紅芪抗放化療所致靶器官損傷作用機(jī)制及其“構(gòu)-效-量”關(guān)系

趙沙沙,何 海,王姿楊,邢耀瑩,任 遠(yuǎn),邵 晶,3,4

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),2. 西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,3.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,4.甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ,甘肅 蘭州 730000)

放化療作為腫瘤治療的主要方式之一,會(huì)引起肝、腎、胃腸等方面的靶器官損傷,其副作用不可忽視。放療過程中,射線在穿透人體組織到達(dá)腫瘤前,會(huì)對(duì)正常組織造成一定損傷;化療是一種全身性的治療手段,在殺傷和抑制癌細(xì)胞的同時(shí),又不可避免地對(duì)正常組織和器官產(chǎn)生毒性,例如骨髓抑制、胃腸道毒性、肝臟毒性、腎和膀胱毒性、免疫功能低下等[1]。紅芪是甘肅的道地藥材,為HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根。2020版《中華人民共和國藥典》記載其具有補(bǔ)脾益氣、生津養(yǎng)血、固表止汗及利水消腫等功效,現(xiàn)代研究表明,其具有抗炎[2]、抗腫瘤、防治肝損傷、胃損傷等[3]藥理作用。此外,文獻(xiàn)報(bào)道紅芪提取物對(duì)放射性心肌細(xì)胞損傷、放射性肺損傷[4]具有保護(hù)作用,但其抗放化療所致的靶器官損傷保護(hù)作用的可能藥效機(jī)制并未明確。

中醫(yī)的醫(yī)療理念具有整體觀、系統(tǒng)觀的特點(diǎn),中藥作用機(jī)制具有“多組分、多靶點(diǎn)、多通路”的特點(diǎn)[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)的應(yīng)用突破了傳統(tǒng)研究方式,是現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究的哲學(xué)理念與研究模式的轉(zhuǎn)變的代表性研究理念和方法。其可多層次、多角度分析中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的特點(diǎn),與中醫(yī)藥的特點(diǎn)殊途同歸。因此,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測紅芪抗放化療所致靶器官損傷保護(hù)作用的潛在“成分-靶點(diǎn)-通路”,基于其潛在作用機(jī)制通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并結(jié)合HPLC含量測定探討其主要活性成分的“量-效”關(guān)系,為后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)Wistar種大鼠,雌雄各半(200±20 g),購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(甘)2020-0002,質(zhì)量合格證號(hào):0002370,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品及試劑紅芪藥材購自甘肅普蘭特有限公司,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)崔治家教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根。對(duì)照品:毛蕊異黃酮(批號(hào):Y29J2H391 62)、金雀異黃酮(批號(hào):H30A9Z69019)、毛蕊異黃酮苷(批號(hào):Y16O11H127829)、芒柄花黃素(批號(hào):H06S9Z69494)、槲皮素(批號(hào):C28J11Y116820)、刺芒柄花苷(批號(hào):M02A11S120167)、異甘草素(批號(hào):H03D9Z76567)、美迪紫檀素(批號(hào):Y12M11H112983)純度均≥98%,購自上海源葉生物科技有限公司,貞芪扶正顆粒(批號(hào):K20210842)購自甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司,注射用順鉑(凍干型)(批號(hào):1J0535B03)購自齊魯制藥有限公司。肌酐含量試劑盒(Cr,批號(hào):20220601-RXWB0459-96)、尿素試劑盒(BUN,批號(hào):20220601-RXWB0153-96)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(ALT,批號(hào):20220601-RXWB0374-96)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,批號(hào):20220601-RXWB0098-96)試劑盒、大鼠胃動(dòng)素ELISA試劑盒(MTL,批號(hào):20220601-RX302272R)、大鼠血管活性腸肽ELISA試劑盒(VIP,批號(hào):20220601-RX302215R)、大鼠白細(xì)胞介素10 ELISA試劑盒(IL-10,批號(hào):20220601-RX302880R)、大鼠腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒(TNF-α,批號(hào):20220601-RX302058R),均購自泉州市睿信生物科技有限公司。乙腈、甲酸、甲醇(色譜純,天津大茂化學(xué)制劑廠),95%乙醇,乙酸乙酯,石油醚,正丁醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠),水為超純水。

1.3 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司),XS205DU型十萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),CP513型電子分析天平(奧豪斯儀器常州有限公司),DHG-9070B型智能電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國墨克生命科學(xué)公司),SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),SB-5200DTD型超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司),HH-s4型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(江蘇正基儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的作用機(jī)制與“構(gòu)-效”預(yù)測

2.1.1紅芪活性成分的篩選 以TCMSP線上數(shù)據(jù)庫篩選紅芪化學(xué)成分。以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件。篩選得到美迪紫檀素、毛蕊異黃酮、芒柄花素等14個(gè)成分,由于所得成分中具有代表性的成分不多,因此查閱文獻(xiàn)篩選近年學(xué)者研究較多的成分,另加入紅芪所含的金雀異黃酮、毛蕊異黃酮苷等13種成分,共27種成分(如Tab 1所示),使得基礎(chǔ)分析對(duì)象的數(shù)據(jù)能盡可能全面并接近原中藥功效的整體性和真實(shí)性。

2.1.2紅芪對(duì)放化療引起的靶器官損傷保護(hù)作用靶點(diǎn)的獲取 基于“2.1.1”得到的化合物利用Uniprot線上數(shù)據(jù)庫和SwissTarget Prediction在線平臺(tái)預(yù)測紅芪活性成分靶點(diǎn)324個(gè);在人類基因數(shù)據(jù)庫(Gene Cards)和比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(CTD)兩個(gè)平臺(tái),以“Target organ damage caused by radiotherapy and chemotherapy”為檢索詞,獲得放化療引起的靶器官損傷的疾病靶點(diǎn)2 069個(gè),對(duì)活性成分和疾病預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行映射取其交集,篩選得到紅芪對(duì)放化療引起的靶器官損傷保護(hù)作用的潛在靶點(diǎn)177個(gè)。

Tab 1 Main active components of Radix Hedysari screened out

2.1.3“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“2.1.1”所得27種成分及“2.1.2”所得177個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以探究紅芪抗放化療引起的靶器官損傷的藥效作用機(jī)制。如Fig 1所示,紅色代表化合物,紫色代表靶點(diǎn),分為3圈,由里到外分別代表可被1種化合物調(diào)控(103)、可被2-3種調(diào)控(44)、可被4種以上調(diào)控(26)。按照degree值≥20的化合物有4種,分別為槲皮素(105)、熊果酸(44)、芒柄花素(24)、柚皮素(22),分別可調(diào)控145、43、23、21個(gè)靶點(diǎn),可作為重點(diǎn)化合物。

2.1.4PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將“2.1.2”所得177個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫對(duì)其潛在靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作,選擇最高置信度0.900,得到初級(jí)互作網(wǎng)絡(luò)并以Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｒ訢egree進(jìn)行分析,以網(wǎng)絡(luò)參數(shù)中心性、接近中心度、中介中心度3種條件進(jìn)行限定和篩選,得到起調(diào)控作用的8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)(TP53、MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、HSP90AA1、TNF、ESR1)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖如Fig 2所示,黑色框中綠色圓形節(jié)點(diǎn)為紅芪-放化療引起的靶器官損傷預(yù)測靶點(diǎn),三角符號(hào)為Degree>15所得節(jié)點(diǎn),藍(lán)色框中棱形節(jié)點(diǎn)為betweeness>0.042所得節(jié)點(diǎn),綠色框中V形節(jié)點(diǎn)為closeness>0.340所得關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),靶點(diǎn)信息見Tab 2。

Tab 2 PPI core target information

2.1.5 生物信息學(xué)分析將“2.1.2”篩選所得177個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Omicshare平臺(tái)進(jìn)行KEGG和GO分析。

2.1.5.1 基因本體(GO)分析 GO分析得到(Pvalue<0.01)184個(gè)細(xì)胞組分(CC),紅芪抗放化療引起的靶器官損傷靶點(diǎn)基因在細(xì)胞組分(CC)層面與膜區(qū)域、膜微區(qū)、膜筏、細(xì)胞質(zhì)部分有最顯著相關(guān);而在312個(gè)分子生物學(xué)功能(MF)層面最顯著表現(xiàn)的是信號(hào)受體結(jié)合活性和酶結(jié)合活性,其次為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性;參與了3 182個(gè)生物過程(BP)富集到最主要的途徑為對(duì)化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)含氧化合物響應(yīng),見Tab 3。

2.1.5.2 京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 KEGG分析得到(Pvalue<0.01)150條通路,Fig 3展示了前20個(gè)顯著差異通路,一級(jí)分類有4種:環(huán)境信息加工分類、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病分類。前3種分類各自僅一條通路排入前20,可作為重點(diǎn)通路:腫瘤壞死因子信號(hào)通路(ko04668)、細(xì)胞衰老(ko04218)、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路(ko04657),第4種則有17條富集通路,其中膀胱癌(ko05219)Rich Factor值最大,Pvalue值最小,可作為此類重要的通路。四類一級(jí)分類相較而言,人類疾病分類在紅芪抗放化療引起的靶器官損傷的通路中更重要些,其次為生物體系統(tǒng)分類和環(huán)境信息加工分類。

Fig 1 Diagram of “herbs, components and targets”

Fig 2 PPI network diagram

2.1.6“活性成分-靶點(diǎn)”的分子對(duì)接驗(yàn)證 以“2.1.4”所得8種核心靶點(diǎn)基因作為受體;以“2.1.3”所得4種重點(diǎn)活性成分作為配體。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)唯一且穩(wěn)定的條目識(shí)別符(Entry號(hào)),輸入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(RCSB PDB),以pdb格式導(dǎo)出選擇分辨率(refinement resolution ?)分辨率最好的且自帶小分子配體的結(jié)晶復(fù)合物;由TCMSP數(shù)據(jù)庫和ChemBio3D Ultra 14.0軟件得到活性成分3D分子結(jié)構(gòu),分別進(jìn)行分子對(duì)接獲得親和力分析,以結(jié)合能≤-5.0 kJ·mol-1作為篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)其進(jìn)行最低能量的計(jì)算和結(jié)構(gòu)的優(yōu)化,獲得穩(wěn)定的分子構(gòu)象。并利用Pymol和AutoDockTools-1.5.6處理配體和受體,以Vina進(jìn)行運(yùn)算對(duì)接,對(duì)比其親和力大小和構(gòu)象的合理性,獲得最佳受體蛋白和配體分子,利用Pymol和Ligplot軟件進(jìn)行可視化。

對(duì)接結(jié)果顯示,與槲皮素具有高親和力的為HSP90AA1(6tn5蛋白受體),與熊果酸具有高親和力的為TP53(3d06蛋白受體),與芒柄花素具有高親和力的為HSP90AA1(6tn5蛋白受體),與柚皮素具有高親和力的為MAPK3(9qtb蛋白受體),見Tab 4。

Fig 4各化合物分子對(duì)接分析結(jié)果顯示,分子均位于蛋白的活性空腔內(nèi),且兩者均有較好的匹配,為紅芪中這4種化合物與蛋白受體間的相互作用提供了基礎(chǔ)。相互作用2D圖中4種成分分別與周圍的蛋白質(zhì)殘基形成的氫鍵作用力(綠色虛線)和疏水作用力(紅色半弧形),各化合物與周圍氨基酸殘基結(jié)合緊密,存在著明顯的作用力,這些結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)的存在,增強(qiáng)了化合物與靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用,使化合物和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)對(duì)接形成穩(wěn)定構(gòu)象,有助于與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合。

2.2 “構(gòu)-效-量”關(guān)系驗(yàn)證

2.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1.1分組造模及給藥 分組:以苦味酸對(duì)大鼠進(jìn)行順序編號(hào),隨機(jī)分為7組,每組6只。包括正常組(normal group,NG)、模型組(model Group,MG)、對(duì)照組(control group,CG)、藥物組:(水提物低劑量組(water extract group-L,WEG-L)、水提物中劑量組(water extract group-M,WEG-M)、水提物高劑量組(water extract group-H,WEG-H)。

Tab 4 Molecular docking affinity table of main active components of Hedysari Radix and key targets

Fig 4 Results of molecular docking analysis

造模給藥:除正常組外均以1 mg·kg-1順鉑腹腔注射,連續(xù)7 d,進(jìn)行造模,正常組:每只灌胃0.9%氯化鈉溶液1 mL/100 g灌胃,連續(xù)7 d;對(duì)照組:貞芪扶正顆粒0.54 g·kg-1連續(xù)7 d灌胃給藥;藥物組:按照大鼠體質(zhì)量連續(xù)7 d灌胃給藥(水提物低劑量組1.35 g·kg-1,水提物中劑量組2.7 g·kg-1,水提物高劑量組5.4 g·kg-1,均按生藥量計(jì)算)。

(注:給藥按體表面積折算,人的臨床劑量與大鼠的等效劑量的比值為0.018。成人體質(zhì)量70 kg,大鼠體質(zhì)量0.2 kg)

大鼠劑量=30 g/70 kg×70 kg×0.018/0.2 kg=2.7 g·kg-1

2.2.1.2 體質(zhì)量及進(jìn)食量監(jiān)測 從d 1起,每日定量給食100 g,并于每日相同時(shí)間對(duì)各鼠進(jìn)行稱體質(zhì)量,以便從外部觀測其體質(zhì)量及進(jìn)食量變化。Fig 5顯示,除正常組外進(jìn)食量均逐漸降低,模型組比較其他組進(jìn)食量最低。體質(zhì)量均呈現(xiàn)先升高后降低的情況,模型組的體質(zhì)量自d 2起降低幅度最大。

Fig 5 Weight and water intake of rats with Hedysarum rubrum

如Fig 6所示,各因子模型組含量均明顯增加或降低(P<0.01),對(duì)照組與模型組相比各因子含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),Fig 6A顯示與模型組相比VIP和MTL含量均明顯升高(P<0.01),肝因子AST和ALT以及腎因子Cr和BUN均出現(xiàn)明顯的降低(P<0.01或P<0.05)如Fig 6B,C,如Fig 6D所示,抑炎因子IL-10回升,促炎TNF-α下降(P<0.05)。

2.2.2主要成分的含量測定

Fig 6 Effect of Radix Hedysari on contents of various factors in serum of rats with target organ injury caused by

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱:大連依利特SinoChrom ODS-AP(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25℃;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B);梯度洗脫(0～15 min,17%～33% A;15～20 min,33%～34% A;20～24 min,34%～37% A;24～27 min,37%～38% A;27～30 min,38%～40% A;30～35 min,40%～43% A;35～45 min,43%～90% A);流速為0.6 mL·min-1;檢測波長:260 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 稱取紅芪飲片100 g,加10倍量水,回流兩次,分別2.0 h和1.5 h,合并兩次濾液并濃縮、干燥至恒重。精密稱取上述水提物0.250 0 g,置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解,定容,即得。

2.2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取各對(duì)照品適量,加甲醇分別制成一定濃度的母液,后分別量取一定體積混合,配制成每1 mL含0.024 0 mg毛蕊異黃酮苷、0.028 8 mg刺芒柄花苷、0.024 0 mg毛蕊異黃酮、0.024 0 mg槲皮素、0.025 2 mg金雀異黃酮、0.024 0 mg異甘草素、0.026 4 mg芒柄花素、0.027 6 mg美迪紫檀素的混合對(duì)照品溶液,即得。

2.2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.2.4.1 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液,用甲醇稀釋成系列不同濃度,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以濃度(g·L-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),考察各成分的線性關(guān)系,結(jié)果表明各成分線性關(guān)系良好,具體見Tab 5。

2.2.2.4.2 精密度 精密吸取同一對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄各成分峰面積,分別計(jì)算RSD值,結(jié)果顯示6次檢測結(jié)果各成分相對(duì)峰面積的RSD均小于1.0%,表明儀器精密度良好。

2.2.2.4.3 重復(fù)性 精密吸取紅芪供試品溶液,平行制備6份樣品,進(jìn)樣測定,記錄各成分的峰面積,分別計(jì)算RSD值,結(jié)果顯示6份樣品中各成分相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%,表明各成分在此方法下的重復(fù)性良好。

Fig 7 Chromatogram

Tab 5 Results of linear relationship test of eight active components in Radix Hedysari

2.2.2.4.4 穩(wěn)定性 精密吸取紅芪供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄各成分的峰面積,結(jié)果顯示各成分6個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測的相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%,表明各成分在24 h內(nèi)均穩(wěn)定性良好。

2.2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知成分含量的紅芪供試品9份,每份約25 mg,按低、中、高3組分別精密加入各對(duì)照品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,計(jì)算加樣回收率及RSD,結(jié)果顯示毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、金雀異黃酮、異甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素的平均回收率依次為97.80%、101.15%、100.19%、100.69%、103.01%、102.58%、97.51%、99.05%,RSD值依次為0.43%、0.29%、0.42%、0.37%、0.27%、0.88%、0.40%、0.56%。

2.2.2.5 樣品含量測定 稱取紅芪水提物,并按照“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.2.2.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測定,分別計(jì)算紅芪中8個(gè)活性成分的含量。

結(jié)果顯示,芒柄花苷含量最高,達(dá)到2.743 5 μg·g-1,毛蕊異黃酮苷含量第二(2.449 0 μg·g-1),而二者的苷元含量分別為芒柄花素(1.038 6 μg·g-1)、毛蕊異黃酮(1.270 3 μg·g-1),其他成分含量為美迪紫檀素(1.587 2 μg·g-1)、異甘草素(1.103 2 μg·g-1)、金雀異黃酮(0.715 9 μg·g-1)、槲皮素(0.618 5 μg·g-1)。

Fig 8 Content of different components of Radix Hedysari

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出4種抗放化療所致靶器官損傷的有效活性成分和相應(yīng)的8個(gè)靶點(diǎn)及4條重要信號(hào)通路。在此基礎(chǔ)上將篩選出的4種化學(xué)成分與8個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果表明槲皮素與HSP90AA1,熊果酸與TP53,芒柄花素與HSP90AA1,柚皮素與MAPK3具有較好的結(jié)合活性,這提示HSP90AA1、TP53、MAPK3可能為紅芪抗放化療所致靶器官損傷的重要靶點(diǎn)。HSP90AA1為14號(hào)染色體的基因,該基因編碼的蛋白質(zhì)是可誘導(dǎo)的分子伴侶,能維持和調(diào)節(jié)特定靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的完整性從而調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖與凋亡。馮茵怡等[6]研究表明,通過調(diào)控HSP90AA1靶點(diǎn)介導(dǎo)信號(hào)通路可發(fā)揮抗纖維化作用。TP53為17號(hào)染色體的基因,由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子,其控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng),DNA損傷時(shí),TP53被激活,從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復(fù)或代謝改變。齊振強(qiáng)等[7]研究表明,上調(diào)TP53蛋白表達(dá)可對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞缺血損傷具有顯著保護(hù)作用。MAPK3為絲裂原活化蛋白激酶3,參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生、胞吞作用、細(xì)胞遷移、染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)MAPK3表達(dá)的下調(diào)在炎性腸病相關(guān)的結(jié)直腸癌中發(fā)揮著重要的作用。

本研究對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析,以探尋紅芪抗放化療所致靶器官損傷所調(diào)控的重要信號(hào)通路及其作用機(jī)制,結(jié)果顯示膀胱癌信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞衰老、IL-17信號(hào)通路等與其保護(hù)作用密切相關(guān)。四條重點(diǎn)通路中,膀胱癌通路中腫瘤通常以p53和RB通路的改變?yōu)樘卣?這些通路通常通過與Ras-絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(MAPK)相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[8]。IL-17信號(hào)通路由IL-17A-F組成的細(xì)胞因子通路集合,IL-17家族是細(xì)胞因子的一個(gè)新分類亞群,在急性和慢性炎性反應(yīng)中均起關(guān)鍵作用[9]。TNF信號(hào)通路中主要的靶點(diǎn)為TNFR1和TNFR2,研究發(fā)現(xiàn)TNF通過這兩種跨膜受體發(fā)揮生物效應(yīng)。TNFR1在幾乎所有類型的細(xì)胞上都表達(dá)[10],是主要負(fù)責(zé)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的TNF受體。

分子對(duì)接顯示4種化合物與蛋白受體之間均有較好的匹配,相互作用分析表明兩者可形成較穩(wěn)定的氫鍵和產(chǎn)生較有利的疏水作用。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可改善胃潰瘍并可調(diào)控肝自噬[11],可通過抑制MAPK途徑改善缺血/再灌注損傷的傷口愈合過程[12];芒柄花素為紅芪的主要活性成分之一,對(duì)順鉑所致以及膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷具有一定保護(hù)作用[13],可減少小腸黏膜損傷[14];另有研究表明,柚皮素可以降低血管炎性、抑制肝纖維化[15]、改善腎損傷;熊果酸被發(fā)現(xiàn)可通過抑制NOX4/ROS和RhoA/ROCK1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)肝纖維化[16]并可通過通過誘導(dǎo)自噬治療急性腎損傷發(fā)揮抗炎活性[17]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,紅芪水提取物可提升順鉑所致的胃腸損傷因子VIP和MLT的表達(dá)水平,可降低腎損傷因子Cr和BUN以及肝損傷因子AST和ALT的表達(dá)水平,提示紅芪對(duì)順鉑所致的靶器官損傷具有一定的保護(hù)作用且存在劑量依賴,其中高劑量組各因子改善效果更明顯。此外抑炎因子IL-10和促炎因子TNF-α的表達(dá)水平有所改善,表明紅芪水提物對(duì)于順鉑所致的機(jī)體炎性損傷有所修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)建立了8種黃酮類成分同時(shí)測定的含量測定方法,結(jié)果表明芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素含量較高。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果顯示芒柄花素在調(diào)控紅芪抗放化療所致靶器官損傷的過程中起重要作用。其原因可能是黃酮苷類化合物進(jìn)入人體會(huì)被腸道微生物所產(chǎn)生的酶分解為相對(duì)應(yīng)的苷元而發(fā)揮作用[18],故推測紅芪抗放化療所致靶器官損傷的真正效用計(jì)量應(yīng)以芒柄花苷和芒柄花素合計(jì),這與生物體內(nèi)苷和苷元的相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。

本研究建立了紅芪成分的“構(gòu)”與其對(duì)放化療所致靶器官保護(hù)的“效”之間的關(guān)系,初步探討闡明了紅芪通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)放化療引起的靶器官損傷保護(hù)作用的可能性分子機(jī)制:芒柄花素、槲皮素、熊果酸、柚皮素等活性成分作用于TP53、HSP90AA1、MAPK3等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)膀胱癌、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞衰老、IL-17信號(hào)通路等多條通路發(fā)揮作用,同時(shí)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)“效”進(jìn)行協(xié)同驗(yàn)證,并利用HPLC法對(duì)其活性成分的“量”進(jìn)行測定,構(gòu)建了紅芪對(duì)靶器官保護(hù)的“構(gòu)-效-量”關(guān)系,以期為紅芪抗放化療所致靶器官損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。