物,并探索其臨床應用的潛力。